专利名称：抗钙粘着蛋白抗体的制作方法癌症是占据死亡原因的前位的重要疾病，但其治疗需求尚未得到满足。近年来，为了解决现有的化学疗法对正常细胞也造成损害的问题，积极研究利用分子靶标药的癌症治疗，该分子靶标药是将癌细胞中特异性表达的特定分子作为靶标来设计药物而进行治疗。能成为对于癌症的分子治疗药的靶标的分子可以列举钙粘着蛋白。钙粘着蛋白是作为钙依赖性地参与同种亲和性的细胞粘着的分子而发现的膜蛋白质(Yoshida andTakeichi, Cell 28:217-224，1982)。具有由相互同源性高的约110个氨基酸残基组成的 丐粘着蛋白重复序列(ECs)的蛋白质被称为I丐粘着蛋白超豕族，其中存在120种以上的蛋白质，它们对多细胞结构的维持发挥了重要的作用。报告了钙粘着蛋白在癌细胞中表达升高的例子，研究了对于与正常组织相比癌组织中的钙粘着蛋白的表达高的癌细胞，将使抗癌剂与识别钙粘着蛋白的抗体结合的药物、或具有抗体依赖性细胞毒性(ADCC Antibody-dependent cellular cytotoxicity)的抗体用于癌症的治疗(W02002/097395号公报、W02007/102525号公报)。属于钙粘着蛋白超家族的蛋白质根据其结构特征可以大体分类为1)经典钙粘着蛋白、2)桥粒钙粘着蛋白、3)原钙粘着蛋白、4)其他。作为钙粘着蛋白超家族的主要成员的经典钙粘着蛋白的相互同源性高(图I)。即，是形成二聚体的单次跨膜蛋白质，具有在细胞外区域中的EC1-EC5的5个钙粘着蛋白结构域及细胞内结构域。经由经典钙粘着蛋白的细胞粘着具有在同种细胞间粘着的特征，其通过细胞相互识别根据细胞种类而特异性地表达状态不同的同种钙粘着蛋白分子来进行。通过E-钙粘着蛋白识别E-钙粘着蛋白并与其结合，P-钙粘着蛋白识别P-钙粘着蛋白并与其结合的机制，同种细胞相互粘着(图2)。钙粘着蛋白相互的同种/异种的识别取决于位于细胞外结构域的N端的钙粘着蛋白结构域 I(ECl) (Nose A.等人，Cell 61:147-155，1990)。Klingel 等人揭示，当人P-钙粘着蛋白的氨基酸序列的第I位 第213位(序列编号2)替换人E-钙粘着蛋白的对应的区域时，其不与E-钙粘着蛋白结合，而与P-钙粘着蛋白结合(Klingel H.等人，Jof Cell Science 113:2829-36，2000)。这样可以认为，以E-钙粘着蛋白、P-钙粘着蛋白为代表的经典钙粘着蛋白通过相同的机制相互结合。近年来，作为分子靶标药的许多癌症治疗用抗体药物实际已上市并且正在提高治疗效果。抗体依赖性细胞毒性(ADCC)是作为已上市的抗癌剂的曲妥珠单抗(Trastuzumab)、利妥昔单抗(Rituximab)等的主要抗肿瘤机制,ADCC活性的增强关系到治疗效果的提高、副作用的降低等。因此，正在进行探索ADCC活性更高的抗体的研究、及增强ADCC活性的技术的开发。例如正在开发去除与抗体的Fe部分结合的糖链的末端的岩藻糖的技术(W000/61739号公报)、通过置换Fe部分的氨基酸来提高与效应细胞的亲和性并增强ADCC活性的技术(W02008/121160号公报)。如上所述，使用具有ADCC活性的抗体作为癌症的治疗药的概念是公知的。但是，虽然存在关于结构域结构和包含P-钙粘着蛋白的经典钙粘着蛋白的功能的关联的报告，但并未暗示ADCC活性的强度与经典钙粘着蛋白的结构的关联。现有技术文献 专利文献 专利文献I :W02002/097395号公报 专利文献2 W02007/102525号公报 专利文献3 W000/61739号公报专利文献4 W02008/121160号公报 非专利文献 非专利文献 I Yoshida and Takeichi, Cell 28 :217-224, 1982 非专利文献 2:Nose A.等人，Cell 61:147-155，1990 非专利文献 3 :Klingel H.等人，J of Cell Science 113:2829-36，2000。
本发明将提供具有高抗体依赖性细胞毒性的抗钙粘着蛋白抗体作为应解决的课题。本发明者为了解决上述课题而进行深入研究，对P-钙粘着蛋白抗体的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性进行测定后发现，其具有根据ADCC活性的强弱而分为2群的倾向。因此，根据各抗体识别的区域而进行分类后，判明ADCC活性强的抗体以高概率识别ECl的上游区域、钙粘着蛋白结构域4(EC4)或者钙粘着蛋白结构域5 (EC5)中的任一种。规定抗体的ADCC活性的要素可以列举抗体的Fe部分对效应细胞的Fe受体的亲和性、抗体对抗原的亲和性、抗体识别的表位。为了发挥ADCC活性，必须使抗体与抗原结合，并使效应细胞的Fe受体与抗体的Fe部位结合，但是推定，由于抗体结合的CDH3的区域的差异，效应细胞与抗体的Fe部位的结合存在空间限制，并产生ADCC活性的差异。本发明是根据这些发现而完成的。即，根据本发明，提供了以下发明。(I)抗钙粘着蛋白抗体，其识别ECl的上游区域、钙粘着蛋白结构域4(EC4)或者隹丐粘着蛋白结构域5 (EC5)中的任一I丐粘着蛋白结构域,且抗体浓度为Iy g/mL时的抗体依赖性细胞毒性为30%以上。(2)根据⑴所述的抗体，其中钙粘着蛋白为P-钙粘着蛋白。(3)根据(I)或(2)所述的抗体，其是从将可溶型P-钙粘着蛋白作为免疫原而给予的免疫动物取得的抗体产生细胞所产生的抗体。(4)根据⑴至(3)中任一项所述的抗体，其为单克隆抗体。(5)杂交瘤，其产生根据(4)所述的抗体。(6)细胞毒剂，其包含根据⑴至⑷中任一项所述的抗体。(7)根据(6)所述的细胞毒剂，其给予癌细胞。另外，本说明书中的ECl的上游区域表示E-钙粘着蛋白、P-钙粘着蛋白、N-钙粘着蛋白的ECl的上游侧24个氨基酸残基的区域、以及其他的钙粘着蛋白的对应区域。本发明的抗钙粘着蛋白抗体的特征是识别钙粘着蛋白的ECl的上游区域、钙粘着蛋白结构域4(EC4)或者钙粘着蛋白结构域5 (EC5)中的任一钙粘着蛋白结构域，且具有高抗体依赖性细胞毒性。能够发挥高细胞毒性的抗体用作用于制备修饰抗体、变异抗体的材料。另外，通过将本发明的抗钙粘着蛋白抗体给予表达钙粘着蛋白的癌症，可以发挥以抗体依赖性细胞毒性为机制的抗癌作用。即，本发明的抗钙粘着蛋白抗体用作抗癌剂。

图I示出除了 E-钙粘着蛋白(⑶HI)、N_钙粘着蛋白(⑶H2)、P_钙粘着蛋白(CDH3)的信号及前肽序列的成熟蛋白质的序列。图2示出属于经典钙粘着蛋白家族的分子的粘着机制。
图3示出使人CDH3强制表达细胞系和市售抗人CDH3抗体反应的流式细胞术的结果。A :CDH3强制表达CHO细胞、B =CHO细胞。a :抗CDH3抗体0. 01 u g/ml、b :抗CDH3抗体0. I u g/ml、c :抗 CDH3 抗体 I u g/ml。图4示出3例取得抗体和各细胞系的典型的流式细胞术结果。A :⑶H3强制表达CHO细胞、B =CHO细胞、C :源自肺癌的细胞系NCI-H358。a :抗CDH3抗体0. 01 u g/ml、b :抗CDH3 抗体 0. I u g/ml、c :抗 CDH3 抗体 I u g/ml。图5示出各抗体的ADCC活性。图6示出⑶H3部分长度蛋白质片段I 5与⑶H3细胞外区域的对应。图7示出CDH3部分长度蛋白质的表达结果。A :片段1、B :片段2、C :片段3、D 片段4、E:片段5。图8示出⑶H3部分长度蛋白质与各抗体通过蛋白质印迹法的反应。A :片段1、B 片段2、C :片段3、D :片段4、E :片段5。图9示出使用肽阵列的PPMX13的表位解析的结果。X轴的数值表示肽阵列的编号。A :PPMX13、B :无初次抗体。图10示出各种肿瘤组织的⑶H3的mRNA的表达结果。A :正常组织、B :各种癌组织、C :胰腺癌分化度。图11示出各种肿瘤组织中的⑶H3的表达结果。图12示出在移植源自人肺癌的细胞系NCI-H351得到的异种移植物中，PPMX12产生抗体的抗肿瘤效果。图13示出在移植源自人胰腺癌的细胞系PK-45P得到的异种移植物中，PPMX12产生抗体的抗肿瘤效果。图14示出在移植源自人皮肤癌的细胞系A431得到的异种移植物中，PPMX12产生抗体的抗肿瘤效果。

ECl的上游区域序列编号2的氨基酸序列的第108位 第131位 钙粘着蛋白结构域I (ECl):序列编号2的氨基酸序列的第132位 第236位 钙粘着蛋白结构域2 (EC2):序列编号2的氨基酸序列的第237位 第348位 钙粘着蛋白结构域3 (EC3):序列编号2的氨基酸序列的第349位 第461位 钙粘着蛋白结构域4 (EC4):序列编号2的氨基酸序列的第462位 第550位 钙粘着蛋白结构域5 (EC5):序列编号2的氨基酸序列的第551位 第654位。E-钙粘着蛋白(CDHl)
ECl的上游区域序列编号4的氨基酸序列的第155位 第178位 钙粘着蛋白结构域I (ECl):序列编号4的氨基酸序列的第179位 第283位 钙粘着蛋白结构域2 (EC2):序列编号4的氨基酸序列的第284位 第395位 钙粘着蛋白结构域3 (EC3):序列编号4的氨基酸序列的第396位 第507位 钙粘着蛋白结构域4 (EC4):序列编号4的氨基酸序列的第508位 第597位 钙粘着蛋白结构域5 (EC5):序列编号4的氨基酸序列的第598位 第704位。N-钙粘着蛋白(CDH2)
ECl的上游区域序列编号6的氨基酸序列的第160位 第183位 钙粘着蛋白结构域I (ECl):序列编号6的氨基酸序列的第184位 第288位 钙粘着蛋白结构域2 (EC2):序列编号6的氨基酸序列的第289位 第402位 钙粘着蛋白结构域3 (EC3):序列编号6的氨基酸序列的第403位 第518位 钙粘着蛋白结构域4 (EC4):序列编号6的氨基酸序列的第519位 第607位 钙粘着蛋白结构域5 (EC5):序列编号6的氨基酸序列的第608位 第719位。抗体依赖性细胞毒性(ADCC活性)可以使用公知的方法测定。本说明书的ADCC活性的数值是指在与实施例4中的测定相同的条件下测定时的抗体依赖性细胞毒性。具体 地，如下所述。(I)效应细胞的制备从C3H/HeJ Jcl小鼠(8周龄、雄性、日本CLEA公司)的股骨采集骨髄细胞，将该细胞在含有 10%FBS 的 RPMI1640 培养基中制备成 2 X IO6 个 /mL，在 50ng/mL 人 IL_2 (PEPROTECH公司)、10ng/mL小鼠GM-CSF (PEPROTECH公司)存在下培养6天。在测定当天回收细胞，使用含有10%FBS的HAM培养基清洗后，制成效应细胞溶液。(2)靶标细胞的制备
使用全长⑶H3表达CHO细胞(EXZ1501)作为靶标细胞。将细胞从板上剥离后，将其悬浮于含有10%FBS的HAM培养基中使其达到I X IO7个/mL，添加51Cr以达到终浓度150uCi，在5% 二氧化碳培养箱中在37°C培养I. 5小时。将该细胞用培养基清洗2次后，添加含有10%FBS的HAM培养基，种植于96孔U形底板(NUNC公司)中使其达到I X IO4个/孔，制成靶标细胞。(3) ADCC活性的测定
在靶标细胞中以50 ii L/孔分开注入分别制备成0. 001 u g/mL、0. 01 u g/mL、0. I u g/mL、I u g/mL浓度的抗体溶液后,在室温下温育15分钟，接着，分开注入100 u L效应细胞(IXlO5细胞/孔)，在二氧化碳培养箱中培养4小时。回收培养上清液，利用闪烁计数器测定100 u L培养上清液中的放射活性。细胞毒性可以根据下式求出。
细胞毒性(%) = (A - C) / (B - C) X 100A :各抗体添加孔的放射活性值(cpm)
B :在靶标细胞中添加100 ii L的2%NP40溶液、50 u L含有10%FBS的RPMI培养基的孔的放射活性值(cpm)
C :在靶标细胞中添加包含效应细胞的150 y L含有10%FBS的培养基的孔的放射活性值(cpm)。本发明的抗体识别的钙粘着蛋白的种类期望的是经典钙粘着蛋白。其例子可以列举E-钙粘着蛋白、N-钙粘着蛋白、P-钙粘着蛋白，但并不限定于这些。用以制备本发明的抗体的抗原可以使用钙粘着蛋白或其部分肽。一个例子是可以使用可溶型CDH3蛋白质等，但并不限定于此。本发明的抗体可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体。本发明的抗体(多克隆抗体及单克隆抗体)可以通过各种方法中的任意一种来制造。这样的抗体的制造法在本领域中为众所周知[例如参照Sambrook, J等人，Molecular Cloning, Cold Spring HarborLaboratory Press (1989)]。(a)多克隆抗体的制备
为了制备多克隆抗体，将钙粘着蛋白或作为其部分肽的ECl的上游区域、钙粘着蛋白结构域4(EC4)或者钙粘着蛋白结构域5 (EC5)中的任一钙粘着蛋白结构域优选地作为抗原，并将该抗原给予哺乳动物例如大鼠、小鼠、兔等。每只动物的抗原给予量在不使用佐剂时为0. Img lOOmg，在使用佐剂时为Iiig IOOii g。佐剂可以列举弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂(FIA)、氢氧化铝佐剂等。免疫主要通过注入静脉内、皮下、腹腔内等来进行。另外，免疫的间隔并无特别限定，以数天至数周间隔、优选2周 5周间隔，进行I次 10次、优选2次 5次免疫。然后，从最后的免疫日起6天 60天后，利用酶免疫测定法(ELISA (酶联免疫吸附测定)或EIA (酶免疫测定))、放射性免疫测定法(RIA ;放射免疫测定)等测定抗体效价，在显示最大的抗体效价的当天采血，获得抗血清。在需要从抗血清纯化抗体时，可以通过适当选择硫酸铵盐析法、离子交换色谱法、凝胶过滤、亲和色谱法等公知的方法或将这些方法加以组合而纯化。(b)单克隆抗体的制备
为了制备单克隆抗体，首先，将钙粘着蛋白或作为其部分肽的ECl的上游区域、钙粘着蛋白结构域4(EC4)或者钙粘着蛋白结构域5 (EC5)中的任一钙粘着蛋白结构域优选地作为抗原，并给予哺乳动物例如大鼠、小鼠、兔等。每只动物的抗原的给予量在不使用佐剂时为0. Img lOOmg，在使用佐剂时为Iii g IOOii g。佐剂可列举弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂(FIA)、氢氧化铝佐剂等。免疫主要通过注入静脉内、皮下、腹腔内来进行。另外，免疫的间隔并无特别限定，以数天至数周间隔、优选2周 5周间隔，进行I次 10次、优选2次 5次免疫。然后，从最后的免疫日起I天 60天后、优选I天 14天后采集抗体产生细胞。抗体产生细胞可列举脾脏细胞、淋巴结细胞、末梢血细胞等，优选脾脏细胞或局部淋巴结细胞。为了获得细胞融合杂交瘤，进行抗体产生细胞与骨髓瘤细胞的细胞融合。与抗体 产生细胞融合的骨髓瘤细胞可以使用小鼠等动物的一般可得的确立细胞株。所使用的细胞系优选具有药物选择性，并且具有在未融合的状态下无法在HAT选择培养基(包含次黄嘌呤、氨基喋呤、胸苷)中生存、而仅可在与抗体产生细胞融合的状态下生存的性质的细胞系。骨髓瘤细胞例如可以列举？3乂634§.8.仍( 3仍)、吧-1等小鼠骨髓瘤细胞系。接着，使上述骨髓瘤细胞和抗体产生细胞进行细胞融合。细胞融合是在不含血清的DMEM、RPMI-1640培养基等动物细胞培养用培养基中，将IX IO6个/ml IX IO7个/ml的抗体产生细胞和2X IO5个/ml 2X IO6个/ml的骨髓瘤细胞混合(抗体产生细胞和骨髓瘤细胞的细胞比优选为5 :1)，在细胞融合促进剂存在下进行融合反应。细胞融合促进剂可以使用平均分子量为1000道尔顿 6000道尔顿的聚乙二醇等。另外，也可以使用利用电刺激(例如电穿孔)的市售细胞融合装置使抗体产生细胞和骨髓瘤细胞融合。从细胞融合处理后的细胞挑选目标杂交瘤。挑选的方法是使用例如含有胎牛血清的RPMI-1640培养基等将细胞悬浮液适当稀释后，在微量滴定板上以3X IO5个/孔左右在各孔中添加选择培养基，以后适当地更换选择培养基进行培养。其结果是在使用选择培养基培养开始后，可以获得从14天前后繁殖的细胞作为杂交瘤。接着，在增殖的杂交瘤的培养上清液中，筛选是否存在目标抗体。杂交瘤的筛选根据通常的方法进行即可，并无特别限定。例如，可以采集繁殖为杂交瘤的孔中所含的培养上清液的一部分，利用酶免疫测定法、放射性免疫测定法等，筛选产生与钙粘着蛋白的ECl的上游区域、EC4或者EC5结构域结合的抗体的杂交瘤。融合细胞的克隆可以利用限度稀释法等来进行，最后确立作为单克隆抗体产生细胞的杂交瘤。从所确立的杂交瘤采集单克隆抗体的方法可以采用通常的细胞培养法或腹水采集法等。在细胞培养法中，将杂交瘤在含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基、MEM培养基或无血清培养基等动物细胞培养培养基中，在通常的培养条件(例如37°C、5%的CO2浓度)下培养7天 14天，并从其培养上清液取得抗体。在使用腹水采集法的情况下，在提供骨髓瘤细胞的哺乳动物和同种系动物的腹腔内给予约I X IO7个杂交瘤，并使杂交瘤大量地增殖。接着，在I周 2周后采集腹水。在上述抗体的采集方法中需要抗体纯化时，可以通过适当选择硫酸铵盐析法、离子交换色谱法、凝胶过滤、亲和色谱法等公知的方法，或将这些方法加以组合来纯化。本发明的抗体的种类并无特别限制，可以是小鼠抗体、人抗体、大鼠抗体、兔抗体、羊抗体、骆驼抗体、鸡抗体等，或为了降低针对人的异种抗原性等而人为改变的基因重组型抗体例如嵌合抗体、人化抗体等的任意一种。基因重组型抗体可以使用已知的方法来制造。嵌合抗体是包含人以外的哺乳动物例如小鼠抗体的重链、轻链的可变区和人抗体的重链、轻链的恒定区的抗体，该抗体可以通过将编码小鼠抗体的可变区的DNA和编码人抗体的恒定区的DNA连接，并将该DNA整合入表达载体并导入宿主中而产生抗体来获得。人化抗体是将人以外的哺乳动物例如小鼠抗体的互补性决定区(CDR)移植至人抗体的互补性决定区所得的抗体，其通常的基因重组方法也是已知的。具体而言，利用PCR法，由制备成末端部具有重叠的部分的多个寡核苷酸，合成设计为连接小鼠抗体的CDR和人抗体的骨架区(framework region ；FR)的DNA序列。将所得的DNA和编码人抗体的恒定区的DNA连接，接着整合入表达载体，将表达载体导入宿主而产生抗体(EP239400号公报、国际公开W096/02576号公报等)。 另外，人抗体的取得方法也为已知。例如也可以使人淋巴细胞在体外通过所期望的抗原或者表达所期望的抗原的细胞致敏，使致敏淋巴细胞和人骨髓瘤细胞例如U266融合，获得对抗原具有结合活性的所期望的人抗体(参照日本特公平1-59878)。另外，可以通过利用所期望的抗原对具有人抗体基因的全部组分的转基因动物进行免疫，取得所期望的人抗体(参照 W093/12227、W092/03918、W094/02602、W094/25585、W096/34096、W096/33735)。而且，使用人抗体文库，通过淘选而取得人抗体的技术也为已知。例如，可以将人抗体的可变区作为单链抗体(scFv)通过噬菌体展示法在噬菌体的表面表达，选择与抗原结合的噬菌体。如果解析所选择的噬菌体的基因，则可以确定编码与抗原结合的人抗体的可变区的DNA序列。如果清楚了与抗原结合的scFv的DNA序列，则可以由该序列制备适当的表达载体而取得人抗体。这些方法已经为众所周知，可以参考W092/01047、W092/2079U W093/06213, W093/11236, W093/19172, W095/01438, W095/15388。另外，这些抗体只要不丧失作为识别ECl的上游区域、钙粘着蛋白结构域4(EC4)或者钙粘着蛋白结构域5 (EC5)中的任一钙粘着蛋白结构域，且抗体浓度为I U g/mL时的抗体依赖性细胞毒性为30%以上，识别ECl的上游区域、钙粘着蛋白结构域4(EC4)或者钙粘着蛋白结构域5(EC5)中的任一I丐粘着蛋白结构域,且抗体浓度为0. I ii g/mL时的抗体依赖性细胞毒性为25%以上(例如强于PPMX5的活性)的抗体，或者识别ECl的上游区域、钙粘着蛋白结构域4(EC4)或者钙粘着蛋白结构域5 (EC5)中的任一钙粘着蛋白结构域，且ADCC的最大活性为35%以上(例如强于PPMX6的活性)的抗体的特性，则可以为一价抗体、二价抗体、多价抗体中的任一种抗体，也可以为抗体片段(fragment)等低分子化抗体或抗体的修饰物等。另外还可以为在抗体片段或低分子化抗体例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、ScFv(单链Fv)、双抗体等中融合Fe部分而赋予ADCC活性的抗体。为了获得这样的抗体，构建编码这些抗体的基因、将所构建的基因导入表达载体后在适当的宿主细胞中表达即可。抗体的修饰物也可以使用与聚乙二醇(PEG)等各种分子结合的抗体。另外，也可以在抗体中结合放射性同位素、化学治疗剂等，特别地，放射性标记抗体是有用的。这样的抗体修饰物可以通过对所得的抗体实施化学修饰而获得。另外，抗体的修饰方法也为本领域技术人员所公知。
本发明的抗体由于表现出高抗体依赖性细胞毒性，所以可以作为细胞毒剂使用。本发明的细胞毒剂可以通过与例如表达钙粘着蛋白的癌细胞接触而伤害癌细胞。本发明的细胞毒剂中，除了本发明的抗体外，还可以根据需要适当含有药学上所容许的载体、赋形剂、稀释剂等。本发明的细胞毒剂例如可以制成注射剂。对于本发明的细胞毒剂的给予量，依赖于患者的症状的程度、年龄及体重、给予方法等，作为有效成分的抗体的重量通常在约IOng 约100mg/kg体重的范围。通过以下的实施例更具体地对本发明进行说明，但本发明并不受实施例限定。实施例
实施例I :⑶H3表达CHO细胞系的确立 为了获得抗CDH3抗体筛选用细胞系，进行表达全长CDH3的CHO细胞的确立。(I)⑶H3基因表达载体的制备
为了将序列编号I所示的全长人⑶H3DNA插入哺乳类表达载体pEF4/myc-HisB (Invitrogen 公司)，利用 2 种限制酶 Kpn I (Takara Bio 公司)及 Xba I (TakaraBio公司)将该DNA在37°C处理I小时后，利用T4 DNA连接酶(Promega公司)根据常用方法将该DNA插入利用相同的Kpn I及Xba I处理的pEF4/myC-HisB中，获得表达载体pEF4-CDH3-myc-His。(2)⑶H3稳定表达系的取得
根据FuGENE(注册商标)6转染试剂(Roche Diagnostics公司)的方案，在转染前一天在尺寸IOcm皿中种植8X105个细胞的CHO细胞并培养一晚后，将g的表达载体 pEF4-CDH3-myc-His 和 16 y L 的 FuGENE6 试剂在 400 y L 的无血清 RPMI1640 培养基(SIGMA-ALDRICH公司)中混合并室温放置15分钟后，将其添加至细胞培养液中进行转染。在转染第三天使用选择试剂(Zeocin(注册商标))通过限度稀释法进行克隆。CDH3全长表达CHO的克隆分选通过使用抗c_Myc单克隆抗体(SANTA CRUZBIOTECHNOLOGY公司)的蛋白质印迹法来进行，其结果是，获得表达量高、且增殖良好的⑶H3全长表达CHO细胞系(EXZ1501)。使用市售抗⑶H3抗体(R & D SYSTEMS公司)并利用流式细胞术所测定的该细胞系的结果示于图3中。实施例2 可溶型⑶H3抗原的制备
为了获得制备抗CDH3抗体的免疫原，制备使C末端跨膜区域及其以后区域缺损的可溶型CDH3(sCDH3)蛋白质。(I)可溶型⑶H3抗原表达载体的制备
将CDH3全长cDNA作为模板，使用设计为使相当于CDH3细胞外区域的部分(相当于序列编号2的1-654、以下为s⑶H3cDNA)扩增的正向引物(序列编号 7 :CGCGGTACCATGGGGCTCCCTCGT、 (hCDH3FullFW))和反向引物(序列编号 8:CCGTCTAGATAACCTCCCTTCCAGGGTCC、 (hCDH3SolbRV))进行 PCR 反应。反应中使用KOD-Plus (东洋纺公司)，在94°C -15秒、55°C -30秒、68°C -90秒、30个循环的反应条件下进行。然后，通过琼脂糖凝胶电泳切出包含作为目标尺寸的约2. Okbp的条带的凝胶片段，使用QIA (注册商标)快速凝胶提取试剂盒(QIAGEN公司)，获得目标sCDH3cDNA。为了将该sCDH3cDNA插入表达用载体pEF4/myc-HisB，使用2种限制酶KpnI及XbaI将该cDNA处理后，使用T4 DNA连接酶根据常用方法将该cDNA插入使用相同的KpnI及 XbaI 处理的 pEF4/myc_HisB 中，获得表达载体 pEF4-sCDH3-myc_His。(2)可溶型⑶H3蛋白质的表达
根据FuGENE6转染试剂的方案，在转染前一天在尺寸IOcm的皿中种植8 X IO5个CHO细胞并培养一晚后，将8 ii g的表达载体pEF4-sCDH3-myc-His和16 y L的FuGENE6试剂于400 u L的无血清RPMI1640培养基中混合，室温放置15分钟后，将其添加于细胞培养液中进行转染。在转染第三天使用选择试剂(Zeocin)通过限度稀释法进行克隆。可溶型⑶H3表达CHO细胞的分选通过使用抗c-Myc单克隆抗体(SANTA CRUZBIOTECHNOLOGY公司)的蛋白质印迹法来进行。选择向培养上清液中的分泌量多且增殖良好的细胞系，结果获得可溶型CDH3表达CHO细胞系(EXZ1702)。对于所选择的可溶型CDH3表达CHO细胞系(EXZ1702)，使用3个培养面积为1，500cm2的滚瓶，在每个滚瓶的333mL无 血清培养基CHO-S-SFM-II (Invitrogen公司)中培养72小时，并回收培养上清液。从所得的培养上清液中，通过利用HisTrap (注册商标)HP柱(GE HEALTHCARE BIO SCIENCES公司)的亲和色谱法和利用Superdex (注册商标)200pg柱(GE HEALTHCARE BIO SCIENCES公司)的凝胶过滤色谱法，获得可溶型CDH3蛋白质。实施例3 抗⑶H3单克隆抗体的制备
(I)将可溶型CDH3蛋白质作为免疫原的单克隆抗体的制备
通过将溶解于生理盐水中的50ii g的可溶型⑶H3蛋白质和Titer-MAX Gold(注册商标)(TiterMax公司)等量混合，并注射至MRL/lpr小鼠(日本SLC株式会社)的腹腔内及皮下而进行初次免疫。第2次及以后的免疫通过将同样制备的相当于25 u g蛋白质量的可溶型⑶H3蛋白质和Titer-MAX Gold混合并注射至腹腔内及皮下而实施。从最后免疫起3天后从小鼠无菌性地制备脾脏细胞，根据常用方法，通过聚乙二醇法进行与小鼠骨髓瘤细胞 SP2/0-Agl4 或 P3-X63-Ag8. 653 的细胞融合。(2)抗⑶H3抗体产生杂交瘤的分选
抗⑶H3抗体的分选利用使用表达全长⑶H3的CHO细胞系(EXZ1501)的流式细胞术来进行。S卩，通过使用2mM的EDTA-PBS处理表达全长CDH3的CHO细胞系(EXZ1501)而将CHO细胞系从培养板剥离后，将CHO细胞系悬浮于FACS溶液中使其达到I X IO6个/mL。将该细胞悬浮液种植至96孔板中使其达到50 y L/孔，添加杂交瘤培养上清液在4°C下反应60分钟，使用FACS溶液(200 y L/孔)清洗2次后，添加AlexaFluor488标记抗小鼠IgG山羊F(ab’)JInvitrogen公司)，在4°C下反应30分钟。然后使用FACS溶液清洗2次后，实施流式细胞术，分选对CDH3表达CHO细胞见到强反应的杂交瘤。将由该杂交瘤获得的抗体与⑶H3表达CHO细胞(EXZ1501)、作为亲株的CHO细胞及确认CDH3为高表达的癌细胞NCI-H358的典型的反应结果示于图4中。确认了所分选的所有杂交瘤与⑶H3表达CHO细胞(EXZ1501)及NCI-H358反应，而不与CHO细胞反应。实施例4 抗⑶H3抗体的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性的测定
ADCC活性的测定是根据使经放射性标记的靶标细胞在效应细胞存在下与抗体作用、测定其游离放射活性的方法。(I)效应细胞的制备从C3H/HeJ Jcl小鼠(8周龄、雄性、日本CLEA公司)的股骨采集骨髄细胞，将该细胞在含有 10%FBS 的 RPMI1640 培养基中制备为 2 X IO6 个 /mL，在 50ng/mL 人 IL_2 (PEPROTECH公司)、10ng/mL小鼠GM-CSF (PEPROTECH公司)存在下培养6天。在测定当天回收细胞，使用含有10%FBS的HAM培养基清洗后，制成效应细胞溶液。(2)靶标细胞的制备
靶标细胞使用全长⑶H3表达CHO细胞(EXZ1501)。将细胞从板剥离后，将其悬浮于含有10%FBS的HAM培养基中使其达到I X IO7个/mL，添加51Cr以达到终浓度150uCi，在5%二氧化碳培养箱中在37°C培养I. 5小时。将该细胞用培养基清洗2次后，添加含有10%FBS的HAM培养基，种植于96孔U形底板(NUNC公司)中使其达到I X IO4个/孔，制成靶标细胞。(3) ADCC活性的测定在靶标细胞中以50 ii L/孔分开注入分别制备成0. 001 u g/mL、0. 01 u g/mL、0. I u g/mL、I u g/mL浓度的抗体溶液后,在室温下温育15分钟，接着，分开注入100 u L效应细胞(IXlO5细胞/孔)，在二氧化碳培养箱中培养4小时。回收培养上清液，利用闪烁计数器测定100 u L培养上清液中的放射活性。此时，根据下式求出细胞毒性。
细胞毒性(%) = (A - C) / (B - C) X 100A :各抗体添加孔的放射活性值(cpm)
B :在靶标细胞中添加100 ii L的2%NP40溶液、50 u L含有10%FBS的RPMI培养基的孔的放射活性值(cpm)
C :在靶标细胞中添加包含效应细胞的150 y L含有10%FBS的培养基的孔的放射活性值(cpm)。对试验进行3次重复测定，由其平均值算出细胞毒性(%)。将试验结果示于表I及图5中。在具有ADCC活性的抗体中发现了具有特别强的活性的抗体群。将抗体浓度为I U g/mL时的ADCC活性为30%以上的抗体设为高ADCC活性群，将抗体浓度为I U g/mL时的ADCC活性小于30%的抗体设为低ADCC活性群。[表 I]


本发明的目的是提供具有高抗体依赖性细胞毒性的抗钙粘着蛋白抗体。根据本发明，提供识别EC1的上游区域、钙粘着蛋白结构域4(EC4)或者钙粘着蛋白结构域5(EC5)中的任一钙粘着蛋白结构域，且抗体浓度为1μg/mL时的抗体依赖性细胞毒性为30%以上的抗钙粘着蛋白抗体。