专利名称：一种马槟榔愈伤组织的诱导及再生方法〔0002〕 马槟榔((^.爪狀&丨匕丨)，系山柑科((^卯犯^也⑶册)，山柑属植物；是一种多年生常 绿木质藤本、攀援灌木，长达数米至数十米；仅分布于我国热带亚热带地区，如云南、广西和 贵州等省区的高海拔“(^-化^^)!!!)地区；是一种珍稀濒危野生果树。〔0003〕 马槟榔种子可入药，其性苦、甘、寒，可催产、避孕；可清热解毒、治咽喉肿痛、恶疮 肿毒；可生津润肺、助消化；还可去斑痧、醒酒等，特别是其种仁食之有经久甜味。其种子富 含甜蛋白，在全世界7种植物甜蛋白中，马槟榔是我国特有分布的、唯一在果实中富含甜蛋 白的野生果树资源。其种仁中富含甜蛋白马宾灵化处1111110，甜度约为蔗糖的400倍(以重 量比较为基础〉，而且其耐酸性好，热稳定性高，即使在851水浴中48卜都不改变其甜味活 性，为11. 3，在酸性体系中仍保持可溶性，因此有望成为一种新型食品甜味剂。〔0004〕马槟榔为高大木质藤本植物，仅海南琼海有人以种子育苗试种植，此外，基本上属 于野生自然繁殖的状态，加上自然生境的破坏及人为的砍伐，数量已十分稀少。目前，国内 外对马槟榔的研究主要是在成分分析和甜蛋白基因等方面，其次就是形态学的研究，在马 槟榔的育种方面的研究较少，繁殖方法也只是停留在种子育苗的状态，致使对它的开发与 利用受到很大的限制，难于满足人工种植和实验室的深入研究的需要。
〔0005〕 本发明的目的在于提供一种马槟榔愈伤组织的诱导及再生方法，该方法不仅能够 保证株系的优良特性，并能够提供大量的优质种苗，为马槟榔大面积种植、生态与物种保 护、资源利用及实验提供了良好的诱导及再生方法。〔0006〕 本发明的上述目的是通过如下技术方案来实现的〔0007〕 一种马槟榔愈伤组织的诱导及再生方法，含以下步骤“丨)材料的选取与消毒； (之)愈伤组织诱导；^丛生芽诱导；(幻丛生芽的增殖培养；巧)不定芽的生根成苗。〔0008〕 具体的，本发明提供的马槟榔愈伤组织的诱导及再生方法，含以下步骤材料 的选取与消毒选取马槟榔材料，将材料经含清洗和浸泡消毒工序处理，获得处理后的马槟 榔材料；
〔0009〕 ^愈伤组织诱导将处理后的马槟榔材料切块，获得组织块，将组织块接种于愈伤 组织诱导培养基上于26181进行暗培养20飞0天，获得马槟榔愈伤组织块；
〔0010〕 ^丛生芽诱导将马槟榔愈伤组织块连同马槟榔愈伤组织块中未愈伤的组织块， 转接于丛生芽的诱导培养基上于26 281进行光培养20 40天，获得马槟榔丛生芽组织 块；
〔0011〕(幻丛生芽的增殖培养选取长势较好的马槟榔丛生芽组织块进行切块，去除已死去变黑和变褐的组织，接种于丛生芽增殖培养基上于26 28°C进行光培养3(T60天，获 得大量的马槟榔不定芽；(5)不定芽的生根成苗选取马槟榔不定芽接到生根成苗培养基上于26 28°C进 行光培养30 60天，获得马槟榔的小苗。在上述步骤中本发明步骤(1)中所述的马槟榔材料包括马槟榔未成熟胚、成熟胚、嫩茎和嫩叶 材料中的一种或几种。本发明步骤(1)中将马槟榔材料经含清洗和浸泡消毒工序处理的过程如下选 取马槟榔材料，用水清洗干净，将马槟榔材料置于体积百分含量为7(T75%的酒精中消毒 l(T60s，并在质量百分含量为0. 1%的氯化汞中浸泡消毒3 20min，用无菌水冲洗干净即可， 浸泡期间进行不时振荡，使马槟榔材料与酒精或氯化汞充分接触。本发明步骤(2)中将处理后的马槟榔材料切块，获得长度为1. (T2. 0cm的组织块。本发明步骤(2)中愈伤组织诱导培养基以MS培养基为基础培养基，在每1升MS培 养基中还添加有1飞mg的6-BA (6-苄氨基腺嘌呤)、() ro. 5mg的NAA (萘乙酸)和2(T30g 的蔗糖。本发明采用愈伤组织诱导培养基培养后，最高的出愈率可达85%，愈伤组织较好， 浅绿色、较紧密、且有光泽，并有芽萌动的现象；随着6-BA浓度在一定范围内的逐步增加， 愈伤组织形成速度逐步加快，而在此基础上添加一定量的NAA会使产生的愈伤组织变得稍 微疏松，并能直接诱导产生不定芽。本发明步骤(3)、步骤(4)和步骤(5)中光培养时，每天光照的时间最好为l(Tl2h ； 每天光照10 12h有利于丛生芽的诱导，诱导出多个不定芽，且芽生长健壮，颜色鲜绿，可 用于进一步的增殖培养。本发明步骤(3)中的丛生芽诱导培养基和步骤(4)中的丛生芽增殖培养基以MS 培养基为基础培养基，在每1升MS培养基中还添加有f 5mg的6-BA、0. f 1. Omg的NAA和 20 30g的蔗糖。本发明步骤(4)中选取长势较好的马槟榔丛生芽组织块进行切块至马槟榔丛生 芽组织块的大小为0. 5^1. 5cm2，去除已死去变黑和变褐的组织，接种于丛生芽培养基中。丛生芽的增殖培养时，随着培养基中6-BA/NAA比率的增大，增殖率逐渐加大，最 高增殖率为283. 46%，且不定芽粗细均匀、生命力旺盛。适合大规模的繁殖。本发明步骤(5)中所述的生根成苗培养基以MS培养基为基础培养基，在每1升MS 培养基中还添加有0. 05 0. 7mg的IBA以及2(T30g的蔗糖。本发明中马槟榔的不定芽生根成苗过程时间约为30 60天，生根率可以达到90% 以上。与现有技术相比，本发明具有如下优点本发明马槟榔愈伤组织的诱导及再生方 法可在短时间、小空间的条件下，可获得大量的规格统一、无病毒、高质量的马槟榔小苗，且 后代整齐一致，能保持原有品种的优良性状，并能节约繁殖材料，从根本上解决了濒危植物 马槟榔的育苗问题，同时为马槟榔的进一步研究提供技术基础；并且本发明方法简单，生产 成本低，丛生芽增殖率高，组织培养周期短，具有很大的应用价值。


图1是实施例1中马槟榔愈伤组织于诱导愈伤组织培养基MS+6-BA5. Omg/ L+NAAO. lmg/L中培养45天的长势图；图2是实施例2中马槟榔愈伤组织于诱导愈伤组织培养基MS+6-BA3. Omg/ L+NAAO. 5mg/L中培养35天的长势图；图3是实施例2中马槟榔愈伤组织块于诱导丛生芽培养基MS+6-BA1. Omg/ L+NAAO. lmg/L中培养35天的长势图；图4是实施例1中马槟榔愈伤组织块于诱导丛生芽培养基MS+6-BA1. Omg/ L+NAAO. 5mg/L中培养30天的长势图；图5实施例1中马槟榔丛生芽组织块于丛生芽增殖培养基MS+6-BA5. Omg/ L+NAAO. 5mg/L中培养15天的长势图；图6是实施例1中马槟榔丛生芽组织块于丛生芽增殖培养基MS+6-BA5. Omg/ L+NAAO. 5mg/L中培养45天的长势图；图7是实施例1中马槟榔的不定芽接于生根培养基MS+IBAO. 15mg/L中培养50天 的长势图；图8是实施例3中马槟榔的不定芽接于生根培养基MS+IBAO. 5mg/L中培养40天 的长势图。



本发明公开了一种马槟榔愈伤组织的诱导及再生方法，其特征是含以下步骤(1)材料的选取与消毒；(2)愈伤组织诱导；(3)丛生芽诱导；(4)丛生芽的增殖培养；(5)不定芽的生根成苗。该方法不仅能够保证株系的优良特性，并能够提供大量优质种苗，为马槟榔大面积种植、生态与物种保护、资源利用及实验提供了良好的再生体系方法。