专利名称：一株对香蕉枯萎病菌有拮抗作用的嗜铁内生菌及其应用的制作方法植物内生细菌是指一生或至少一生中的某一阶段能进入活体植物组织内，且它们的存在并未使植物组织的表型特征和功能有明显改变的细菌。和病原细菌不同，内生细菌和宿主植物之间是ー种共生关系。1926年Perotti在许多健康植物根组织内发现内生细菌，随后这方面的研究有了很大进展，目前人们发现几乎所有的健康植物体内均存在大量的内生细菌。这些内生细菌能够在植物体内发挥ー些特殊的作用而受到人们的关注，其中具有促生或生防作用的有益内生细菌是植物病理学家研究的ー个重点。促生类内生细菌的作用机制有合成或促进植物合成多种植物生长激素；利用固氮作用为宿主提供氮元素；利用铁载体协助宿主吸收铁离子；合成某些小分子物质或者酶，提高宿主植物对霜冻等有害环境条件的适应性等。生防类内生细菌的作用机制有产生抗菌物质，抑制病原生长；和病原物竞争生态位和营养物质；诱导寄主产生系统抗性；提高宿主对病原的敏感性等。具有促生或生防作用的内生细菌在农业生产中具有很强的应用潜力，特别是具有生防作用的内生细菌是当前研究的ー个热点。内生细菌能够存在于宿主组织内，和宿主作为ー个整体共同发挥作用。首先，宿主为内生菌提供水分、营养物质和生存场所，使其基本不受外界环境的影响，和常规生防相比，防效稳定性得到了很大的提高。其次，内生菌和宿主作为ー个整体表现出抗病性，不必进行抗病种质的培育，节省时间和资金。第三，内生菌能够在宿主组织内长期存在，和常规的农药防治相比成本低、防效长，而且不存在对环境的污染问题。铁是生物生长所必须的营养因子之一，有些微生物能够产生ー种特殊的能与铁结合的有机化合物，称为铁载体。它的主要基团是儿茶酚及异羟肟酸的衍生物，能牢固地与3价铁结合，溶解3价铁并将铁转运入细胞。有些内生细菌能够产生铁载体，不但通过争夺有限的铁元素而抑制病原物的生长，同时也改善了宿主的铁营养条件。在缺铁的土壌中，这种效果尤为明显，在病害的生物防治中具有重要意义。香蕉枯萎病(Banana Wilt Disease)又名巴拿马病,是由尖孢铼刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum. f sp. Cubense,F0C)侵染引起的以维管束坏死为特征的一种毁灭性真菌病害，也是ー种典型的土传病害。该病是目前香蕉产业的最大威胁，近年来在我国香蕉主产区持续暴发并造成严重损失，生产上主要依靠农业措施或化学农药进行防治。轮作等农业措施虽然效果较好，但成本高、耗时长，难以大面积推广普及。化学农药存在着防效差、污染环境、抑制有益微生物和诱导病菌抗药性等问题。采用抗病品种又存在育种周期长，所需人力和经费多而在生产中受到较大限制。采用具有生防作用的内生细菌来进行该病的防 治是一条值得期望的新途径，目前的研究主要集中于有益菌株的筛选和盆栽防效评价。
本发明的目的是提供一株对香蕉枯萎病菌有拮抗作用的嗜铁内生菌及其在防治香蕉枯萎病中的应用。本发明所提供的香蕉枯萎病菌拮抗菌为罗尔斯通氏菌(Ralstonia sp.)BEB99。所述罗尔斯通氏菌(Ralstonia sp. )BEB99，已于2012年04月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为中国北京市朝阳区北辰西路I号院3号)，保藏号为CGMCC NO. 6024。所述罗尔斯通氏菌(Ralstonia sp. )BEB99分离自健康的香蕉植株内，为革兰氏阴性杆菌，菌体大小约0. 9 I. 2 ii m之间,无芽孢,有荚膜，鞭毛极生。菌体在NA培养基平板上能形成乳白色的菌落，菌落边缘规则，光滑稍突起，表面湿润，能产生铁载体。 以上述罗尔斯通氏菌(Ralstonia sp. )BEB99为活性成分的生物菌剂也属于本发明的保护范围。在需要的时候，该菌剂中还可包含菌剂制备中常用的载体和辅料。实验证明，本发明的对香蕉枯萎病菌有拮抗作用的嗜铁内生菌为罗尔斯通氏菌(Ralstonia sp.)BEB99，对香蕉枯萎病菌有较好的抑菌作用，可以对该病害起到较好的防治作用。本发明的对香蕉枯萎病菌有拮抗作用的嗜铁内生菌为罗尔斯通氏菌(Ralstoniasp.) BEB99,分离自健康的香蕉植株内，是ー株香蕉内生细菌，实验证明该菌株接种香蕉后能够在香蕉植株内部稳定存在。平板对峙试验表明该菌株对香蕉枯萎病菌有较好的拮抗作用，其抑菌率达到46. 43%。盆栽试验表明该菌株对香蕉枯萎病的防效可达62. 52%，同时对香蕉也有较好的促生作用。该菌株的获得，有望为香蕉枯萎病菌的防治提供了一条环保、简单、有效的途径。本发明的罗尔斯通氏菌(Ralstonia sp.)BEB99是ー株具有良好生防应用前景的菌株。图I为罗尔斯通氏菌(Ralstonia sp.)BEB99和香蕉枯萎病菌的对峙培养实验结果；图中，A为BEB99菌落对香蕉枯萎病拮抗效果，B为病原菌(F0C4)对照。图2为罗尔斯通氏菌(Ralstonia sp. ) BEB99菌液对香蕉枯萎病菌的抑菌作用；图中，A为BEB99菌液对香蕉枯萎病的拮抗效果，B为病原菌(F0C4)对照。图3为罗尔斯通氏菌(Ralstonia sp. )BEB99产铁载体实验；图中，A为罗尔斯通氏菌(Ralstonia sp.) BEB99产铁载体的定量检测,B为罗尔斯通氏菌(Ralstonia sp.) BEB99在铁载体培养基上产生的水解圏。图4为罗尔斯通氏菌(Ralstonia sp. )BEB99菌液对香蕉杯苗的促生作用试验结果；图中，A、D为清水对照处理，B、C为浸泡BEB99菌液处理。图5为罗尔斯通氏菌(Ralstonia sp.)BEB99菌液对香蕉盆栽苗的促生作用试验結果；图中，A、D为清水对照处理，B、C为浸泡BEB99菌液处理。图6为罗尔斯通氏菌(Ralstonia sp. )BEB99菌液对香蕉枯萎病的防治试验，不同处理香蕉植株的发病症状；图中，A为清水对照处理，B为病原菌(F0C4)对照处理，C为接种内生菌(BEB99)后7天接种病原菌(F0C4)处理，D为接种病原菌(F0C4)后7天接种内生菌(BEB99)，E为药剂对照。图7为罗尔斯通氏菌(Ralstonia sp. )BEB99菌液对香蕉枯萎病的防治试验，不同处理香蕉球茎的发病症状；图中，A为清水对照处理，B为病原菌(F0C4)对照处理，C为接种内生菌(BEB99)后7天接种病原菌(F0C4)处理，D为接种病原菌(F0C4)后7天接种内生菌(BEB99)，E为药剂对照。


本发明公开了一株植物病原真菌拮抗菌及其在防治植物病害中的应用。该植物病原真菌拮抗菌为罗尔斯通氏菌(Ralstonia sp.)BEB99 CGMCC NO.6024。该植物病原真菌拮抗菌罗尔斯通氏菌(Ralstonia sp.)BEB99可以防治香蕉枯萎病菌引起的植物病害；特别是可以与香蕉共生，在香蕉体内稳定的生存，能显著促进香蕉植株的生长并防治香蕉枯萎病的发生。