专利名称：使用酸处理的乳清蛋白提取物水溶液治疗过敏症的制作方法不用母乳喂养的婴儿必须依靠婴儿配方奶粉作为他们的营养素来源，并且用来确保正常生长和发育。婴儿配方奶粉通常基于牛奶。然而大约2%至3%的婴儿对于牛奶中的蛋白质的具有过敏症。虽然存在着许多调节针对过敏原的免疫应答的因子，在婴儿中的Thl/Th2平衡在免疫发育中是重要的，然而婴儿配方奶粉在促进免疫调节机制并且驱动Thl和Th2分化的细胞因子方面是缺乏的。同样地，对于促进适当免疫应答和发育的膳食补充剂、食品或婴 儿配方奶粉存在着需要。发明概述在一个实施方案中提供了ー种用于从含乳清蛋白的组合物生产乳清蛋白提取物的方法，该方法包括使含乳清蛋白的组合物与ー种水溶液接触，由此形成包括含可溶性蛋白的成分和不溶性成分的一种样品；从该样品回收含可溶性蛋白的成分；酸化该含可溶性蛋白的成分；由此形成乳清蛋白提取物。在另ー实施方案中，提供了ー种用于从含乳清蛋白的溶液生产乳清蛋白提取物的方法，包括将在含乳清蛋白的溶液中的可溶性乳清蛋白从不溶性乳清蛋白分离出来；酸化该可溶性乳清蛋白；由此形成乳清蛋白提取物。在另ー实施方案中，提供了包括酸处理的含可溶性乳清蛋白成分的水溶液的乳清蛋白提取物。在某些实施方案中，该提取物是根据以上说明的方法生产的。在其他实施方案中，提供了包括酸处理的含可溶性乳清蛋白成分的水溶液用于制造婴儿配方奶粉、膳食补充剂或食品的用途。在相关实施方案中，提供了包括乳清蛋白提取物的婴儿配方奶粉、膳食补充剂或食品，该乳清蛋白提取物包括酸处理的含可溶性乳清蛋白成分的水溶液。在另外的实施方案中，提供了包括酸处理的含可溶性乳清蛋白成分的水溶液的乳清蛋白提取物用于制造预防食物过敏或使其减轻至最低程度的药物的用途。在另ー个实施方案中，提供了ー种预防食物过敏或使其减轻至最低程度的方法，包括以下步骤向个体提供包括酸处理的含可溶性乳清蛋白成分的水溶液的乳清蛋白提取物。在另外的实施方案中，提供了ー种用于减少在易于食物过敏的个体中的TNF或IL-2释放的方法，包括向个体提供包括酸处理的含可溶性乳清蛋白成分的水溶液的乳清蛋白提取物的步骤。仍然在另外的实施方案中，提供了ー种用于增加在易于食物过敏的个体中的IL-18释放的方法，包括向个体提供包括酸处理的含可溶性乳清蛋白成分的水溶液的乳清蛋白提取物的步骤。仍然在另外的实施方案中，提供了ー种用于增强在易于食物过敏的个体中的肠上皮细胞屏障功能的方法，包括向个体提供包括酸处理的含可溶性乳清蛋白成分的水溶液的乳清蛋白提取物的步骤。仍然在另外的实施方案中，提供了ー种用于增强在易于食物过敏的个体中的Thl免疫应答的方法，包括向个体提供包括酸处理的含可溶性乳清蛋白成分的水溶液的乳清蛋白提取物的步骤。在另ー实施方案中，提供了一种用于使在易于食物过敏的个体中的Th2免疫应答降至最低程度的方法，包括向个体提供包括酸处理的含可溶性乳清蛋白成分的水溶液的乳清蛋白提取物的步骤。附图简要说明图I.在用提取物(123)治疗之后从RAW细胞的TNF-α释放的抑制。图2.在用提取物(123)治疗之后从THP-I细胞的IL-18释放的增强。图3.在用提取物(123)治疗之后从初级⑶4+Τ细胞的IL_2释放的抑制。图4.提取物(123)对CD4T细胞的IL_2释放的影响。图5.在⑶3和⑶28刺激作用之后提取物(123)(酸化的或中性的)对⑶4T细胞的IL-2释放的影响。图6.在用中性的或酸化的提取物(123)或乳铁蛋白治疗之后T84细胞的跨上皮电阻。图7.在用中性的(123-中性的)或酸活化的(123-酸化的)的提取物治疗之后T84细胞的跨上皮电阻。图8.在用以1/8或1/12稀释到配方中或作为3次/天的快速推注给药的提取物(123)治疗之后的血清IgE。图9.在用以1/8或1/12稀释到配方中或作为3次/天的快速推注给药的提取物(123)治疗之后的BLG特异性IgGl浓度(包括离群值，用X表示)。图10.在用以1/8或1/12稀释到配方中或作为3次/天的快速推注给药的提取物(123)治疗之后的血清RMCPII浓度。图11.在用以1/8或1/12稀释到配方中或作为3次/天的快速推注给药的提取物(123)治疗之后的肥大细胞计数/mm2固有层。图12.在用以1/8或1/12稀释到配方中或作为3次/天的快速推注给药的提取物(123)治疗之后的在肠中的IL-IO(A)、IFN-Y (B)和IL_4(C)。图13.断奶研究血清BLG特异性IgGl (A)、IgE⑶和RMCPII (C)。在第4天开始用提取物(123)并且在第14天开始ロ服BLG的强饲法。实施方案的详细说明将会理解的是，在本说明书中披露和限定的本发明涉及两个或更多个从正文或附图提到的或显而易见的个体特征的所有可替代组合。所有这些不同组合都构成本发明的不同替代方面。现在将详细地參考本发明的某些实施方案。虽然将结合这些实施方案来说明本发明，将会理解的是并不g在将本发明限制于那些实施方案。相反，本发明g在覆盖所有替代方案、修改、和等效物，它们都可以包括在如通过权利要求书所限定的本发明的范围之内。本领域的熟练技术人员将认识到类似或等价于在此说明的那些的许多方法和材料，这些都可以在实践本发明中使用。绝非将本发明局限于所说明的这些方法和材料。将会理解的是，在本说明书中披露和限定的本发明涉及两个或更多个从正文或附图提到的或显而易见的个体特征的所有可替代组合。所有这些不同组合都构成本发明的不同替代方面。如在此所使用的，除非在上下文另外要求的地方，术语“包括”(comprise)和该术语的变化，例如“包括”(〃comprising〃)、“包括”(comprises)和“包括”("comprised")并不旨在排除其他添加剂、成分、整体或步骤。本发明人已经惊奇地发现，处于酸处理的含可溶性乳清蛋白成分的水溶液的形式的乳清蛋白提取物具有免疫调节特性。特别是，在此说明的体外研究显示，提取物(另外称为“123”)増加了是Thl应答的特征的生物标记，而使Th2应答的标记降至最低。具体地，这些体外研究显示，该提取物减少了⑶4+T细胞的IL-2分泌，并且增加了 IL-18和TNF分泌。重要的是，这些研究显示该提取物增强了肠的屏障功能。另外，针对以上情况，在此的体内研究显示，在配方奶喂养过敏症倾向的个体中，该提取物使总血清IgE、抗BLG IgGl和肥大细胞计数降至最低。仍进一歩地，在此的体内研究显示，在过敏症倾向个体的断奶期间，该提取物使总血清IgE降至最低。这些发现证明在过敏症倾向个体中该提取物在配方奶喂养和断奶期间在免疫调节中的效用。可以通过ー种方法生产包括酸处理的含可溶性乳清蛋白成分的水溶液的乳清蛋白提取物，该方法涉及含乳清蛋白的组合物的溶解和该组合物的可溶性成分的水溶液的酸化。因此在某些实施方案中，提供了 ー种用于从含乳清蛋白的组合物生产乳清蛋白提取物的方法。该方法包括以下步骤使含乳清蛋白的组合物与ー种水溶液接触，由此形成包括含可溶性蛋白的成分和不溶性成分的一种样品；从该样品回收该含可溶性蛋白的成分； 酸化该含可溶性蛋白的成分；由此形成乳清蛋白提取物。在其他实施方案中，可以通过ー种方法生产乳清蛋白提取物，在该方法中将ー种可溶性乳清水溶液(例如液态乳清)酸化。因此在另一个实施方案中，提供了ー种用于从含乳清蛋白的溶液生产乳清蛋白提取物的方法，包括将在含乳清蛋白的溶液中的可溶性乳清蛋白从不溶性乳清蛋白分离出来；酸化该可溶性乳清蛋白；由此形成乳清蛋白提取物。以上说明的方法可以包括ー个另外的中和酸化的可溶性乳清蛋白的步骤。、“乳清”通常是在奶凝固时与凝乳形成一起形成的浆液或水样部分。典型地，乳清是在乳酪生产中当形成凝乳时形成的。乳清富含乳糖、矿物和维生素，并且含有乳白蛋白和痕量的脂肪。乳清可以形成自哺乳动物奶，优选是牛奶、山羊奶或绵羊奶，更优选是牛奶。“乳清蛋白”通常是在乳清中发现的蛋白质。可以被提供为固体、液体或浓缩物的形式。一种“含乳清蛋白的组合物”通常是包括乳清蛋白的组合物。在一些实施方案中，含乳清蛋白的组合物由乳清蛋白組成。在这些实施方案中，虽然该组合物可以包括其他非蛋白成分，例如碳水化合物和脂肪，但是该组合物基本上缺乏未发现于乳清中的蛋白质。实例包括乳清蛋白浓缩物(WPC)和乳清蛋白分离物(WPI)。在此将进一步说明WPC和WPI以及用于生产这些组合物的方法。在其他实施方案中，含乳清蛋白的组合物包括通常未发现于乳清中的蛋白质。实例包括酪蛋白。可以与乳清蛋白一起添加其他的这些蛋白质以形成含乳清蛋白的组合物。可替代地，当该组合物形成时，这些蛋白质被可以被包括在含乳清蛋白的组合物中。随后形成的组合物的实例包括奶和奶制品。在一个实施方案中，含乳清蛋白的组合物可以富集乳清蛋白。例如，可以添加乳清蛋白至含乳清蛋白的组合物中以增加在该组合物中的乳清蛋白的相对丰度。在其他实施方案中，可以从含乳清蛋白的组合物中除去非乳清蛋白、或其他非蛋白成分，从而增加在该组合物中的乳清蛋白的相对丰度。在此进ー步说明了包括过滤在内的用于富集乳清蛋白的方法的实例。在一个实施方案中，可以针对含乳清蛋白的组合物中的特定蛋白种类进行富集。感兴趣的特定蛋白种类是具有在免疫调节中的应用的那些，并且特别是对最小化或预防过敏症有用的蛋白。实例包括倾向于优先于Th2应答而介导Thl免疫应答的蛋白质。ー个实例是TGF-β。在一个实施方案中，含乳清蛋白的组合物可以包括诱导对哺乳动物在断奶时新引入的膳食蛋白的耐受性有用的肽。在一个实施方案中，该含乳清蛋白的组合物的蛋白成分可以是部分或广泛水解的。一种“含部分水解的乳清蛋白的组合物”通常含有具有通常小于5000d的分子量的寡肽。一种“含广泛水解的乳清蛋白的组合物”通常含有具有小于3000d的分子量的肽。在一个实施方案中，该含乳清蛋白的组合物可以含有生理学上可接受的盐、pH缓冲剂、防腐剂或抗微生物剂。在一个实施方案中，该含乳清蛋白的组合物包括ー种或多种甜乳清、酸乳清、低乳糖乳清、脱矿物乳清(demineralised whey)、WPC 或 WPI。“甜乳清”可以源于乳酪的制造，例如已经巴斯德灭菌的并且未添加防腐剂的切达干酪、莫扎里拉乳酪和瑞士乳酪。甜乳清粉通常含有新鮮乳清的所有成分，除了处于相同的相对比例的水以外。典型地，甜乳清粉含有大约11%_14. 5%的蛋白质、大约63%至75%的乳 糖、大约1%至I. 5%的脂肪、大约8. 2%至8. 8%的灰分以及大约3. 5%至5%的水分。“酸乳清”可以源于乳酪的制造，例如已经巴斯德灭菌的并且未添加防腐剂的农家干酪(cottage)、奶油干酪和瑞可达乳酪(ricotta)。酸乳清粉含有原酸乳清的所有成分，除了处于相同的相对比例的水以外。典型地，酸乳清粉含有大约11%-13. 5%的蛋白、大约61%至70%的乳糖、大约O. 5%至I. 5%的脂肪、大约9. 8%至12. 3%的灰分以及大约3. 5%至5%的水分。在此说明的本发明中，可以在使用前中和酸乳清。可以通过从乳清中选择性除去或水解乳糖而获得“低乳糖乳清”。干产品的乳糖含量可以不超过60%。可以通过物理分离技术(例如沉淀或过滤)或酶水解乳糖为葡萄糖和半乳糖来完成乳糖的降低。可以通过添加安全并且适合的成分来调整低乳糖乳清的酸性。典型地，低乳糖乳清粉含有大约18%-24. 0%的蛋白、大约52%至58%的乳糖、大约1%至4%的脂肪、大约11%至22%的灰分以及大约3%至4%的水分。通过从巴斯德灭菌的乳清中除去一部分的矿物而获得“脱矿物乳清”(也称为“低矿物乳清”)。典型的脱矿物水平为25%、50%和90%。干产品的灰分可以不超过7%。可以通过分离技术(例如离子交換、渗滤或电渗析)来生产脱矿物乳清。可以通过添加安全并且适合的成分来调整脱矿物乳清的酸性。WPC是具有特定蛋白量的乳清的浓缩物。通常，WPC34指定ー种具有不小少于34% 的蛋白质的浓缩物，WPC50指定ー种具有不少于50%的蛋白质的浓缩物，WPC60指定ー种具有不少于60%的蛋白质的浓缩物，WPC75指定ー种具有不少于75%的蛋白质的浓缩物，并且WPC80指定ー种具有不少于80%的蛋白质的浓缩物。可以通过以下方法形成这些浓缩物超滤巴斯德灭菌的乳清，回收渗余物，随后喷雾干燥该渗余物以形成WPC34和WPC50粉；或者渗滤该渗余物，随后浓缩和喷雾干燥以形成WPC50、WPC60、WPC75或WPC80。通过从乳清中除去足够的非蛋白成分而获得WPI，这样干成品含有不少于90%的蛋白质。通过膜分离过程或离子交換来生产WPI。在一个实例中，使巴斯德灭菌的流体乳清经受微孔过滤，导致脂类的去除，然后施用渗滤以形成一种渗透物以及乳清蛋白分离物，进而使后者浓缩和喷雾干燥以形成WPI粉。在另ー实例中，使巴斯德灭菌的的流体乳清经受离子交換蛋白质分离，生成脱蛋白乳清，并且然后使吸附的乳清蛋白解吸附，使其经受超滤或进ー步的离子交換，以除去矿物。然后使如此形成的乳清蛋白分离物经受浓缩和喷雾干燥以形成WPI粉。在一个实施方案中，在含乳清蛋白的组合物中的蛋白质的量是基于干重计至少大约 10%w/w。在一个实施方案中，蛋白质的量大约是10%至小于约90%w/w。在一个实施方案中，蛋白质的量是大约11%至大约25%w/w。在一个实施方案中，蛋白质的量是大约11%至大约18%w/w。在一个实施方案中，蛋白质的量是大约18%至大约25%w/w。在一个实施方案中，蛋白质的量是大约34%至大约80%w/w。在一个实施方案中，蛋白质的量是大约50%至大约75%w/w。在一个实施方案中，蛋白质的量是大约50%至大约60%w/w。在一个实施方案中，蛋白质的量是大约60%至大约75%w/w。在一个实施方案中，蛋白质的量是大约90%至大约95%w/w。在一个实施方案中，含乳清蛋白的组合物包括碳水化合物(例如乳糖)和脂肪中的至少ー种。在一个实施方案中，在含乳清蛋白的组合物中的乳糖的量是基于干重计至少大约l%w/w0在一个实施方案中，乳糖的量是大约1%至小于大约80%。在一个实施方案中，乳糖的量是大约63%至大约75%w/w。在一个实施方案中，乳糖的量是大约61%至大约70%w/w。在一个实施方案中，乳糖量为约52%至约58%w/w。在一个实施方案中，乳糖的量是大约70%至大约80%w/w。在一个实施方案中，乳糖的量是大约48%至大约52%w/w。在一个实施方案中，乳糖的量是大约33%至大约37%w/w。 在一个实施方案中，乳糖的量是大约25%至大约30%w/w。在一个实施方案中，乳糖的量是大约10%至大约15%w/w。在一个实施方案中，乳糖的量是大约4%至大约8%w/w。在一个实施方案中，乳糖的量是大约O. 5%至大约I. 0%w/w。在一个实施方案中，在含乳清蛋白的组合物中的脂肪的量是基于干重计至少大约O. 5%w/w0在一个实施方案中，脂肪的量是大约O. 5%至小于大约10%w/w。在一个实施方案中，脂肪的量是大约1%至大约5%w/w。在一个实施方案中，脂肪的量是大约5%至大约7%w/w。在一个实施方案中，该含乳清蛋白的组合物包括大约80%w/w至82%w/w的蛋白质、大约4%w/w至8%w/w的乳糖以及大约4%w/w至8%w/w的脂肪。在一个实施方案中，该含乳清蛋白的组合物是ー种WPC。在一个实施方案中，该WPC是WPC80。其他WPC包括WPC34、WPC50、WPC60和 WPC75。在一个实施方案中，该含乳清蛋白的组合物被提供为ー种与水溶液接触的粉末形式。“水溶液”，也称为“水溶剤”，是可以用于完全或部分溶解乳清蛋白的一种水基成分。该水溶液可以是水，包括纯化的、蒸馏过的或杀菌的水。该水溶液可以含有生理学上可接受的盐。这些含盐溶液的实例包括盐水。该水溶液可以含有PH缓冲剂或防腐剂或抗微生物剂。“含可溶性蛋白成分的水溶液”或“部分”通常是含有完全或部分溶解在该水溶剂中的蛋白质的样品的成分或部分。这还可以称为“含溶解的蛋白的成分的水溶液”或“含溶解的蛋白的部分的水溶液”。完全溶解于水溶剂中的蛋白质倾向于是采取在溶液中的构象的那些蛋白质，由此疏水性或非极性侧链和基团被埋在不与溶液接触的蛋白质内，而极性或亲水性侧链被暴露在蛋白质表面用干与溶剂接触。部分溶解于水溶剂中的蛋白质可以采取在溶液中的构象，由此ー些疏水性侧链或基团在蛋白质表面上暴露于溶剤。在一个实施方案中，在用于增强含溶解的蛋白的成分的形成的条件下，使该含乳清蛋白的组合物与水溶液接触。例如，可以使用已知的方法搅拌或搅动溶液与组合物的混合物。可以调节温度以增强完全或部分溶解。可以添加ー种或多种有助于溶解的试剂到该混合物中。在一个实施方案中，该含乳清蛋白的组合物是以至少大约O. 5%w/w的含乳清蛋白的组合物的量提供的，用干与水溶液接触。在一个实施方案中，以大约O. 5%至10%w/w的量提供该含乳清蛋白的组合物。在一个实施方案中，以大约O. 5%至7%w/w的量提供该含乳清蛋白的组合物。在一个实施方案中，以大约5%至6%w/w的量提供该含乳清蛋白的组合物。虽然在该成分中还可以存在其他源于奶的蛋白质，典型地完全或部分溶解于该成分中的蛋白质是乳清蛋白，这取决于形成用于该方法的起始或进料材料的含乳清蛋白的组合物。
在该方法中形成的“不溶性成分”成分通常含有蛋白质、脂肪或灰分。通常，在搅拌、搅动该水溶液或调节它的温度吋，不溶性成分是不溶解的。通常，当以每溶液量较大的组合物量提供该含乳清蛋白的组合物时，形成较大量的不溶性成分。通常，该不溶性成分具有膏状质地以及白色或带白色的顔色。通常，该不溶性成分沉降在容器的底部，其中该含乳清蛋白的成分与水溶剂接触。可以通过或不通过离心作用发生沉降。通过从不溶性固体分离含溶解的蛋白的成分，来回收含溶解的蛋白的成分。通常，基本上回收了所有的含溶解的蛋白的成分。在一些实施方案中，从不溶性固体分离了基本上所有含溶解的蛋白的成分。虽然不希望局限于假设，人们认为从可溶性成分水溶液中分离不溶性成分是重要的，因为前者可能含有抑制Thl免疫应答或破坏屏障功能的分子。该分离过程可以是ー个单步或多步过程。在用于分离完全或部分可溶性部分(例如从固体分离上清液)的乳制品加工中已知的许多技术都可以用来从不溶性固体分离含溶解的蛋白的成分。实例包括倾析、离心、色谱法(离子交換、凝胶过滤、HPLC (高效液相色谱法)、RP-HPLC (反相高效液相色谱法)、亲和色谱法)、电渗析、过滤或吸附。典型地，通过对含溶解的蛋白的成分提供至少大约2. 5、优选大约3至6. O、更优选大约3. O至5. 5、3. 5至5. O的pH来酸化该含溶解的蛋白的成分。同时不希望局限于假设，认为该酸化步骤通过除去LAP肽，活化了在该水溶性成分中的TGF β。将会理解的是，该酸化步骤是在从样品回收该含溶解的蛋白的成分之前进行的，虽然典型地在将ー种酸提供至该含溶解的蛋白的成分的情况下该酸化步骤是在回收之后进行的。因此，提供了ー种用于从含乳清蛋白的组合物生产乳清蛋白提取物的方法，依次包括以下步骤使含乳清蛋白的组合物与ー种水溶液接触，由此形成包括含可溶性蛋白的成分和不溶性成分的一种样品；从该样品回收含可溶性蛋白的成分；酸化该含可溶性蛋白的成分；由此产生乳清蛋白提取物。典型地，通过对该含溶解的蛋白的成分提供大约6. 5至7. 5、优选大约7的pH来中和该含溶解的蛋白的成分。该中和步骤可以在从该样品回收含溶解的蛋白的成分之前进行，虽然通常该中和步骤是在已经从该样品回收含溶解的蛋白的成分并且将其酸化之后进行的。可以按液体或固体形式提供以上说明的乳清蛋白提取物。典型地，它被提供为固体形式例如粉末。因此在某些实施方案中，以上说明的方法包括另外的干燥含溶解的蛋白的成分的步骤，从而获得ー种粉末。适合的干燥方法对于技术人员而言是熟知的。例如蒸发，包括真空浓缩、喷雾干燥、滚筒干燥以及转鼓式干燥。可以在使用之前进ー步加工或改性包括酸处理的含可溶性乳清蛋白成分的水溶液的乳清蛋白提取物，包括通过如以上说明的方法所形成的这种提取物。可以应用以下过程或改性中的任何ー种□富集、浓缩或分级分离乳清蛋白，例如使用在此进ー步讨论的膜过滤技木；□酶水解，用来部分或广泛水解包含在提取物中的蛋白质。□除去矿物或灰分，例如使用在此进ー步讨论的电渗析技术；□使用在此进ー步讨论的色谱法或结晶技术除去非蛋白成分；□添加免疫调节分子，例如TGF-β ；□添加对诱导对断奶期间新接收的膳食蛋白的耐受性有用的肽抗原；□进一歩干燥；□颗粒的筛分。包括反滲透、纳滤、超滤和微量过滤的膜技术可以涉及使用半透膜的压カ驱动分离，由此泵和阀的组合产生驱动乳清中的较小的分子跨过该膜的跨膜压カ梯度，从而浓缩不能跨该膜的较大的分子和颗粒。使用具有不同孔径大小或截留分子量的膜可以实现选择性分离或浓缩。膜的实例包括在反渗透(RO)、纳滤(NF)、超滤(UF)和微量过滤(MF)中使用的那些。FR膜具有最小的孔并且只允许水跨过该膜，同时保留乳清的所有其他成分。RO膜的一个常见用途是水的除盐处理。通常根据它们截除盐的能力将这些膜定级。就像真空浓缩一祥，RO系统并不改变乳清中的固体成分的比率，而是通过仅仅除去水来浓缩固体成分。随着水被除去，通过增加粘度和渗透压来限制根据RO的乳清浓度的范围。纳滤膜有时也被称为“松散的” RO膜。NF膜允许ー些一价离子连同水一起跨膜，导致乳清的部分“脱盐”。因为只除去了具有单电荷的矿物，所以NF膜只是略微降低了乳清的矿物含量。NF膜可以用来减小一些类型的乳清的氯化钠含量。超滤膜具有比RO或NF膜更大的孔。UF膜使乳糖和灰分渗过，同时保留乳清中的蛋白质，由此使UF膜是用于生产WPC的标准工具。除去的乳糖和灰分的量越大，WPC的蛋白质含量就越高。由于乳清的粘度随着蛋白浓缩物的增加而增加，在一种被称为渗滤的方法中，在生产具有大于50%蛋白质的WPC时将水添加至渗余物中将另外的量的乳糖和矿物洗去是必需的。微量过滤膜具有膜分离过程中最大的孔。较小的可溶性蛋白、肽、乳糖、矿物、非蛋白氮成分、以及水都易于渗过MF膜。脂肪球被MF膜保留，因此这些膜可以用来除去少量的通过离心未回收的脂肪。必须除去痕量的脂肪来生产WPI。电渗析也使用半透膜，然而，电流取代了作为分离分离乳清成分的驱动カ的压力。电渗析膜只允许矿物滲透，同时保留乳糖和蛋白。电流将带电荷的矿物离子拖过膜而进入盐水流。乳糖并不受电流影响，而蛋白不能跨膜。电渗析并不使乳清蛋白变性，同时除去了乳清中高达75%的矿物。、
离子交換是色谱法的ー种类型。例如，在生产脱矿物的乳清时，使乳清通过含有结合乳清中的离子(带电荷的矿物)的吸收珠粒的柱子。使乳清成分的剩余物(例如蛋白质和乳糖)不受阻碍地通过该柱子。因此，与未处理的乳清相比，生成的乳清具有降低量的矿物。离子交换并不使蛋白质变性，并且可以除去乳清中高达98%的矿物。
色谱法使用带电荷的树脂将乳清中的蛋白质从其他成分中分离出来。这些蛋白质与相反电荷的树脂结合，同时像乳糖这样的成分并不结合并且因此直接通过该系统。在乳清已经通过含有树脂的柱子或槽之后，驱使ー种缓冲剂通过该系统，以释放结合的蛋白质。可以进ー步通过UF来纯化这些蛋白质,进而喷雾干燥。色谱法还可以用来将特殊蛋白质从乳清中的其他蛋白质中分离出来。在针对甜乳清的典型PH下，乳铁蛋白和乳过氧化物酶是带正电荷的。在相同pH下，乳清的主要蛋白质，α-乳清蛋白、β_乳球蛋白和牛血清白蛋白是带负电荷的。在乳清通过含负电荷树脂的槽吋，带正电的乳铁蛋白和乳过氧化物酶与树脂结合，同时其他蛋白质和乳清组合物通过该柱子。然后驱使一种碱性溶液通过该柱子，用来从树脂释放结合的蛋白质。然后可以洗涤和喷雾干燥回收的蛋白质。使用结晶来生产乳糖或非吸湿性乳清/滲透物粉。通过蒸发将乳清或滲透物浓缩到至少50%的总固体，其中乳糖是过饱和的，这样使得随着浓缩的乳清/滲透物冷却，乳糖将易于結晶。在乳清/滲透物已经充分冷却之后，可以除去乳糖晶体，用于进一歩加工成高质量乳糖，或者可以干燥具有结晶乳糖的乳清/滲透物溶液，是产生非吸湿乳清/滲透物粉。一种酶，β_半乳糖苷酶，可以被添加至乳清，用来水解ニ糖乳糖为它的单糖成分，葡萄糖和半乳糖。时间和温度被用来控制乳糖水解的程度。蛋白酶是被添加至乳清用来水解这些蛋白质的酶。添加的蛋白酶的类型、时间和温度被用来控制蛋白质水解的类型和程度。原则上，通过水解的蛋白质修饰与聚合反应是相反的。蛋白酶是用来切割蛋白质分子的肽键从而生成更小的肽和多肽的最常见的酶组。水解度，即乳清蛋白被水解达到的程度，将影响作为食品成分的水解产物的功能特性。可以通过加热使乳清蛋白变性，以改变它们的功能特性。时间和温度的组合被用来控制乳清蛋白变性的量。通常在预加热处理过程中完成控制变性。可以通过乳清蛋白氮指数来測量未变性的乳清蛋白的量。在一个实施方案中，提供了以上说明的提取物用于制造婴儿配方奶粉、后续配方奶粉、膳食补充剂或食品的用途。婴儿配方奶粉通常是代替母乳的给予新生个体的营养组合物。可以给予婴儿配方奶粉到大约4至6月龄。后续配方奶粉通常是给予从大约6个月龄或更大的个体的营养组合物。可以使用任何适合的方式制备该配方。例如，它可以通过将在此说明的乳清蛋白提取物与其他营养成分(例如碳水化合物源、或脂肪源)一起以适当比例共混在一起来制备。如果使用，在这一点上可以包括乳化剤。在这一点上，可以添加其他成分(例如免疫调节分子、维生素和矿物质)，但是通常稍后添加以避免热降解。在共混之前，可以将任何亲脂性维生素、乳化剂以及类似物溶解在脂肪源中。然后可以混入水(优选是已经经受反滲透的水)来形成液体混合物。合宜地水的温度是大约50°C至大约80°C，用来辅助这些成分的分散。可以使用可商购的液化剂来形成该液体混合物。然后使液体混合物均质化，例如分两个阶段。然后可以热处理该液体混合物以减少细菌负荷，例如通过在大约80°C至大约1500C的范围内的温度迅速加热该液体混合物持续大约5秒至大约5分钟。这可以通过蒸汽喷射、高压釜或通过热交換器(例如板式热交換器)来进行。然后可以冷却该液体混合物至大约60°C至大约85°C，例如通过闪蒸冷却。然后可以再次使该液体混合物均质化，例如分两个阶段，在第一阶段在大约IOMPa至大约30MPa，在第二阶段在大约2MPa至大约lOMPa。然后进ー步冷却该均质化的混合物，以添加任何热敏成分，例如维生素和矿物质。在这一点上，合宜地调整均质化的混合物的PH和固体含量。将均质化的混合物转移至适合的干燥器中，例如喷雾干燥器或冷冻干燥器，并且将其转化为粉末。该粉末应当具有按重量计小于大约5%的含湿量。
如果优选液体产品，可以将均质化的混合物杀菌，然后无菌地填充到适合的容器中。在其他实施方案中，可以用ー种方式处理产品来延长保质期，例如通过热处理。在一个实施方案中，提供了包括以上说明的提取物的婴儿配方奶粉、膳食补充剂或食品。配方奶粉可以含有碳水化合物源。虽然优选的碳水化合物源是乳糖，但是可以使用常规发现于婴儿配方奶粉中的任何碳水化合物源，例如乳糖、蔗糖、麦芽糊精、淀粉和它们的混合物。优选地，碳水化合物源构成了在35%与65%之间的配方的总能量。根据本发明的后续配方奶粉可以含有脂质源。该脂质源可以是适合在婴儿配方奶粉中使用的任何脂质或脂肪。优选的脂肪源包括棕榈油精、高油酸葵花子油和高油酸红花油。还可以添加必需脂肪酸亚油酸和α-亚麻酸，如可能是少量含有大量预形成的花生四烯酸和二十ニ碳六烯酸的油，例如鱼油或微生物油。总体上，含脂量优选例如构成30%至55%的配方的总能量。脂肪源优选具有大约5:1至大约15:1的η-6与η_3脂肪酸的比率，例如大约8:1至大约10:1。后续配方奶粉还可以含有被了解为在日常饮食中必需的并且处于营养显著量的所有维生素和矿物质。已经确立了对于某些维生素和矿物质的最低需求。任选地存在于婴儿配方奶粉中的矿物质、微生物和其他营养素的实例包括维生素Α、维生素BI、维生素Β2、维生素Β6、维生素Β12、维生素Ε、维生素K、维生素C、维生素D、叶酸、肌醇、烟酸、生物素、泛酸、胆碱、 丐、磷、碘、铁、镁、铜、锌、猛、氯、钾、钠、硒、铬、钥、牛磺酸、和L-肉毒碱。通常可以添加处于盐形式的矿物质。具体的矿物质和其他维生素的存在和量将取决于预期的婴儿群体而变化。如果必要，该配方奶粉可以含有乳化剂和稳定剂，例如大豆卵磷脂、单和双甘油酯的柠檬酸酷、以及类似物。该配方奶粉可以任选地含有可能具有有益效果的其他物质，例如乳铁蛋白、核苷酸、核苷等。最終，该配方奶粉可以含有不消化的低聚糖，例如低聚半乳糖，例如以从O. 3%至
7%的量。在Koletzko (克莱茨克)B 等人，2005 J. Pediatric GastroenterolMed. 41:584-599中讨论了配方奶粉的实例。在某些实施方案中，向个体以2. 3g/kg个体体重的量提供该提取物。在一个实施方案中，提供了酸乳清用于制造婴儿配方奶粉、后续配方奶粉、膳食补充剂或食品，以及含酸乳清的配方奶粉、增补剂或食品的用途。在这些实施方案中，酸乳清有效地取代了在此说明的包括酸处理的含可溶性乳清蛋白成分的水溶液的乳清蛋白提取物。在这些实施方案中，可以在使用之前中和酸乳清。在一个实施方案中，提供了在此说明的提取物用于制造预防食物过敏或使其减轻至最低程度的药物的用途。在一个实施方案中，提供了ー种预防食物过敏或使其减轻至最低程度的方法，包括给向个体提供在此说明的提取物的步骤。典型地，该个体是人。典型地，这个人易于过敏症。典型地，人是指新生儿。典型地，该新生儿年龄小于大约2岁。
在一个实施方案中，提供了ー种用于减少在易于食物过敏的个体中的TNF或IL-2释放的方法，包括向个体如提供权利要求48所述的提取物的步骤。在一个实施方案中，提供了ー种用于增加在易于食物过敏的个体中的IL-18释放的方法，包括向个体提供如权利要求48所述的提取物的步骤。在一个实施方案中，提供了ー种用于增强在易于食物过敏的个体中的肠上皮细胞屏障功能的方法，包括向个体提供在此说明的提取物的步骤。在一个实施方案中，提供了ー种用于增强在易于食物过敏的个体中的Thl免疫应答的方法，包括向个体提供在此说明的提取物的步骤。在一个实施方案中，提供了一种用于使易于食物过敏的个体中的Th2免疫应答降至最低限度的方法，包括向个体提供在此说明的提取物的步骤。在以上说明的方法中，酸乳清有效地取代了在此说明的包括酸处理的含可溶性乳清蛋白成分的水溶液的乳清蛋白提取物。以下实例g在说明而决非限制本发明。实例实例I包括酸处理的含可溶性乳清蛋白成分的水溶液的乳清蛋白提取物的生产将200ml H2O添加至12g的WPC 80中，并且在室温孵育30min直至溶解。在16000g离心该溶液IOmin以除去不溶固体。移开上清液并且通过添加I. 335ml ION HCl酸化30min。通过添加I. 555ml IOM NaOH中和该酸化的溶液，并且测量pH，pH约为7. O。最终的溶液过滤通过O. 45 μ m过滤器，进而通过O. 2 μ m过滤器来灭菌。将6%溶液用作用于试验的储备溶液(即按1/8或1/12将储备溶液稀释到配方中)。实例2酸处理的含可溶性乳清蛋白成分的水溶液的体外免疫调节活性在多个基于细胞的测定中，测试了在实例I中形成的提取物(123)的体外免疫调节活性。将该提取物等分到96孔板中，然后在快速基于细胞的筛选測定中筛选。图I中的数据显示在由一种巨噬细胞系的RAW细胞释放的体外TNFa (—种Thl细胞因子)。123刺激RAW细胞中的TNF-a生产(參见在图I中的部分号码3)。取决于周围细胞因子环境，IL-18是驱动T细胞发育成Thl (炎症)亦或Th2 (过敏症)方向的主要早期免疫调节细胞因子。我们还评定了在用具有或不具有脂多糖(LPS)的佛波醇12-十四酸酷13-こ酸酯刺激THPl细胞(一种单核细胞系)之后的IL-18分泌。对照细胞在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。部分123刺激从THPl细胞产生IL-18 (參见图2中的部分号码3)。IL-2是对于T细胞活化所必需的细胞因子，并且在免疫应答诱导中是关键性的。我们评定了在TGR Biosciences的初始T细胞测定中影响IL-2释放的能力。使用MACS磁珠技术(Miltenyi Pty. Ltd)从外周血(来自红十字血库，Adelaide (阿德莱德)获得含血沉棕黄层的白细胞)纯化T细胞。进行CD4+T细胞的间接纯化。首先用结合有针对相关细胞表面标志的抗体的磁珠标记 不想要的细胞(即CD 8+淋巴细胞、巨噬细胞、B细胞等)。然后使标记的细胞向下流过MACS磁柱，不想要的细胞结合到该柱子上，留下CD4+T细胞在柱子的流出液中。然后用PMA洗涤和孵育这些CD4+T细胞，以刺激细胞用于产生细胞因子连同文库中的奶部分。用ELISA评定了 IL-2释放(參见图3)。如通过人⑶4+T细胞的有丝分裂活化证明，123 (图3中的部分3)抑制了 IL_2细胞因子体外释放。在PMA刺激之后，IL-2释放是剂量依赖性的。通过使用过夜(0/N)孵育或脉冲I小时(參见图4)评定了 123对IL-2产生的短期或长期抑制。我们鉴定了具有体外免疫调节活性的4个潜在部分。如通过IL-2释放所测量的，图4中的123部分诱导了 T细胞活化的剂量反应抑制。用这些部分孵育24小时以及在短的I小时脉冲之后，发生了 T细胞中的IL-2的抑制。在123存在下，用PHA和PMA刺激纯化的人⑶4+T细胞过夜。在剂量范围研究中，123清楚地抑制IL-2分泌，如同123浓度的降低导致IL-2分泌的増加一祥明显。最大抑制水平和未受刺激的细胞以及ー种已知的免疫抑制剂地塞米松(DEX)的最大抑制水平是可比较的。对于在体内将被活化的T细胞，抗原被提呈给T细胞受体并且活化共刺激分子，从而导致T细胞活化和细胞因子释放。为了进一步证实免疫调节活性，我们评定了在经由使用抗CD3抗体、和抗CD28 (针对ー种共刺激分子的抗体)的T细胞受体刺激CD4+T细胞之后的IL-2释放的抑制。建立这种活化方案来模拟体内天然发生的情况，作为与使用PHA/PMA的⑶4+T细胞的非特异性促有丝分裂刺激的比较。123抑制了已经用抗⑶3和抗⑶28抗体活化的⑶4+T细胞的IL-2分泌(參见图5)。体外使用T84细胞上皮屏障功能測定，我们评定了奶部分123的效果。123显示体外免疫抑制活性，我们在该屏障功能測定中包括了酸活化的和中性的123和129。測量了在用和不用酸活化的和中性的123培养的T84肠上皮细胞中的跨上皮电阻(TER)(參见图6)。在图7中显示了 123的更详细的图以及它对TER的影响。TER的降低代表细胞屏障功能的降低。图6中的数据显示，在培养I或2天之后，处于中性形式处于酸化形式的123对上皮细胞屏障完整性不具有不利作用(參见图6和图7)。然而，它确实显著増加了 TER測定中的细胞的屏障功能。在从Th2转换为Thl型免疫应答时，过敏症的消退发生在患有牛奶过敏的婴儿中。123也促进了从THPl细胞产生Thl细胞因子IL-18 (參见图2，部分3)。因此我们在幼年棕色挪威大鼠中继续进行使用123的体内试验。实例3酸处理的含可溶性乳清蛋白成分的水溶液的体内免疫调节活性使用棕色挪威过敏倾向幼年大鼠进行体内试验。给予酸活化的123，作为混合在配方中的连续输注，或作为一日三次给予到胃的O. Iml的快速推注。用n=8/组完成试验并且进行血清分析。当用作进入配方中的补充剂(6%起始溶液的1/8)时，或当作为3次/日给予配方饲养的幼年大鼠的快速推注时，123具有免疫调节活性。当与只接受配方的幼年大鼠中的IgE水平相比时,获得了显著的IgE减少。使用具有杜奇事后检验(Tukey’s post - hoctest)的单因素方差分析(One Way AN0VA)来评定组间显著性，*=与配方饲养组相比，处理组 Ρ〈0·05。与配方饲养的幼年大鼠相比，以1/8稀释度或按一日3次给予的强饲法，配方的123补充降低了血清IgE水平(参见图8)。在以1/8或作为一日3次的快速推注的123补充之后，BLG特异性IgGl与配方饲养组并没有显著差异。然而在8个幼年大鼠中的6个中，在1/12稀释度获得了 IgGl滴度的降低，有两个大鼠在1/12试验中具有异常高的血清滴度，如果除去这些离群值，那么该滴度会显著降低。数据呈现在图9中，其中包括离群值的血清数据在内，在图上用(X)标识离群值。通过123处理，RMCPII水平并未降低(参见图10)。在123增补配方后，还在固有层中计量肥大细胞数。在以1/12稀释度的配方补充 之后，在给予123的幼年大鼠中，固有层中的肥大细胞数减少了。在123补充饮食之后，还测定了在肠匀浆中的细胞因子IL-10、干扰素Y和IL_4(分别参见图12(A)、(B)和(C))。在各组之间，没有检测到在IL-10和IL-4水平方面的显著差异。以1/8或1/12稀释度的配方的123补充增强了肠中的IFN-Y浓度。与继续具有持续性过敏症的婴儿相比，继续消退他们的牛奶过敏症的婴儿具有增加的IFN-Y水平。123显得促进了从Th2应答转移并且增加平衡免疫系统所需的Thl应答。我们已经鉴定了具有免疫调节活性的奶生物活性。与只接受配方的幼年大鼠相t匕，当用作进入配方中的补充剂(6%起始溶液的1/8稀释度)时，或作为3次/日的快速推注给予配方饲养的幼年大鼠时，123导致了 IgE (与过敏症发展相关联的抗体)的显著降低。我们还进行了断奶试验，并且评定了强饲123、酸活化的和非酸活化的123的幼年大鼠的血清抗体应答。进行该试验以确定在断奶时，123是否也调节对食品抗原的免疫应答。在试验中的第14天，我们开始用123强饲。我们最近的来自个体发育研究的数据提示婴儿饮食的补充需要发生在更早的年龄。为了确定在断奶时用123预处理是否影响对食品抗原的免疫应答，我们进行了一个第二试验，其中在第4天开始喂123，并且在第14天开始喂BLG (参见图13A、B和C)。在缺乏BLG激发的情况下，123降低了血清中总IgE的总体浓度。正如通过我们的个体发育研究确定的，如果在生命早期(即在哺乳期)用特异性抗原激发开始，通过膳食补充剂的免疫调节会显得更有效。


本发明涉及乳清蛋白提取物的制造、涉及婴儿配方奶粉并涉及减少或预防食物过敏。这种乳清蛋白提取物是从一种含乳清蛋白的组合物通过以下步骤生产的使一种含乳清蛋白的组合物与一种水溶液接触以形成一种样品，这种样品包括一种含可溶性蛋白的成分和一种不溶性成分；从该样品回收这种含可溶性蛋白的成分；并且将这种含可溶性蛋白的成分酸化，由此产生这种乳清蛋白提取物。通过本发明的方法生产的提取物可以用在作为膳食补充剂或食品的婴儿配方奶粉中。