专利名称：Il-6r基因snp位点的用途的制作方法类风湿关节炎(RA)是以对称性、多关节、小关节病变为主的慢性全身性自身免疫性疾病，以关节滑膜炎为主要病理特征。作为一种常见的，慢性的，系统炎症性自身免疫性疾病，其发病率约为0. 4% 左右，80%患者发病年龄在20 45岁，男女之比为 1 2.4。类风湿关节炎发展至晚期可致关节强直和畸形，功能严重受损甚至残废，严重影响了患者的生活质量，因此该疾病每年给社会造成巨大的财力物力损失。类风湿性关节炎与环境、细菌、病毒、遗传、性激素及精神状态等因素密切相关。单核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphism, SNP)是指存在于某一(些) 群体、正常个体的基因组DNA中单碱基的序列差异，并且在人群中的分布频率至少要在以上(Brookes AJ. Gene，1999，234 (2) 177-186)，人类遗传基因的多态性在遗传信息上的本质表现，90%以上是由SNP所引起的。因为其多态信息量大，目前已成为继限制性片段长度多态性(RFLP)标志和微卫星即短串联重复(STR)标志后的第三代遗传标志。从基础医学到临床医学的各个领域，SNP都存在巨大的应用价值。SNP的研究为基因诊断，尤其是疾病的早期诊断提供更多依据有重要意义。SNP由于其分布广、密度高而被期望在诸如癌症、糖尿病、高血压、忧郁症和哮喘等复杂疾病的研究中起重要作用，这些复杂疾病是多个遗传变异位点与环境因子共同作用的结果，由于发病原因复杂，涉及的基因数量多，已成为国际上疾病基因组学研究的重点。目前已有实验将SNP应用于肿瘤预后及易感性的判断，例如肺癌致癌物的易感性存在个体差异，即肺癌的基因易感性，研究较多的是代谢酶基因多态性，如人细胞色素P450-CYP450和髓过氧化酶MPO等。法国研究者证实，MPO基因启动子(463G/A)多态性导致该基因较低的表达，可以降低肺癌患病的危险性 (Chewier I，Stucker 1，Houllier AM，et al. pharmacogenetics，2003，13(2) :729-739)。 日本学者发现了 HER-2基因编码区的一个SNP与胃癌的发展及恶性程度有关(Kuraoka K， Matsumura S, Hamai Y,et al. Int J Cancer,2003,107(4) :593-596)。
本发明所要解决的技术问题是为类风湿关节炎易感性的诊断或类风湿关节炎药物的个体化治疗提供一种解决方法。为此，本发明公开了 IL-6R基因SNP位点在制备诊断类风湿关节炎易感性的检测试剂盒中的用途。在一些实施例中，所述IL-6R基因SNP位点为IL-6R基因-183A/G(rs4845617)和 D358A/C (rs2228145)。本领域技术人员将能通过能够检测SNP位点的任何方法或技术在个体的核酸中进行在本文所公开的一个或几个SNP标记上存在的核苷酸的分析。例如，一个人能用本发明所述的方法通过进行Taqman法、质谱法、DNA微阵列法、测序法、微测序、杂交、限制性片段分析、寡核苷酸连接检测、等位基因特异性PCR-HRM或联合应用上述方法检测SNP位点生物标记。当然，这一列表仅是示例性的，并且绝不用于限制本发明。本领域技术人员可使用任何合适的方法来实现这种检测。本发明第二方面公开了 IL-6R基因SNP位点单倍型或IL-6R和IL-6基因SNP位点单倍型在制备诊断类风湿关节炎易感性的检测试剂盒中的用途。正如本领域所熟知，“单倍型”是指遗传标记的任何组合。单倍型能包含两个或更多的等位基因。发现本文所述的单倍型(或“风险单倍型”)在具有患类风湿关节炎风险的个体中比在健康个体中更频繁和更显著。因此，这些单倍型对于检测类风湿关节炎风险，或者个体对于类风湿关节炎的敏感性具有预测价值。“风险单倍型”因此旨在包括本文所述的与类风湿关节炎高度相关和显著相关的标记上的一种单倍型或单倍型组合。本领域技术人员能通过本领域所熟知的检测SNP位点的序列的方法来进行单倍型的检测。在一些实施例中，IL-6R基因SNP位点单倍型为IL-6R基因SNP位点rs4845617和 rs2228145单倍型，为G_A、A-A或G-C单倍型。其中G-A单倍型增加RA患病风险，A-A和G-C单倍型降低RA患病风险。IL-6R和IL-6基因SNP位点单倍型为IL-6和IL-6R两个基因的五个SNP位点 IL-6-rsl800796/rsl800797/rsl800795/IL-6R-rs4845617/IL-6R-rs2228145 单倍组合，为 C-G-G-G-A、G-G-G-A-C、G-G-G-G-A, C-G-G-A-C, G-G-G-A-A 或 G-G-G-G-C 单倍组合；其中 C-G-G-G-A、G-G-G-A-C 和 G-G-G-G-A 单倍组合增加 RA 患病风险；C-G-G-A-C、G-G-G-A_A 和 G-G-G-G-C单倍组合降低RA患病风险。在一些实施例中，所述检测试剂盒在人类受试者中进行类风湿关节炎的易感性评价和/或诊断和/或预测的体外方法中使用，其中所述试剂盒包含用于进行下列步骤的适当的工具a)评价至少一种与所述的人类受试者的基因组DNA样品中的IL-6R基因SNP位点的类型和/或水平；和b)将所述的人类受试者的在a)中评价的生物标记数据与健康的和/或患病的人的生物标记数据进行比较，来做出所述的人类受试者的类风湿关节炎的风险评价和/或诊断和/或预测。在一些实施例中，所述试剂盒在鉴定人类受试者中的与类风湿关节炎易感性相关的SNP单倍型的体外方法中使用，所述试剂盒包含用于进行下列步骤的适当的工具a)检测所述的人类受试者的核酸样品中的IL-6R基因或IL-6R和IL-6基因的至少一种SNP，其中所述至少一种SNP预示着类风湿关节炎的易感性；和b)鉴定所述的人类受试者的SNP单倍型，其中所述SNP单倍型包含所述在a)中检测的所述至少一种SNP。 术语“检测试剂盒”和“试剂盒”是同义词并可互换使用。 在本发明的上下文中，当是指检测试剂盒时，术语“适当的工具”是指任何用于达到所指明的目的的任何技术手段。作为这种适当的工具的非限制性例子，能列举试剂和/或材料和/或流程和/或说明书和/或软件等。本发明所述的所有试剂盒可包含适当的包装和说明书用于在本文所公开的方法中使用。试剂盒可进一步包含适当的缓冲液和聚合酶，如耐热聚合酶，例如Taq聚合酶。这种试剂盒也包含对照引物和/或探针。根据优选的，本发明所述的检测试剂盒，包括基因组DNA抽提试剂、PCR反应体系试剂和HRM荧光染料试剂，所述PCR反应体系包括dNTP、MgCl2、Taq DNA 聚合酶、PCR反应缓冲液和引物，其特征在于所述引物为分别针对IL-6R基因SNP位点 rs4845617 和 rs2228145 的引物对，或分别针对 IL-6 基因 SNP 位点 rsl800796、rsl800797 和rsl800795的引物对。在可检测出SNP位点的前提下，HRM荧光染料试剂可被Taqman法、 质谱法、DNA微阵列法、测序法、微测序等试剂替换。在一些实施例中，针对IL-6R基因SNP位点rs4845617的引物对的核酸序列如SEQ ID No. 1 2所示，针对IL-6R基因SNP位点rs2228145的引物对的核酸序列如SEQ ID No. 3 4所示；针对IL-6基因SNP位点rsl800796的引物对的核酸序列如SEQ ID No. 5 6所示，针对IL-6基因SNP位点rsl800797的引物对的核酸序列如SEQ ID No. 7 8所示， 针对IL-6基因SNP位点rsl800795的引物对的核酸序列如SEQ ID No. 9 10所示。在一些实施例中，所述Taq DNA聚合酶优选为热启动PCR聚合酶，其中最优选为 realstart Si。在一些实施例中，所述HRM荧光染料为Eva Green、Syto9、Resolight和 SupperGreen 中之一。另一方面，本发明公开了一种类风湿性关节炎易感性的检测方法，包括下列步骤a)基因组DNA的抽提；b) PCR 检测PCR 反应体系包含 10 30ng 基因组 DNA，1 X PCR Buffer, 0. 25U Taq DNA聚合酶，0. 2mM dNTP，0. 3 μ M上下游引物，1 XHRM荧光染料，Mg2+浓度根据HRM荧光染料的种类不同变化；PCR扩增条件为预变性95°C 2min，变性94°C lOsec，退火延伸60°C 30sec, 共30-40个循环；c) HRM检测条件为96°C 30sec,50°C 30sec，熔解曲线数据收集从83°C到90°C，温度上升率0. 05 0C /s ；d)基因分型依据熔解曲线峰型的改变进行基因分型；其中所述上下游引物为分别针对IL-6R基因SNP位点rs4845617和rs22^145的引物对，和/或分别针对IL-6基因SNP位点rsl800796、rsl800797和rsl800795的引物对。在一些实施例中，所述Taq DNA聚合酶优选为热启动PCR聚合酶，其中最优选为 realstart在一些实施例中，所述HRM荧光染料为Eva Green, Syto9, Resolight和 SupperGreen 中之一，其中优选为 Eva Green。在一些实施例中，所述HRM荧光染料为Eva Green时，PCR反应体系中Mg2+浓度>1.5mM，其中优选为2. 5mM或3. OmM ;在一些实施例中，所述HRM荧光染料为Lc Green时，PCR反应体系中Mg2+浓度2.5 3. OmM，其中优选为2. 5mM ；在一些实施例中，所述HRM荧光染料为SupperGreen时，PCR反应体系中Mg2+浓度 1. 5 3. OmM，其中优选为1. 5mM ；此外，本文所公开的SNP和单倍型可对患者分层(Stratification)。鉴定为发生类风湿性关节炎的风险增加或降低的个体的亚群能被用于，尤其是，用于定向临床试验项目和遗传药理学治疗，其中对于多态性的了解用于帮助鉴定最适合用特定药物制剂进行治疗的患者。本发明的优点为本发明首次发现位于IL-6R基因SNP位点rs4845617和 rs2228145与类风湿性关节炎相关。因此在此基础上提出一种通过SNP来检测类风湿性关节炎易感风险性的方法和试剂盒，并且经临床实验研究验证，本检测方法具有可行性，本发明的检测试剂盒具有良好灵敏性、稳定性和特异性。本发明的试剂盒对正常人群进行类风湿性关节炎易感性的筛查，能有效起到风险预警、早期诊断的作用。


图1为退火温度的优化凝胶电泳图。

Rotor-Gene 6000 荧光定量 PCR 仪 Corbett (澳大利亚)；Lightcycler 1. 5 荧光定量PCR仪Roche (瑞士)；黑金刚梯度PCR仪北京东胜创新；QuickGene-Mini80核酸提取仪 Fujifilm(日本)；Centrifuge 5似4 台式高速离心机 Eppendorf (德国)；PE_2400PCR 仪PE (美国)；2F-258全自动凝胶成像系统上海嘉鹏；微量核酸电泳系统Bio-Rad(美国)； Nanodrop 2000微量核酸蛋白检测仪；Thermal scientific (美国)实施例IPCR-HRM检测体系1. 1基因组DNA的提取(参考试剂盒说明书)1.2引物设计与合成选择IL-6基因1086-597G > A (rsl800797)进行PCR-HRM检测体系的建立。通过美国国家医学图书馆Pubmed引擎(http//www. ncbi.nlm.nih. gov/sites/snp)检索到其侧翼序列，在线软件 Primer3 (http://frodo.wi.mit. edu/primer3)进行引物设计。IL-6 基因引物TGGCAAAAAGGAGTCACACA/CTGTGAGCGGCTGTTGTAGA ；通过 UCSC-PCR(http://genome. ucsc.edu)验证其特异性后交南京金斯特公司合成，引物浓度调整到20 μ M-20°C保存。另合成IL-6基因-597G > A位点突变基因(长度96bp)作为阳性对照。1. 3检测体系酶系统的选择酶系统分别以不同生物技术公司出售的Taq酶和hot Start Taq酶进行常规PCR 反应，以Biotium公司生产的HRM专用试剂盒Eva Green Master Mix作为对照进行比对， 在扩增效率好，特异性高的基础上，选择成本较低酶系统。1. 4检测体系荧光染料的选择PCR荧光染料的选择是在PCR扩增体系酶系统确定的基础上进行选择，判断依据是PCR扩增效率(观察荧光扩增曲线的陡度和S曲线)、PCR产物的特异性(观察熔解曲线和熔解峰并进行琼脂糖凝胶电泳验证)。1. 5检测体系PCR扩增条件的优化A. Mg2+ 的优化Mg2+浓度从1. 5mmol/L(mM)开始到4. OmM,每个梯度增加0. 5mM,共有六个梯度即 1. 5mM、2. OmM,2. 5mM、3. OmM,3. 5mM和4. OmM。最适Mg2+浓度依据PCR扩增效率和产物的特异性进行确定。B.退火温度的优化退火温度从开始，每次增加1°C，依据PCR扩增效率和产物特异性进行确定。C.引物浓度的优化引物浓度从0. 2-0. 9 μ M选择三个点进行优化，一旦出现扩增效率低，就需要进行上下游引物比例的调整。D.模板上样量的优化按照模板不超过总体积1/10的原则，选择0. 5-1. O μ L进行优化，选择扩增效率最佳的模板浓度。必要时可稀释模板。Ε. PCR扩增条件的优化首先进行两步法和三步法的选择，再依据扩增效率、产物特异性、产物熔解温度和 GC含量进行优化，必要时加入Enhancer。1. 6检测体系HRM熔解条件的优化
7
PCR后直接进入HRM。在第一次扩增后进行普通熔解曲线(Melting :70 95°C )， 判断PCR产物Tm的范围，以士3°C确定HRM的高分辨熔解范围；第二次根据PCR产物高分辨熔角军产生的杂合峰调 HRM 条件(first hold temperature :10 120second，second hold temperature 30 60second，HRM :Tm_3°C Tm+3°C )，最后确定 HRM 条件。1. 7PCR-HRM检测体系的确定与验证A.特异性PCR扩增产物的特异性通过溶解曲线峰的单一性、琼脂糖电泳和测序进行判断。B.批内重复性同一标本在同一批检测中重复检测5-10次，依据标准化熔解曲线的重合度以及 Tm值的变异来判断。(最终以能否正确进行基因分型为标准)C.批间重复性(再现性)同一标本在不同批次检测中重复检测3次以上，依据标准化熔解曲线和熔解分型的相似程度来判断。(最终以能否正确进行基因分型为标准)D.测序验证将PCR产物送上海生工生物技术公司测序，测序结果应用Chromas软件分析。结果1、酶系统以biotium的Eva Green Master Mix作为参照，与天根生物技术公司的普通Taq 酶进行比对，发现尽管天根Taq酶扩增效率高，但其PCR产物特异性不如EvaGreen Mix,而且存在引物二聚体。说明在进行PCR-HRM时，最好选择热启动酶，以保证PCR产物的均一性。热启动酶realstart在扩增效率、PCR产物的特异性和产量方面都优于 Truestart,而后者无论在哪一方面都是低效，不能很好的与EvaGreen染料匹配。相对而言，Realstart热启动酶与EvaGreen荧光染料匹配扩增效率、PCR产物特异性如上图所示，基本一致，但价格方面要低于EvaGreen Mix，所以将Realstart酶系统与 EvaGreen匹配组合成PCR-HRM检测系统是最佳选择。2、荧光染料三种荧光染料EvaGreen、Supper Green和Lc Green与realstart酶系统结合进行PCR-HRM，就其检测效能而言，都能达到HRM技术的检测要求，但三种染料的检测分辨率依次增强，价格也是依次升高。所以同等条件下，Eva Green为最适选择。3、检测体系PCR扩增条件A. Mg2+ 的优化从扩增曲线和熔解曲线可以看出，荧光染料EvaGreen除1. 5mM的Mg2+不能扩增出产物外，其余浓度均能扩出PCR产物。其中2. 5mM和3. OmM的扩增效率、产物特异性和产量接近，处于最佳状态。从扩增曲线和熔解曲线可以看出，荧光染料Lc Green除2. OmM的Mg2+不能有效扩增出产物，2. 5mM的Mg2+扩增效率、产物特异性和产量均优于3. OmM的Mg2+，处于最佳状态。从扩增曲线和熔解曲线可以看出，荧光染料Supper Green除1. 5mM_3· OmM的Mg2+ 均能有效扩增出产物，但就扩增效率、产物特异性和产量三个方面综合考虑，1. 5mM的Mg2+ 处于最佳状态。
B.退火温度的优化从图1梯度PCR结果可以看出60°C时目的条带很亮，非特异带没有，仅见引物二聚体。同加入荧光染料进行熔解曲线分析60°C时熔解峰最高，说明此温度为最适退火温度。C.引物浓度的优化退火温度优化时的引物浓度是0. 5 μ M，出现引物二聚体，故上qPCR时调整到 0. 3 μ M，扩增效果极佳。D.模板上样量的优化从扩增曲线和PCR产物的特异性来看，IOng模板量是足够进行10 μ L体系的PCR反应。Ε. PCR扩增条件的优化PCR扩增条件为预变性 96°C 3min，变性 95°C 6sec，退火60°C 6sec，延伸 72°C 15sec 35个循环。4、检测体系HRM熔解条件通过不同的变性时间(holdl)和杂合退火时间(hold2)的摸索，发现变性时间大于30sec足以使PCR产物完全变性，除非PCR产物Tm值和产量均很高，适当地延长时间。杂合退火时间30seC足够形成容易辨认的杂合，提高温度虽然能形成更多的杂合，但杂合峰不易辨认。故最终以变性时间和杂合退火时间均为30sec作为首选。HRH的温度范围，在预实验时进行70-90°C的Melting寻找到PCR产物的Tm之后。5、PCR-HRM检测体系验证A.批内重复性以富士核酸提取试剂盒提取的1 号标本为例对新建PCR-HRM检测体系进行批内重复性试验(重复五次)，熔解曲线进行标准化后完全重合，说明重复性极好，相对百泰克试剂盒而言，重合度更高，因此分辨率也就更高。Tm值的均值80. 60士0. 049.B.批间重复性(再现性)以富士核酸提取盒提取的四个标本为例对新建的PCR-HRM检测体系进行批间重复性试验(重复三天)，熔解曲线的熔解峰型和标准化溶解曲线图形基本没有变化，基因分型结果完全一致。C.测序验证随机抽取三种基因分型样本每种各两例进行测序验证，结果与PCR-HRM技术基因
分型结果完全一致。由此，我们可以获得一种检测试剂盒，包括基因组DNA抽提试剂、PCR反应体系试剂和Eva Green荧光染料试剂，所述PCR反应体系包括dNTP、MgCl2, realstart酶、PCR反应缓冲液和针对SNP位点的特异性引物对。实施例22. 1基因组DNA的提取(参考试剂盒说明书)；2. 2引物设计与合成针对IL-I β 基因-511C>T、-31T>C 和+3954C>T 三个 SNP 位点，TNF 基因-863C > A和-857C > T两个SNP位点，TNFRl基因-383A > C和TNFR2基因T676G两个SNP位点，IL-6 基因-597G > A、-572 和-174G > C 三个 SNP 位点，IL-6R 基因-183 和 D358A 两个位点，IL-IRN C > T基因共13个位点应用第一章建立的PCR-HRM检测体系进行类风湿关节炎患者的基因多态性检测。通过美国国家医学图书馆Pubmed引擎(http://WWW. ncbi.nlm. nih. gov/sites/snp)检索到每个位点的侧翼序列，输入在线软件I^rimerf (http://frodo. wi. mit. edu/primer3)进行引物设计。通过UCSC-PCR(http://genome, ucsc. edu)验证其特异性后交上海生工生物技术公司合成，引物浓度调整到20μΜ-20 保存。各位点引物序列及PCR产物如下IL-1B-511染色体及位置2ql4位点多态性C/T(rsl6944)引物:P1 CCCAGCCAAGAAAGGTCAAT Tm :56. 7°C GC% :50P2 TGAGGGTGTGGGTCTCTACC Tm :59. 1°C GC% :60PCR 产物100bp Tm :85. 47°C GC% 54CCCAGCCAAGAAAGGTCAATtttctcctcagaggctcctgcaattgacagagagctcc :、，gaggcagagaacagcacccaaGGTAGAGACCCACACCCTCAIL-1B-31染色体及位置2ql4位点多态性T/C(rsll43627)引物P1 TTTCTCAGCCTCCTACTTCTGC Tm :60. 1°C GC% :50P2 CTTGTGCCTCGAAGAGGTTT Tm :57. 7°C GC% 50PCR 产物:86bp Tm :81. 57°C GC% :46. 5TTTCTCAGCCTCCTACTTCTGCttttgaaagcataaaaacagcgagggagaaactggcagataccAAACCTCTTCGAGGCACAAGIL-1B+3954染色体及位置2ql4位点多态性C/T(rsll436;34)引物P1 GGCCTGCCCTTCTGATTTTA Tm :58. 5°C GC% :50P2 CGTGCACATAAGCCTCGTTA Tm :58. 5°C GC% 50PCR 产物:95bp Tm :81. 11°C GC% :45. 3GGCCTGCCCTTCTGATTTTAtacctaaacaacatgtgctccacatttcagaacctatcttctt
gacacatgggaTAACGAGGCTTATGTGCACGTNF-863, -857染色体及位置6p21. 3位点多态性C/A(rsl800630)，C/T(rsl799724)引物:P1 AGACCTCTGGGGAGATGTGA Tm :53. 1°C GC% :55P2 CGTCCCCTGTATTCCATACC Tm :56. 9°C GC% 55PCR 产物159bp Tm :88. 92°C GC% :57. 9AGACCTCTGGGGAGATGTGAccacagcaatgggtaggagaatgtccagggctatggaagtcgagtatggggaccccc ； ι cttaa : ‘gaagacagggccatgtagagggccccagggagtgaaag
agcctccaggacctccaGGTATGGAATACAGGGGACGTNFR1-383染色体及位置12pl3. 2位点多态性A/C(rs2234649)引物P1CTTGGTGTTTGGTTGGGAGT Tm :57. 8°C GC% :50P2AGGAAGAGCTGGAGGAGGAG Tm :58. 0°C GC% 60PCR 产物:153bp Tm :89. 62 °C GC % :58. 2CTTGGTGTTTGGTTGGGAGTggtcggattggtgggttgggggcacaaggcagccagtctgggactcctgtgcttgtgactggactacaaagagttaaagaacgttgggcctcctcctcccgcctcctgtggcCTCCTCCTCCAGCTCTTCCTTNFR2 T676G染色体及位置1ρ36.3-p36. 2位点多态性G/T(rsl06l622)引物:P1 CTCCTCCTCCAGCTGTAACG Tm :59. 2°C GC% :60P2 GTGTTGGGATCGTGTGGAC Tm :54. 0°C GC% :57. 9PCR 产物:139bp Tm :90. 74°C GC% :61. 9CTCCTCCTCCAGCTGTAACGtggtggccatccctgggaatgcaagca ggatgcagtctgcacgtccacgtcccccacccggagtatggccccaggggcagtacacttaccccagccagtGTCCACACGATCCCAACACIL-6-597染色体及位置7p21位点多态性G/A(rsl800797)，引物:P1 TGGCAAAAAGGAGTCACACA Tm :54. 3°C GC% :45 (SEQ ID No. 7)P2 CTGTGAGCGGCTGTTGTAGA Tm 58. 0°C GC% 55 (SEQ ID No. 8)PCR 产物:96bp Tm :84. 98°C GC% :52. 1TGGCAAAAAGGAGTCACACActccacctggagacgccttgaagtaactgcacgaaatttgagg！λ , . tggcaggcagtTCTACAACAGCCGCTCACAGIL-6-572染色体及位置7p21位点多态性G/C(rsl800796)引物:P1 GAGACGCCTTGAAGTAAC Tm :56. 68°C GC% :50 (SEQ ID No. 5)P2 TGAGTTCTTCTGTGTTCTG Tm :55. 88°C GC% :42. 1 (SEQ ID No. 6)PCR 产物:93bp Tm :84. 79°C GC% :52. 7GAGACGCCTTGAAGTAACtgcacgaaatttgagg ;; tggccaggcagttctacaacagcc 丨人." ctcacagggagagcCAGAACACAGAAGAACTCAIL-6-174染色体及位置7p21位点多态性G/C(rsl800795)0182]引物:P1 GCCTCAATGACGACCTAAGC Tm :58. 4°C GC% :55 (SEQ ID No. 9)
0183]P2 GGGGCTGATTGGAAACCTTA Tm :58. 3°C GC% 50 (SEQ ID No. 10)
0184]PCR 产物IOlbp Tm :82. 88GC% :47. 5
0185]GCCTCAATGACGACCTAAGCtgcacttttcccctagttgtgtcttgccatgctaaaggac
0186]gtcacattgcacaatcttaaTAAGGTTTCCAATCAGCCCC
0187]IL-6R D358A
0188]染色体及位置lq21
0189]位点多态性A/C(rs2228145)
0190]引物P1 TCCTCCTATTCCTTTTTCTCCA Tm :55. 5°C GC% :40. 9 (SEQ ID No. 3)
0191]P2 GGAATGTGGGCAGTGGTACT Tm :58. 7°C GC% 55 (SEQ ID No. 4)
0192]PCR 产物103bp Tm :78. 51°C GC% :38. 8
0193]TCCTCCTATTCCTTTTTCTCCAtattctcctcttcctcctctatcttcaattttttttttaacct
0194]agtgcaag ； , ttcttcttcAGTACCACTGCCCACATTCC
0195]IL-6R-183
0196]染色体及位置1 q21.3
0197]位点多态性A/G(rs4845617)
0198]引物:P1 gcCGCTCTGAGTCATGTGCGAGTG Tm :60. 61°C GC% :59. 1 (SEQ ID No. 1)
0199]P2 GGCTCTCTACACACACTGCGAG Tm :59. 74°C GC % :59. 1 (SEQ ID No. 2)
0200]PCR 产物1 IObp Tm :84. 8°C GC% :68. 8
0201]CGCTCTGAGTCATGTGCGAGTGggaagtcgcactgacactgagccgg : .、、 ccagagggagagg
0202]agccgagcgcggcgcggggccgagggaCTCGCAGTGTGTGTAGAGAGCC
0203]IL-IRN
0204]染色体及位置2ql3
0205]位点多态性C/T(rs425l96l)
0206]引物:P1 CGTGTCATTCATGCTTCCGGTG Tm :59. 24°C GC% :54. 7
0207]P2 cCAGGTCTGCAGCCAACCAGTTGTG Tm :62. 79°C GC% :58. 3
0208]PCR 产物:139bp Tm :79. 38 °C GC % :52. 5
0209]CGTGTCATTCATGCTTCCGGTGagccctaagtctaagatagggcagatagcacaggtcca
0210]ttttgcagctgtcaaaatgaggtctgaagggcagaagtggtgtgcccacacacaCACAACTGGTT
0211]GGCTGCAGACCTG
0212]2. 3PCR-HRM技术检测基因多态性
0213]采用实施例1建立的PCR-HRM检测体系作为基础进行基因多态性检测，引物浓度为0. 3 μ M，反应体系12 μ L，金斯特Taq酶系统组成为0. 2U热启动酶，2. 5mM的Mg+，0. 2mM 的 dNTP，lXPCR Buffer, 20 X EvaGreen, 11 0. 5 μ L0 扩增条件为预变性 96°C 3min，变性 95°C 6sec，退火60°C 6sec，延伸72°C 15sec ；35个循环。EvaGreen Mix扩增条件为预变性 960C 3min，变性 96°C 6sec，退火 60°C 6sec，延伸 72°C 15sec35 个循环。高 GC 的 IL-6R-183 扩增条件为预变性96°C 3min，变性95°C lOsec，退火60°C lOsec，延伸72°C 15sec 35个循环。高分辨熔解选择HRM通道，按Rotor geneeOOO仪器默认条件进行。熔解温度范围按不同扩增子Tm士3°C确定。2. 4基因分型及测序验证基因分型依靠仪器分析软件HRM标准化图形，参考熔解图和扩增图进行判断，对不同类型熔解曲线的标本随机抽样2-3份进行测序验证，必要时双相测序或复查。2. 5统计学处理与分析将检测数据输入Spssl3. 0软件，并进行数据处理与统计分析。计算各SNP的基因型频率和基因频率以及单倍型和单倍组合，并应用在线分析软件SHEsisOittp:// analysis, bio-χ. cn/myAnalysis. php)与对照组进行病例-对照分析。此外，还进行性别分层分析。结果选取76例正常对照与病例组进行病理-对照关联分析，结果如下表1. 1 IL-IB和IL-1RN在病例组和对照组的基因分布比较


本发明属于生物医药技术领域，具体涉及IL-6R基因SNP位点的用途及其试剂盒和检查方法。IL-6R基因SNP位点在制备诊断类风湿关节炎易感性的检测试剂盒中的用途。本发明首次发现位于IL-6R基因SNP位点rs4845617和rs2228145与类风湿性关节炎相关。因此在此基础上提出一种通过SNP来检测类风湿性关节炎易感风险性的方法和试剂盒，并且经临床实验研究验证，本检测方法具有可行性，本发明的检测试剂盒具有良好灵敏性、稳定性和特异性。本发明的检测试剂盒可对正常人群进行类风湿性关节炎易感性的筛查，能有效起到风险预警、早期诊断的作用。