专利名称：制备六联体蛋白经遗传修饰的腺病毒的载体及其构建方法腺病毒的载体在基因治疗中具有广阔的应用前景，是目前基因治疗中最常用的病毒载体之一。腺病毒的衣壳蛋白主要有三种，分别为Hexon，Penton kise和fiber。腺病毒侵染细胞的过程如下首先，腺病毒的衣壳蛋白Fiber中Knob结构域与靶细胞表面的特异性的CAR受体结合，完成腺病毒对靶細胞的黏附过程；然后，腺病毒五邻体蛋白Penton base的R⑶肽段与靶细胞表面ανβ3或α νβ 5整合素结合，通过内吞作用将病毒内化至細胞后，病毒基因转运至細胞核，进而进行病毒基因的转录和表达。六联体蛋白(Hexon)是腺病毒衣壳蛋白中最为丰富的蛋白，其结构暴露于腺病毒表面，是宿主免疫原性的主要靶点。腺病毒在肿瘤基因治疗中有着广泛的应用，但是大多数肿瘤组织细胞表面CAR表达水平低、甚至不表达， 这严重影响了上述两个步骤的进行，使腺病毒对靶細胞的感染效率大大降低。六联体蛋白修饰后的腺病毒的载体，可以解决对靶細胞感染效率低的问题，但目前，已有的载体没有能够用于连接小肽的合适的酶切位点，没有用于筛选的报告基因，并且构建六联体蛋白修饰后的腺病毒的载体的方法比较复杂，比如通过同源重组的方法进行修饰，这些构建方法制备周期长，体外连接小肽的效率低，成本高，筛选阳性克隆的手段条件繁琐。
本发明所要解决的ー个技术问题在于克服目前制备六联体蛋白修饰后的腺病毒的载体的方法的缺点，提供一种制备六联体蛋白经遗传修饰的腺病毒的载体。本发明所要解决的另ー个技术问题在于提供一种简单、快速的制备六联体蛋白经遗传修饰的腺病毒的载体的构建方法。解决上述技术问题采用的技术方案是在El区携帯报告基因表达元件，将该表达元件插入Ad5腺病毒基因组352bp与33^bp之间；在Ad5腺病毒基因组六联体蛋白的高可变区5即在Ad5腺病毒基因组第19646bp处和第19685bp处分别引入两个单一的酶切位点， 在Ad5载体引入的两个单一酶切位点之间插入一个用于筛选的表达元件；在Ad5载体引入的两个单一酶切位点之间插入小肽序列。本发明的携帯的报告基因是绿色荧光蛋白、半乳糖苷酶基因、荧光素酶、红色荧光蛋白中的任意ー种。本发明的在腺病毒六联体蛋白的高可变区5分別引入两个单一的酶切位点是 BamHI、SfuI、SwaI 中任意两种。本发明的在Ad5载体的两个单一酶切位点之间插入ー个用于筛选的表达元件是用于蓝白斑筛选的半乳糖苷酶基因表达元件，在細菌中表达的用于筛选的荧光蛋白表达元件、氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素筛选基因中的任意ー种。本发明的在Ad5载体引入的两个单一酶切位点之间插入小肽序列是Tat PTD、 RGD、SIKVAV、NGR、RVG16、RVG29 中的任意ー种。上述的Tat PTD 的序列为GATCTGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGACCACAAGG, RGD 的序列为GATCTTGTGACTGCCGCGGAGACTGTTTCTGCGG，SIKVAV 的序列为GATCTTGTGACTGCAGTATTAAAGTTGCAGTCTGTTTCTGCGG，NGR 的序列为 GATCTTGTGACTGCAACGGACGCTGTTTCTGCGG，RVG 16 的序列为GATCTTGTGACATTTTTACCAATAGCAGAGGGAAGAGAGCATCCAACGGGAACGG,RVG29 的序列为GATCTTACACCATTTGGATGCCCGAGAATCCGAGACCAAGGACACCTTGTGACATTTTTACCAATAGCAGAGGGAAGAGAGCATCCAACGGGTT。上述的制备六联体蛋白经遗传修饰的腺病毒的载体的构建方法由下述步骤组成1、构建在El区携帯报告基因表达框的腺病毒质粒载体用聚合酶链式反应获得报告基因，将该片段克隆到腺病毒El穿梭载体(载体为 NCBI 基因库里已知的核酸序列，http //www, ncbi. nlm. nih. gov/nuccore/AF334399. 1) 中，获得的阳性质粒载体命名为pAd5CMV-R印orter-SV40pA-shuttle，将kal线性化的载体pAd5CMV-R印orter-SV40 pA-shuttle与ClaI线性化的载体pTG3602 (载体为已知的核酸序列，http://openwetware.org/wiki/PTG3602)共转化 BJ5183 (购买自 Stratagene 公司)，碱裂解法提取质粒经酶切及测序后获得的腺病毒质粒载体即为在El区携帯 CMV-R印orter-SV40pA表达框的腺病毒质粒载体，命名为pAd5CMV_R印orter。(2)构建引入单ー酶切位点1的腺病毒六联体蛋白高可变区5序列上游SOObp同源臂的质粒载体以腺病毒基因组DNA为模板，通过聚合酶链式反应扩增获得引入单ー酶切位点的六联体蛋白高可变区5序列的上游SOObp的DNA片段，设计聚合酶链式反应的引物，通过聚合酶链式反应，反应扩增产物经质量浓度为的琼脂糖凝胶电泳后回收片段；将回收的聚合酶链式反应产物分別与pGEMT-easy载体连接，经碱性裂解法提取质粒DNA，通过酶切及测序鉴定获得阳性克隆为引入单ー酶切位点1的腺病毒六联体蛋白的高可变区5序列上游800bp同源臂的质粒载体，命名为pGEMT/Hexon HR up-single enzymel。(3)构建引入单ー酶切位点2的腺病毒六联体蛋白高可变区5序列下游2300bp同源臂的质粒载体以腺病毒基因组DNA为模板，通过聚合酶链式反应扩增获得引入单ー酶切位点的六联体蛋白高可变区5序列下游2300bp的同源臂序列，设计聚合酶链式反应的引物，通过聚合酶链式反应，聚合酶链式反应扩增产物经质量浓度为的琼脂糖凝胶电泳后回收片段，将回收的聚合酶链式反应产物分別与pGEMT-easy载体连接，经碱性裂解法提取质粒 DNA，通过酶切及测序鉴定获得阳性克隆，阳性克隆为引入单ー酶切位点2的腺病毒六联体蛋白高可变区5序列下游2300bp同源臂的质粒载体，命名为pGEMT/Hexon HR down-single enzyme2。(4)构建腺病毒六联体蛋白经遗传修饰部位携帯筛选基因的穿梭载体将合成的带有EcoRl-Xbal-BamHl-SfuI-ClaI-HindIII 酶切位点的 DNA 序列，其 DNA序列如下AATTCTCTAGAGAATCCTTCGAAATCGATA连入经EcoRI 和 HindIII 双酶切的 pUC19 质粒载体(购买自NEB公司)，经碱性裂解法提取质粒DNA，通过酶切及测序鉴定获得阳性克隆，命名为PUC19EHL。将Hexon HR up 片段从 pGEMT/Hexon HR up-single enzymel 载体上经 XbaI 和单一酶切位点1对应的内切酶双酶切下来，经的琼脂糖凝胶电泳回收后连入经相同酶双酶切的pUC19EHL中，经碱性裂解法提取质粒DNA，通过酶切及测序鉴定获得阳性克隆，命名为 psnuttle-Hexon-up HR,将Hexon HR down片段从pGEMT/Hexon HR down-singleenzyme2 载体上经BamHI和ClaI双酶切下来，经1 %琼脂糖凝胶电泳回收后连入经相同酶双酶切的 pshuttle-Hexon-up HR载体中，经碱性裂解法提取质粒DNA、酶切鉴定，获得阳性克隆，命名为pshuttle-Hexon-up-down HR ；将经过单ー酶切位点1和2所对应的内切酶双酶切的筛选表达元件连入经过相同酶双酶切的pshuttle-Hexon-up-down HR载体，经碱性裂解法提取质粒DNA，酶切鉴定获得阳性克隆为腺病毒六联体蛋白经遗传修饰部位携帯筛选基因的芽梭咸体，命名为 pshuttle-Hexon-screening gene。(5)构建六联体蛋白经遗传修饰的腺病毒的载体将pshuttle-Hexon-screening gene 经 XbaI 和 ClaI 双酶切，经 1 %琼脂糖凝胶电泳回收Hexon-screening gene片段后与经BamHI线性化的pAd5CMV_R印orter共转化 BJ5183感受态細胞，培养、筛选，经摇菌、提取质粒DNA、酶切鉴定获得阳性克隆为六联体蛋白经遗传修饰的腺病毒的载体，命名为pRGHMAd5。(6)六联体蛋白经小肽修饰的腺病毒的载体的构建及病毒制备将合成的小肽的寡核苷酸退火后与经单ー酶切位点1和2酶切处理后的pRGFMAd5 连接，连接产物转化、培养、筛选，经摇菌、提取质粒DNA、酶切及测序鉴定获得阳性克隆为六联体蛋白经小肽修饰的腺病毒的载体，命名为pRGFMAd5-小肽，将pRGFMAd5-小肽载体经 PacI线性化后转染HEK293細胞，7_10天后获得病毒原液，经过扩増，通过CsCl梯度离心纯化后获得六联体蛋白经小肽遗传修饰的腺病毒，命名为Ad5-Hexon-Smal 1-p印tide。采用本发明构建方法构建的六联体蛋白经Tat PTD遗传修饰的腺病毒的载体进行了感染A172細胞和CH0-K1細胞实验，实验结果表明，六联体蛋白经Tat PTD遗传修饰的腺病毒的载体可用于感染A172細胞和CH0-K1細胞，并明显提高对这两种細胞的感染效率。本发明构建方法，能够高效，快速的构建外源小肽修饰六联体蛋白的腺病毒的载体并且可以快速获得完全修饰的病毒颗粒。图1是pUC19EHL载体结构图。图 2 是 pshuttle-Hexo-up-down HR 载体结构图。图 3 是 pshuttle-Hexon-LacZ 载体结构图。图4是pRGFMAd5载体结构图。图 5 是 pRGFMAd5_Tat PTD 载体结构图。图6是pRGFMAd5_RGD载体结构图。图7是实施例1构建的六联体蛋白经Tat PTD遗传修饰的腺病毒的载体感染A172細胞的荧光照片。图8是实施例1构建的六联体蛋白经Tat PTD遗传修饰的腺病毒的载体感染 CHO-Kl細胞的荧光照片。
在载体的BamHI与SfuI酶切位点之间插入ー个用于蓝白斑筛选的β -半乳糖苷酶基因(IacZ)表达元件，所插入的表达元件序列如下ATGACCATGATTACGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCTCCGGGTACCGAGCTCGAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTC ACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAG在Ad5载体引入的两个单一酶切位点之间插入Tat PTD序列，所插的Tat PTD序列如下GATCTGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGACCACAAGG上述的制备经六联体蛋白遗传修饰的腺病毒的载体构建方法步骤如下1、构建在El区携带CMV-eGFP_SV40pA表达框的腺病毒质粒载体用聚合酶链式反应获得绿色荧光蛋白基因(eGFP)，将该基因克隆到腺病毒El穿梭载体中，获得的阳性质粒载体命名为pAd5CMV-eGFP-SV40pA-shuttle。将kal线性化的载体pAd5CMV-eGFP-SV40pA-shuttle与ClaI线性化的载体pTG3602共转化BJ5183，经酶切及测序后获得的腺病毒质粒载体即为在El区携帯CMV-eGFP-SV40pA表达框的腺病毒质粒载体,命名为pAd5CMV-eGFP。2、构建引入BamHI酶切位点的腺病毒六联体蛋白高可变区5序列上游SOObp同源臂的质粒载体以腺病毒基因组DNA为模板，通过聚合酶链式反应扩增获得引入BamHI酶切位点的六联体蛋白高可变区5序列上游SOObp的DNA片段。设计引物的序列如下Pl:ATCTAGAATGGCTACCCCTTCGATGATGCCGCAGTGP2 :AGGATCCTGAGAAAAATTGCATTTCCACTTGA聚合酶链式反应的条件是94°C 30秒，98°C 10秒55°C 5秒72°C 50秒，30个循环。 聚合酶链式反应扩增产物经质量浓度为的琼脂糖凝胶电泳后回收片段。将回收的聚合酶链式反应产物分別与pGEMT-easy载体连接。连接条件为pGEMT-eaSy载体0. 5 μ 1，聚合酶链式反应回收产物4μ 1，2XT4DNA快速连接酶缓冲液5μ 1J4 DNA快速连接酶0. 5 μ 1， 25°C反应1个小时后转化感受态细胞DH5 α，并涂布于含有100 μ g/ml的氨苄青霉素的LB 平板中。挑取菌落接种到含有100yg/ml的氨苄青霉素的LB培养液中，14 16小时后， 经碱性裂解法提取质粒DNA，通过酶切及测序鉴定获得阳性克隆。将所获得阳性克隆为引入BamHI酶切位点的腺病毒六联体蛋白高可变区5序列上游SOObp同源臂的质粒载体，命名为 pGEMT/Hexon HR up-BamHI。3.构建引入SfuI酶切位点的腺病毒六联体蛋白高可变区5序列下游2300bp同源臂的质粒载体以腺病毒基因组DNA为模板，通过聚合酶链式反应扩增获得引入SfuI酶切位点的六联体蛋白高可变区5序列下游2300bp的同源臂序列。设计引物的序列如下P3 :AGGATCCATATTCGAACCTAAAGTGGTATTGTACAGTGAAP4 :TATCGATGAAACATGCAGCAGAATAGTCCACAG聚合酶链式反应的条件是94°C 30秒，98°C 10秒55°C 5秒72°C 2分钟20秒，30个循环。聚合酶链式反应扩增产物经质量浓度为的琼脂糖凝胶电泳后回收片段。将回收的聚合酶链式反应产物分別与pGEMT-easy载体连接。连接条件为pGEMT-eaSy载体 0. 5μ 1，聚合酶链式反应回收产物4μ 1，2XT4DNA快速连接酶缓冲液5μ 1，T4DNA快速连接酶0. 5 μ 1，25°C反应1个小时后转化感受态细胞DH5 α，并涂布于含有100 μ g/ml的氨苄青霉素的LB平板中。挑取菌落接种到含有100 μ g/ml的氨苄青霉素的LB培养液中，14 16 小时后，经碱性裂解法提取质粒DNA，通过酶切及测序鉴定获得阳性克隆。将所获得阳性克隆命名为pGEMT/Hexon HR down-1。以pGEMT/Hexon HR down-1为模板，采用聚合酶链式反应定点突变六联体蛋白高可变区5下游同源臂序列中的BamHI位点。此对引物的序列如下P5 :AGACATGACTTTTGAGGTCGATCCCATGGACGAGCCCAP6 :TGGGCTCGTCCATGGGATCGACCTCAAAAGTCATGTCT突变下游同源臂序列中的BamHI位点的聚合酶链式反应的条件是94°C 30秒， 980C 10秒55°C 5秒72°C 5分钟20秒，30个循环。聚合酶链式反应扩增产物经质量浓度为的琼脂糖凝胶电泳后回收片段。将回收的聚合酶链式反应产物分別与PGEMT-easy载体连接。连接条件为pGEMT-eaSy载体0. 5μ 1，聚合酶链式反应回收产物4μ 1，2XT4 DNA 快速连接酶缓冲液5μ 1，T4 DNA快速连接酶0. 5 μ 1，25°C反应1个小时后转化感受态细胞 DH5 α，并涂布于含有100 μ g/ml的氨苄青霉素的LB平板中。挑取菌落接种到含有100 μ g/ ml的氨苄青霉素的LB培养液中，14 16小时后，经碱性裂解法提取质粒DNA，通过酶切及测序鉴定获得阳性克隆为引入SfuI酶切位点的腺病毒六联体蛋白的高可变区5序列的下游2300bp同源臂的质粒载体，命名为pGEMT/Hexon HR down-Sful。4.构建腺病毒六联体蛋白经遗传修饰部位携帯半乳糖苷酶筛选基因的穿梭载体将合成的带有EcoRl-Xbal-BamHl-SfuI-ClaI-HindIII 酶切位点的 DNA 序列，其 DNA序列如下AATTCTCTAGAGAATCCTTCGAAATCGATA连入经EcoRI 和 HindIII 双酶切的 pUC19 质粒载体。连接条件是2μ1合成DNA片段，1μ110ΧΤ4连接酶缓冲液，0.5μ1 pUC19载体，0. 5μ1 Τ4连接酶，6μ1三蒸水，16°C连接15小吋，将连接产物转化感受态的DH5a细胞，并涂布于含有100 μ g/ml的氨苄青霉素的LB平板中。挑取菌落接种到含有100 μ g/ml 的氨苄青霉素的LB培养液中，14 16小时后，经碱性裂解法提取质粒DNA，通过酶切及测序鉴定获得阳性克隆，命名为PUC19EHL。载体结构如图1所示。将Hexon HR up 片段从 pGEMT/Hexon HR up-BamHI 载体上经 XbaI 和 BamHI 双酶切下来，经1 %的琼脂糖凝胶电泳回收后连入同样经)(bal和BamH μ酶切过的pUC19EHL中。 连接条件是4 μ 1酶切纯化片段，5μ 1 2ΧΤ4 DNA连接酶缓冲液，0. 5 μ 1酶切载体，0. 5 μ 1 T4DNA连接酶。连接产物采用同样的方法转化、提取质粒DNA、酶切鉴定获得阳性克隆，命名为 pshutt丄e-Hexon-up HR0将Hexon HR down 片段从 pGEMT/Hexon HR down-Sful 载体上经 BamHI 和 ClaI双酶切下来，经琼脂糖凝胶电泳回收后连入同样经BamHI和ClaI双酶切的 pshuttle-Hexon-upHR载体中。连接条件是4 μ 1酶切纯化片段，5 μ 1 2XT4DNA连接酶缓冲液，0. 5μ 1酶切载体，0. 5μ 1 T4DNA连接酶。连接产物采用同样的方法转化、提取质粒 DNA、酶切鉴定获得阳性克隆，命名为pshuttle-Hexon-up-down HR，该载体的结构如图2所小。将两端酶切位点为BamHI和SfuI位点的β -半乳糖苷酶基因表达元件连入经过 BamHI和SfuI双酶切的pshuttle-Hexon_up-down HR载体，连接条件是4μ 1酶切纯化片段，5μ1 2ズ1~40嫩连接酶缓冲液，0.5111酶切载体，0.5111 T4DNA连接酶。连接产物采用同样的方法转化、提取质粒DNA、酶切鉴定获得阳性克隆为腺病毒六联体蛋白遗传修饰部位携帯β -半乳糖苷酶筛选基因的穿梭载体，命名为pshuttle-Hexon-LacZ，该载体的结构如图3所示。5、六联体蛋白经遗传修饰的腺病毒的载体的构建将pshuttle-Hexon-LacZ经)(bal和ClaI双酶切，经1 %琼脂糖凝胶电泳回收 pshuttle-Hexon-LacZ后与经BamHI线性化的pAd5CMV_eGFP共转化Bj5183感受态細胞，涂布于含有100 μ g/ml的氨苄青霉素的LB平板并加入50 μ 1的40mg/ml的Χ-gal进行蓝白斑筛选。经摇菌、提取质粒DNA、酶切鉴定获得阳性克隆为六联体蛋白遗传修饰的腺病毒的载体，命名为pRGHMAd5，该腺病毒的载体的结构如图4所示。6、六联体蛋白经Tat PTD遗传修饰的腺病毒的载体的构建及病毒制备将合成的Tat PTD寡核苷酸退火后与经BamHI及SfuI酶切处理后的pRGFMAd5连接。连接条件是2μ 1酶切纯化片段，1μ 1 10ΧΤ4连接酶缓冲液，2μ 1 pRGFMAd5载体， 0. 5 μ 1Τ4连接酶，4. 5μ 1三蒸水，16°C连接16小吋，将连接产物转化感受态的DH5 α細胞， 并涂布于含有100 μ g/ml的氨苄青霉素并加入50 μ 1的40mg/ml的Χ-gal的LB平板中。挑取菌落接种到含有100 μ g/ml的氨苄青霉素的LB培养液中，14 16小时后，经碱性裂解法提取质粒DNA，通过蓝白筛选、酶切及测序鉴定获得阳性克隆，命名为pRGFMAd5-Tat PTD0 该载体的结构如图5所示。将pRGFMAd5-Tat PTD载体经I3acI线性化后转染HEK293細胞， 7-10天后获得病毒原液，经过扩增后，通过CsCl梯度纯化后获得六联体蛋白经Tat PTD遗传修饰的腺病毒的载体，命名为Ad5-Hexon-Tat PTD0实施例2本实施例制备六联体蛋白经Tat PTD遗传修饰的腺病毒的载体如下实施例1中在El区携帯的绿色荧光蛋白报告基因，即在腺病毒基因组352bp与 33^bp之间插入CMV-eGFP-SV40pA表达元件中的绿色荧光蛋白报告基因用β -半乳糖苷酶基因替换。元件的其它结构与实施例1相同。其构建方法与实施例1相同，构建成六联体蛋白经Tat PTD遗传修饰的腺病毒的载体。实施例3本实施例制备六联体蛋白经Tat PTD遗传修饰的腺病毒的载体如下实施例1中在El区携帯绿色荧光蛋白报告基因，即在腺病毒基因组352bp与 3326bp之间插入CMV-eGFP-SV40pA表达元件中的绿色荧光蛋白报告基因用荧光素酶替换。 元件的其它结构与实施例1相同。其构建方法与实施例1相同，构建成六联体蛋白经Tat PTD遗传修饰的腺病毒的载体。实施例4本实施例制备六联体蛋白经Tat PTD遗传修饰的腺病毒的载体如下
实施例1中在El区携帯绿色荧光蛋白报告基因，即在腺病毒基因组352bp与 3326bp之间插入CMV-eGFP-SV40pA表达元件中的绿色荧光蛋白报告基因用红色荧光蛋白替换。元件的其它结构与实施例1相同。其构建方法与实施例1相同，构建成六联体蛋白经Tat PTD遗传修饰的腺病毒的载体。实施例5本实施例制备六联体蛋白经Tat PTD遗传修饰的腺病毒的载体如下在以上的实施例1 4中，在Ad5腺病毒基因组六联体蛋白高可变区5即在Ad5 腺病毒基因组第19646bp处和第19685bp处引入两个单一的酶切位点为BamHI和Swal，元件的其它结构与实施例1相同。其构建方法与实施例1相同，构建成六联体蛋白经Tat PTD遗传修饰的腺病毒的载体。实施例6本实施例制备六联体蛋白经Tat PTD遗传修饰的腺病毒的载体如下在以上的实施例1 4中，在Ad5腺病毒基因组六联体蛋白的高可变区5即在Ad5 腺病毒基因组第19646bp处和第19685bp处引入两个单一的酶切位点为SfuI和Swal，元件的其它结构与实施例1相同。其构建方法与实施例1相同，构建成六联体蛋白经Tat PTD遗传修饰的腺病毒的载体。实施例7本实施例制备六联体蛋白经Tat PTD遗传修饰的腺病毒的载体如下在以上的实施例1 6中，在载体的第19646bp处和第19685bp处两个单ー的酶切位点酶切位点之间插入ー个在細菌中表达的用于筛选的荧光蛋白表达元件，所插入的表达元件序列如下ATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGATGTTAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCAACATACGGAAAACTTACCCTTAAATTTATTTGCACTACTGGAAAACTACCTGTTCCATGGCCAACACTTGTCACTACTTTCTCTTATGGTGTTCAATGCTTTTCCCGTTATCCGGATCATATGAAACGGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAACGCACTATATCTTTCAAAGATGACGGGAACTACAAGACGCGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTGTTAATCGTATCGAGTTAAAAGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTCGGACACAAACTCGAGTACAACTATAACTCACACAATGTATACATCACGGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGCTAACTTCAAAATTCGCCACAACATTGAAGATGGATCCGTTCAACTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACAACCATTACCTGTCGACACAATCTGCCCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGCGTGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACTGCTGCTGGGATTACACATGGCATGGATGAGCTCTACAAATAA元件的其它结构与实施例1相同。 其构建方法与实施例1相同，构建成六联体蛋白经TatPTD遗传修饰的腺病毒的载体。 实施例8
本实施例制备六联体蛋白经Tat PTD遗传修饰的腺病毒的载体如下在以上的实施例1 6中，在载体的第19646bp处和第19685bp处两个单ー的酶切位点酶切位点之间插入ー个在細菌中表达的用于筛选的卡那霉素表达元件，也可以是氨苄青霉素、氯霉素筛选基因中的任意一种，元件的其它结构与实施例1相同。其构建方法与实施例1相同，构建成六联体蛋白经Tat PTD遗传修饰的腺病毒的载体。实施例9本实施例制备六联体蛋白经RGD遗传修饰的腺病毒的载体如下在以上的实施例1 8中，在Ad5腺病毒基因组六联体蛋白高可变区5即在Ad5腺病毒基因组第19646bp处和第19685bp处的两个单ー酶切位点之间最终插入的小肽为R⑶， 元件的其它结构与实施例1相同。其构建方法与实施例1相同，构建成六联体蛋白经RGD遗传修饰的腺病毒的载体。实施例10本实施例制备六联体蛋白经SIKVAV遗传修饰的腺病毒的载体如下在以上的实施例1 8中，在Ad5腺病毒基因组六联体蛋白的高可变区5即在Ad5 腺病毒基因组第19646bp处和第19685bp处的两个单ー酶切位点之间最终插入的小肽为 SIKVAV，元件的其它结构与实施例1相同。其构建方法与实施例1相同，构建成六联体蛋白经SIKVAV遗传修饰的腺病毒的载体。实施例11本实施例制备六联体蛋白经NGR遗传修饰的腺病毒的载体如下在以上的实施例1 8中，在Ad5腺病毒基因组六联体蛋白的高可变区5即在Ad5 腺病毒基因组第19646bp处和第19685bp处的两个单ー酶切位点之间最终插入的小肽为 NGR，元件的其它结构与实施例1相同。其构建方法与实施例1相同，构建成六联体蛋白经NGR遗传修饰的腺病毒的载体。实施例12本实施例制备六联体蛋白经RVG16遗传修饰的腺病毒的载体如下在以上的实施例1 8中，在Ad5腺病毒基因组六联体蛋白的高可变区5即在Ad5 腺病毒基因组第19646bp处和第19685bp处的两个单ー酶切位点之间最终插入的小肽为 RVG16，元件的其它结构与实施例1相同。其构建方法与实施例1相同，构建成六联体蛋白经RVG16遗传修饰的腺病毒的载体。实施例13本实施例制备六联体蛋白经RVG^遗传修饰的腺病毒的载体如下在以上的实施例1 8中，在Ad5腺病毒基因组六联体蛋白的高可变区5即在Ad5 腺病毒基因组第19646bp处和第19685bp处的两个单ー酶切位点之间最终插入的小肽为 RVG29，元件的其它结构与实施例1相同。其构建方法与实施例1相同，构建成六联体蛋白经RVG^遗传修饰的腺病毒的载体。
为了验证采用本发明构建的六联体蛋白经遗传修饰的腺病毒的载体的有益效果， 发明人采用本发明实施例1构建的六联体蛋白经Tat PTD遗传修饰的腺病毒的载体进行实验，实验情况如下1、六联体蛋白经Tat PTD遗传修饰的腺病毒的载体感染A172細胞接种A172细胞于对孔板，每孔IxlO5个细胞，将Ad5-Hexon_Tat PTD腺病毒的载体和对照腺病毒的载体Ad-eGFP分別感染A172細胞，腺病毒的载体感染浓度均为ΙΟΟΟνρ/ cell，实验结果见图7，在图7中，左侧照片为腺病毒的载体Ad-eGFP感染A172細胞的荧光照片，右侧照片为腺病毒的载体Ad5-HeX0n-Tat PTD感染A172細胞的荧光照片。由图 7可见，左边荧光細胞数少，说明对照腺病毒的载体Ad5-eGFP对A172細胞系的感染效率低，右边照片与左边照片相比，荧光细胞数增多，说明当六联体蛋白经Tat PTD遗传修饰后， Ad5-Hexon-Tat PTD腺病毒的载体对A172細胞的感染效率显著提高。2、六联体蛋白经Tat PTD遗传修饰的腺病毒的载体感染CHO-Kl細胞接种CHO-Kl细胞于对孔板，每孔IxlO5个细胞，将Ad5-Hexon_Tat PTD腺病毒的载体和对照腺病毒的载体Ad-eGFP分別感染CHO-Kl細胞，腺病毒的载体感染浓度均为 ΙΟΟΟνρ/celL·实验结果见图8，在图8中，左侧照片为腺病毒的载体Ad-eGFP感染CH0-K1 細胞的荧光照片，右侧照片为腺病毒的载体Ad5-HeX0n-Tat PTD感染CH0-K1細胞的荧光照片。由图8可见，左边荧光細胞数少，说明对照腺病毒的载体Ad5-eGFP对CH0-K1細胞系的感染效率低，右边照片与左边照片相比，荧光细胞数增多，说明当六联体蛋白经TatPTD遗传修饰后，Ad5-Hexon-Tat PTD腺病毒的载体对CH0-K1細胞的感染效率显著提高。上述实验1和2说明，构建的六联体蛋白经Tat PTD遗传修饰的腺病毒的载体可用于感染A172細胞和CH0-K1細胞，并明显提高对这两种細胞的感染效率。


一种制备六联体蛋白经遗传修饰的腺病毒的载体，在E1区插入报告基因表达元件；Ad5腺病毒基因组六联体蛋白的高可变区5引入两个单一的酶切位点、酶切位点之间插入一个筛选表达元件；在Ad5载体引入的两个单一酶切位点之间插入小肽序列。构建方法为构建在E1区携带报告基因表达框的腺病毒质粒载体、引入单一酶切位点1的腺病毒六联体蛋白高可变区5序列上游800bp同源臂的质粒载体、引入单一酶切位点2的腺病毒六联体蛋白高可变区5序列下游2300bp同源臂的质粒载体、腺病毒六联体蛋白经遗传修饰部位携带筛选基因的穿梭载体、构建六联体蛋白经遗传修饰的腺病毒的载体、六联体蛋白经小肽修饰的腺病毒的载体的构建及病毒制备。