专利名称：干粉血纤蛋白密封剂的制作方法W097/44015描述一种基于血纤蛋白原和凝血酶微粒的干粉血纤蛋白密封剂。这些微粒组合物的进ー步优化的制剂描述于同在申请中的非临时申请US 12/636,718中，该申请在此引入作为參考。在该申请的实施例中，组分通过喷雾干燥带有海藻糖的血纤蛋白原 和带有海藻糖的凝血酶来制备。各种产品具有最多50 μ m直径的主要粒径。所述血纤蛋白密封剂、这些组分的共混物已被证明是ー种易于使用、稳定并且有效的局部止血剤。所述产品可以不经重建就立即使用。当与含水流体例如血液接触时，暴露和/或溶解的活性凝血酶就将暴露和/或溶解的血纤蛋白原转化成不溶性血纤蛋白聚合物。正在开发用于出血以及出血和/或溢血控制的新技术、装置和药物。即使有目前可用的所有技术，但出血和溢血控制仍然是紧急医疗救护中的主要未解決的问题。在住院治疗的头48小时内所有死亡的几乎50%与不能充分控制出血有夫。在头24小时内止血失败几乎通常是致命的，尤其是当涉及多个外伤位置吋。普遍认可的是在战区用于前线救护的止血产品必须迅速控制出血、易于使用、应用简单、具有接近两年的储存寿命并且防止细菌或病毒传播。为了符合军事和民用要求，产品的止血作用的时间很关键。现今作为创伤治疗的外部方法研究或使用的装置为包含凝血剂的吸收垫、压カ绷带、纱布、用于四肢的止血帯，和用于身体创伤的外伤药盒。设计用于停止外部出血的试剂在组成上不同并且组分被设计为在应用位置有助于快速形成血凝块。凝血产品通常包含高浓度的材料例如人的血纤蛋白原、凝血酶、钙、因子XIII和/或抗溶血纤蛋白药。除了血纤蛋白外，微孔多糖大球、矿物和合成沸石，和壳聚糖(聚-N-こ酰基葡糖胺)也有效用作止血剤。许多止血产品有效用于治疗创伤外伤，例如使用壳聚糖(脱こ酰化聚-N-こ酰基葡糖胺基质，HemCon Inc. , Tigard, Oreg.)的绷带产品。然而，其只有18个月的储存寿命并且其成本令人望而却步。Z-MedicaCorporation, Wallingford, Conn.,市售一种压カ绷带产品(QuikClot)用于美国军队使用。该产品使用粒状合成矿物沸石以通过吸附液体和促进凝血来止血。然而，QuikClot产生热，如果绷带不能正确应用，则可能造成燃烧。ActSys Medical Inc. , Westlake Vvillage, Calif.提供一种止血纱布产品ActCel，其是ー种由化学处理的纤维素产生的类似胶原的天然物质。当与血液接触时，其的原始尺寸膨胀3 — 4倍，由此封锁损伤的血管并且有助于凝血。Medafor Inc. , Minneapolis, Minn.出售一种生物惰性的微孔多糖大球产品,其由马铃薯合成，被称为TraumaDEX。该粉末状微孔聚合物产品通过在创伤位置膨胀并且使血液脱水来止血,其中身体在48小时内吸收该材料。另ー种非-绷带方法使用包含亲水聚合物和钾盐的非-沸石局部粉末(QuickRelief, Sarasota, Fla.)，其在应用后当粉末接触血液并且施加轻微压カ时产生柔性保护结痂，覆盖创伤位置。目前对于过多出血的治疗而言没有完美的解决方案。关于ー类试剂的生热是主要问题。当用于深的创伤或不规则形状的创伤时敷料有效粘附的能力产生另ー个主要的限制。如同来自动脉出血的压カ出血的治疗和控制那样，处理过多血液的能力是另ー个缺陷。外科手术和外伤创伤是在创伤护理领域中解决的最常见的创伤类型。现有的绷带由纱布制成并且通常与弾性绷带组合使用。它们允许创伤呼吸但对于随后的污染而言是差的阻隔。这些绷带不能停止严重出血并且在动脉出血的情形下需要加压。传统的创伤密封剂不能表现出凝血速度、压カ出血条件下的有效性和响应于外伤位置的需求随着时间动态 的血凝块的优化组合。典型的创伤密封剂通常与单个创伤敷料组合使用。显然，由尖鋭物体造成的外科手术外伤在干净环境中出现。然而，没有在控制的环境中造成的外伤创伤通常为在道路交通事故或者在战场发现的中等尺寸、分布广并且具有显著组织损伤的脏的创伤。擦伤通常由皮肤外层的刮擦造成；裂ロ是有缺ロ的不规则的皮肤切ロ或裂ロ ；穿孔由刺穿皮肤层产生小孔的物体造成；切ロ是普遍由小刀或其他尖鋭物体造成的切ロ ；和燃烧造成深度、尺寸和严重性可能极大变化的损害。由于火器的创伤可能深并且具有显著的组织破坏。由于外伤的肢解需要立即介入以停止来自严重的肢体的血液损失。非处方(OTC)消费市场可获得液体绷带制剂。液体绷带制剂通常用于覆盖和保护轻微的裂口和擦伤、摩擦水泡和纸切ロ。当用于皮肤时，溶液蒸发在应用区域形成保护膜并且促进愈合。与传统敷料相比，聚合的膜覆盖产生潮湿创伤愈合环境，増加创伤愈合。大多数液体绷带制剂声称停止轻微出血、在创伤上产生保护密封，并且排出水、污物和细菌。这些制剂通常充当常见微生物有机体和其他污染形式的机械阻隔。液体绷带产品可从许多商业来源获得并且包括 New Skin Liquid Bandage、Nexcare Bandages Spray LiquidBandage、J&J的Liquid Bandage>Skin Shield Liquid Bandage Curad Spray Bandage。粉末基止血剂也是广泛获得的OTC产品，例如QuikClot(Z_Medica)、Urgent QR和NosebleedQR (BIOLIFE)、TraumaDEX 和 Bleed-X (Medafor)>Celox (MEDTRADE Biopolymers)>ActCel(ActSys Medical),和 Quick Relief。W096/17633描述了组织密封剂，包括血纤蛋白绷带。在该WO公开所述的用于产生绷带的方法中，使活性组分在几个层中冻干，所述层通过闭合的背衬支承。因此，活性组分没有均匀混合贯穿绷帯。EP1073485 (Zymogenetics)描述了完全重组的组织密封剂组合物，但没有提及干粉形式。
根据本发明的血纤蛋白密封剂属于W097/44105中所述的一般类型，并且这些微粒组合物的进ー步优化的制剂描述于同在申请中的申请US 12/636,718中，该申请在此引入作为參考。这些微粒共混物可以任选地另外包含生物相容、吸水、水可溶胀的添加剂材料，或水溶性添加剂材料或者生物相容的吸水ニ氧化硅添加剂材料。添加剂材料可以充当载体或稀释剂，可以增强粉末流动和润湿能力，并且还可以具有增强出血创伤的流体吸收的效果，由此减少局部组织液并且因此增加创伤中凝血因子的相对浓度。由此，増加了血纤蛋白密封剂的效力。本发明还提供在低血纤蛋白原水平下具有功效的血纤蛋白密封剂产品O附图简述图I肝脏扇形(scallop)损伤模型。IA表示产生的损伤；1B表示使用的Sephadex-共混的Fibrocaps ,和IC表示在用纱布加压30秒后覆盖粉末的Vicryl片。图2在猪穿刺活组织模型中各种止血剂对止血时间(TTH)的影响。图3与Surgicel相比，Fibrocaps减少了血液损失。 图4在猪-脾穿刺活组织模型中，与单独的Surgicel相比，Fibrocaps+Surgicel减少了 TTH。图5在猪脾穿刺活组织模型中，与单独的Surgicel相比,Fibrocaps+Surgicel减少了血液损失。图6 与单独的 Avitene 或 Surgicel 相比，Fibrocaps+Avitene 减少了 TTH。图7在兔肝脏模型中，Fibrocaps和Avitene减少了血液损失。图8在猪肝穿刺活组织模型中类似的出血率。图9与单独的Spongostan相比，Fibrocaps或凝血酶以及Spongostan缩短了 TTH。详述本发明的组合物可以符合以下主要目的实现好的流动性能、增强的润湿能力和增强的有效输送到活性位置，和仅在该位置而不在输送系统中溶解。血纤蛋白原和凝血酶可以从来自捐赠人的血液中分离，或者更优选地在培养的细胞或转基因的动物或植物中通过重组DNA技术制备。血纤蛋白原或凝血酶可以是全长的野生型(对于血纤蛋白原为625或621氨基酸)或者其的任何活性片段。片段是已知的；參见Coller等，J. Clin.Invest. 89:546-555(1992) ο还可以使用变体形式。血纤蛋白原的特别合适的变体形式包括作为可变剪接的结果的变体，例如所谓的Yprime ( Y ’变体)和a-ext Fib或Fib420变体。血纤蛋白原原料可以是冷冻溶液，尽管可以使用在喷雾干燥前需要重组的冻干粉末。在包含其的微粒中，血纤蛋白原的含量可以为约O. I 一 50%w/w，优选约O. 5 —20%w/w，以及5 — 10%w/w,或者约6. 5%w/w。在包含其的微粒中，凝血酶的含量可以为约10 一 20，000IU/g，优选约 25 — 1000IU/g，或者 100 — 500IU/g，或者约 270IU/g。含活性物质的微粒和/或添加剂材料可以为固体或中空，例如在微胶囊的情形中。包含血纤蛋白原或凝血酶的微粒可以通过本领域已知的，例如描述于W092/18164、W096/09814、W096/18388或W097/44015中的方法制备。这些喷雾干燥和相关的颗粒控制方法使得能够制得具有规定的尺寸分布，例如直径至多50微米的可溶蛋白质微胶囊。例如在那些文献中所述,可以重复制备例如90%或更多(以体积计)尺寸至多30 μ m，例如10 —20μ m的微粒。正如将被本领域技术人员理解的，通过将喷雾干燥机中的空气流动模式调节成逆流-并流，或者将多个喷雾器排列成“強制初级聚集”的设置，可以现场制得这些容易流动的聚集体。这些聚集体可以为50 — 1000微米或者100 — 500微米，或者125 — 250微米直径。如W003/037303中所述，通过使用多喷嘴喷雾器，可以在喷雾干燥设备中将各自的含血纤蛋白原和含凝血酶的可溶微粒一起配制并且共混。尽管制备干粉制剂的优选方法包括喷雾干燥，但其他干燥技术也可用于制备干粉制剂。合适的方法是本领域已知的并且包括流化床干燥和冷冻干燥以及随后的微粉化，或者通过喷雾-冷冻干燥。如果必要或希望，可以使用本领域已知的技术将微粒灭菌。本发明的微粒优选通过喷雾干燥制备。一般而言，使用2-流体喷嘴，其在喷雾エ艺期间使用压缩空气；这导致中空微粒的制成。可在Niro Mobile Minor喷雾干燥机上使用该喷雾系统制造的微粒的最大粒径(X50，通过Sympatec測量)为 30 μ m。本发明微粒的优选的X50值为5-50微米，最优选10-20微米。然后首先将实心或中空的含血纤蛋白原的微粒与实心或中空的含凝血酶的微粒共混，并且任选地然后与本文所述的添加剂材料共混，反之亦然，或者以制得均匀共混物的 任何顺序共混。这类共混可以使用低剪切或高剪切共混，或者本领域技术人员已知的任何其他技术进行。本发明的微粒可以通过喷雾干燥活性组分与単独的糖，例如单糖和ニ糖，包括乳糖、甘露糖和海藻糖，或者多糖例如右旋糖苷的溶液而制备。一种替代方法包括共喷雾干燥，其中配制血纤蛋白或凝血酶和另一种成壁材料并且喷雾干燥，得到其中活性组分引入颗粒的微粒。合适的其他蛋白质可以是天然存在的或者在培养的细胞或转基因的动物或植物中通过重组DNA技术制备。如W092/18164中所述，它们可以充当“成壁材料”，其中给出了多个实例。优选的材料是HSA (人血清白蛋白)。例如，血纤蛋白原単独喷雾干燥或者在变化量的赋形剂例如HSA (例如1:1、1:3、3:1的血纤蛋白原HSA比例)和海藻糖的存在下喷雾干燥。HSA的其他合适替代物包括表面活性剂,例如Tween 20、Tween 80>Poloxamer 407或Poloxamer 188。钙离子，例如作为氯化钙可以引入凝血酶原料。作为选择，可以在加工后将氣化·15加入微粒。在本发明的一个实施方案中，也可以存在添加剂材料。用于本发明的添加剂材料通常具有IOnm — Imm或者10微米ー 1000 μ m的粒径。在选择添加剂充当载体的情况下,粒径可以为10 - 1000 μ m，或100 — 500 μ m，或125 — 250 μ m或者可能为例如10 — 40 μ m。它们可以包含ー种材料或者混合物。添加剂材料可以构成组合物重量的约I %、约2 %、约3 %、约4%、约5 %、约6 %、约 7%、约 8%、约 9%、约 10%、约 11 %、约 12%、约 13%、约 14%、约 15%、约 16%、约 17%、约 18 %、约 19 %、约 20 %、约 21 %、约 22 %、约 23 %、约 24 %、约 25 %、约 26 %、约 27 %、约 28 %、约 29 %、约 30 %、约 31 %、约 32 %、约 33 %、约 34 %、约 35 %、约 36 %、约 37 %、约 38 %、约 39 %、约 40 %、约 41 %、约 42 %、约 43 %、约 44 %、约 45 %、约 46 %、约 47 %、约 48 %、约 49 %、约 50 %、约 51 %、约 52 %、约 53 %、约 54 %、约 55 %、约 56 %、约 57 %、约 58 %、约 59 %、约 60 %、约 61 %、约 62 %、约 63 %、约 64 %、约 65 %、约 66 %、约 67 %、约 68 %、约 69 %、约 70 %、约 71 %、约 72 %、约 73 %、约 74 %、约 75 %、约 76 %、约 77 %、约 78 %、约 79 %、约 80 %、约 81 %、约 82 %、约 83 %、约 84 %、约 85 %、约 86 %、约 87 %、约 88%、约 89%、约 90%、约 91%、约 92%、约 93%、约 94%、约 95%、约 96%、约 97%、约98 %、约99 %，或之间的任何范围。各种材料适合用作生物相客、吸水、可水溶胀的添加剂材料以增强流动和润湿能力等。优选地，材料不溶或者非常缓慢溶解。这些材料可以包括右旋糖苷聚合物，比如例如Sephadex，其可以不同粒径获得，淀粉，支链淀粉衍生物，透明质酸酯，纤维素产品例如微晶纤维素(Avicel系列)，甲基纤维素，羧甲基纤维素，微细纤维素或羟基丙基纤维素，羟基丙基甲基纤维素，羟基丙基纤维素，低取代的羟基丙基纤维素，羟基こ基纤维素和其他材料，例如交联聚こ烯吡咯烷酮(PVP)，可以单独或者以混合物使用。另外，充当载体的合适添加剂材料包括优选具有约1000分子量的聚こニ醇(PEG);优选具有约50，000平均分子量的聚こ烯吡咯烷酮(PVP);聚(丙烯酸)、聚丙烯酰胺、聚こ烯醇(PVA)、聚(甲基こ烯基醚-共-马来酸酐)、聚(环氧こ烷)和一般具有约40，000平均分子量的右旋糖苷。如果必要或者希望，可以将本发明的微粒灭菌。无菌加工、电子束照射、Y-照射和环氧こ烷是合适技术的例子。用于本发明的另外的颗粒(本文描述为“载体颗粒”)通常具有10 — 1000 μ m，例如 10- 40 μ m的粒径。它们可以包含ー种材料或混合物。各种材料适用于血纤蛋白密封剂用的大载体材料，以增强流动和润湿能力等。它们包括糖例如单糖和ニ糖，包括乳糖、甘露醇和海藻糖，或者右旋糖苷和右旋糖苷聚合物，比如例如Sephadex,其可以不同粒径获得。纤维素产品例如微晶纤维素(Avicel系列)，甲基纤维素，羧甲基纤维素，微细纤维素或羟基丙基纤维素，和其他材料例如交联聚こ烯吡咯烷酮(PVP)，単独或者以混合物使用。另外，合适的载体包括优选具有约1000分子量的聚こニ醇(PEG);优选具有约50，000平均分子量的聚こ烯吡咯烷酮(PVP);聚(丙烯酸)、PVA、聚(甲基こ烯基醚-共-马来酸酐)、聚(环氧こ烷)和一般具有约40，000平均分子量的右旋糖苷。可以包括药片崩解剂。这些材料将从创伤吸水、迅速膨胀并且由此增强粉末共混物的止血组分的润湿能力一淀粉こ醇酸钠(Explotab或Primo jel)—具有35-55 μ m的平均粒径。约25%的葡萄糖单元羧甲基化。一交联聚こ烯卩比咯烧酮(polyplasdone)一藻酸盐和海藻酸一交联羧甲基纤维素钠(Ac-Di-Sol)可以使用的树胶和胶凝剂包括例如黄芪胶、刺梧桐树胶、可溶淀粉、明胶、果胶、瓜尔胶和Gellan胶。特别优选的添加剂是Emdex,即右旋糖苷的水合形式(包含少量淀粉寡糖的喷雾结晶的右旋糖苷)。其是高度精炼的产品，由具有190 — 220 μ m中值粒径的白色自由流动喷雾结晶大孔球体组成。另ー种优选的添加剂是NON_PAREILSEEDS :(Sugar Spheres)。这些在多个药品単元中使用以获得改进含量均匀性、一致并且受控制的药物释放和高度的药物稳定性，尺寸为 200 — 2000mm。 最优选的载体添加剂是如在名称PARTECK SI和PARTECK M (Merck KGaA,Darmstadt, Germany)出售的高度多孔和高度可溶的交织细丝状晶体形式的山梨醇或甘露醇。这些等级具有高吸附容量并且因此适合干与本发明的干粉血纤蛋白密封剂粉末组合物共混，以制得通过允许血液浸过施加的粉末床并且因此避免単独在粉末界面凝血而减少粉尘、增强干粉血纤蛋白密封剂的润湿能力、溶解性和性能的新粉末。在本发明的另ー个实施方案中，载体颗粒可以包含泡腾剂对。泡腾反应后产生的气体可以使血纤蛋白密封剂膨胀成‘泡沫’和/或増加包含血纤蛋白密封剂的粉末的润湿能力。当粉末施加于创伤时，泡腾组分溶解、反应并且释放，即ニ氧化碳，由此增加止血组分的润湿能力并且因此增强血凝块形成时间。一旦完全反应并且已经形成血凝块，则血纤蛋白密封剂将看起来是稳定的泡沫。泡腾剂对通常包含柠檬酸或柠檬酸氢钠和碳酸氢钠，但可以使用其他生理可接受的酸/碱或者碱土金属碳酸盐混合物，例如酒石酸、己ニ酸、富马酸或苹果树，和碳酸(氢)钠、钾或钙或者甘油碳酸钠。一般而言，已经发现当作为酸性组分与碱性组分的摩尔当量比表示，基于化学分子当量的泡腾剂对的组分的相对比例为4:3 — 1:3的范围，更优选约2:3 时，表现出优选的味道特性。就柠檬酸和碳酸氢钠的优选组合而言，作为酸性与碱性组分的比例表示，基于重量这些值表现为I: I 一 O. 3:1,优选O. 5: I。另ー种优选的添加剂材料是ニ氧化硅，优选亲水的那些。这类ニ氧化硅可以是胶体ニ氧化硅、锻制ニ氧化硅、研磨ニ氧化硅、沉淀ニ氧化硅，或它们的混合物。合适的锻制ニ氧化硅的例子包括但不限于，Aerosil 90、130、150、200、300、380、R202、R805、R812、R972、R974 (Degussa Corporation, Ridgefield Park, N. J.)和 CAB-O-SIL. TS—720 和 M_5(Cabot Corporation, Tuscola, III·)。一般而言，优选 Aerosil._ . 200、Aerosi 丨. . R974、CAB-0- Siし . TS-720和得自其他锻制ニ氧化硅制造商的任何其他通常等价的产品。已知亲水性AEROS丨L 胶体ニ氧化硅増加了药片崩解和活性成分释放速率。胶体ニ氧化硅充当“芯”，例如从消化液中提出水进入药片内部。此外，用亲水性AEROSIL 200胶体ニ氧化硅“涂覆的”药片成分更容易地润湿并且更快溶胀(崩解剂)或者更快溶解(活性成分)。这些性能增强了本发明的粉末状血纤蛋白密封剂的润湿能力和溶解。另外，这些ニ氧化硅已知充当助流剂，并且因此将增强这种粘结的微粒的流动能力、填充和输送。此外，这类胶体ニ氧化硅被已知为用于血液凝结的活化剂，并且因此与血纤蛋白原和凝血酶组分协同作用(參见Margolis, “胶体ニ氧化娃对血液凝结的影响”，Aust. J. Exp. Biol. , 39, 249-258页(1961))。组合物可以包含O. 001 一 5%w/w,或约O. 01 一 2%或者约O. I — O. 5%w/w的ニ氧化硅。ニ氧化硅可以简单地与含血纤蛋白原的组分共混并且然后将含凝血酶的组分加入其中并且进一歩共混，或者反之亦然。最优选地，作为最后步骤，将ニ氧化硅与预先共混的粉末状组分共混。合适的共混装置将是本领域那些技术人员已知的，ニ氧化硅可以与本文定义的载体添加剂颗粒组合存在。添加剂材料可以作为单ー组分或者组合存在于本发明的组合物中，并且可以存在于原料中或者在一起共混前加入喷雾干燥的凝血酶或血纤蛋白原组分，或者加入到最終共混物中并且进行进ー步共混。该共混可以使用低剪切或高剪切共混、机械-化学結合、杂化或者本领域技术人员已知的任何其他技术进行。尽管本发明的血纤蛋白密封剂中微粒的组分优选为水溶的，并且微粒优选通过喷雾干燥合适的溶液获得，但可获得的微粒可以是自由流动、离散并且基本干燥或无水的，具有优选不大于8%w/w，最优选不大于5或3%w/w的残余水含量。这意味着根据本发明的血纤蛋白密封剂的化合物直到它们例如通过与创伤位置的液体接触而润湿才活化。因此活性组分可以作为干燥混合物输送，尽管还设想单独施加不同的微粒。含活性成分的微粒优选在室温(例如25°C)为无定形的或者玻璃的形式，使得夹带的蛋白质稳定以及活性成分以该快速溶解的状态存在。优选地，通过差示扫描量热法或者调制的差示扫描量热法测量，组合物表现出大于约25°C，或约30°C，或约40°C，或约50°C的玻璃转变温度。添加剂材料在室温(例如25°C)也可以为无定形的或者玻璃的形式，以使得为快速溶解的状态。优选地，通过差示扫描量热法或者调制的差示扫描量热法测量，组合物表现出大于约25°C,或约30°C,或约40°C，或约50°C的玻璃转变温度。这种玻璃态组合物使得组合物能够在环境温度或室温，例如25°C下长时间储存，例如大于3个月或大于6个月，活性没有显著损失。显著损失被定义为活性损失大于原始效能的约5或10或者20%。添加剂材料也可以为结晶或无定形状态，但也可以是自由流动、离散并且基本无水的，具有优选不大于5%w/w，最优选不大于3%w/w的残余水含量。相应的含血纤蛋白原和含凝血酶的可溶微粒可以稳定的干燥形式一起配制和共混，制得血纤蛋白密封剂组合物。该制剂随后可以根据需要而活化，得到可用于创伤治疗和外科手术修复的血纤蛋白密封剂。 在本发明的ー个方面，血纤蛋白密封剂粉末组合物适用于形成保护性或预防性的覆盖物或绷带用于轻微擦伤、切ロ、刮伤、划伤、烧伤、晒伤、溃疡和其他皮肤伤害和刺激，例如外科手术期间和之后的出血，和来自重度外伤和/或战场创伤的不能控制的内和外溢血。在另ー个实施方案中，干粉组合物可以用作局部止血剂以停止出血。在本文中，停止出血占用的时间被称为止血时间(TTH)。如果使用加压片，測量通常当加压片施加于出血位置开始，直到敷料可视化使出血停止和/或观测到穿过敷料或者在敷料周围无出血为止。在本发明的ー个方面，根据本发明的干粉组合物产生约10分钟或更少，约5分钟或更少，或者3分钟或更少的TTH。本发明的另ー个目的是本文所述的干粉组合物用于治疗轻度至中度出血的应用。轻度出血是通常表现出少于约5g/分钟的血流动的那些，而中度出血通常为>20g/分钟，任选地TTH少于10分钟。本发明的另ー个目的提供了超出轻微擦伤、切ロ、刮伤、划伤、烧伤、晒伤、溃疡和其他皮肤伤害和刺激的适合于在非-表面组织上形成密封或者封闭开ロ的组织的粉末或流体血纤蛋白密封剂组合物。可治疗的创伤尤其包括局部创伤；较深的创伤；外科手术切ロ ；严重创伤；战场创伤和外伤；和急救室过量出血。因此，创伤密封剂的各种应用包括用于外科手术和医疗过程的急救和伤员鉴别归类(triage)应用。本发明的粉末组合物可以直接施加于可能出现出血的创伤、伤ロ縫合、切口和其他开ロ。创伤包括对于活性生物体中任何组织的损害。生物组织包括连接组织、内皮组织、神经组织、肌肉组织和器官。优选的生物组织选自骨、皮肤、软骨、脾、肌肉、淋巴、肾脏、肝、血管、肺、硬脑膜、肠和消化组织。组织可以是内部(例如器官)或外部组织(例如眼、皮肤等)，并且可以是硬组织(例如骨)或软组织(例如肝、脾等)。创伤可能由任何原因造成，包括感染、外科手术介入、烧伤或外伤。外伤被定义为由物理力造成的伤害；例子包括机动车事故的结果、枪击和烧伤。在本发明的另ー个方面，本发明的干粉血纤蛋白密封剂组合物可用于例如胃肠系统，例如食管、胃、小肠、大肠、肠、直肠中，实质性器官例如肝、胰腺、脾、肺、肾、肾上腺、淋巴腺和甲状腺上的外科手术介入；耳、鼻和喉区域(ENT)中的外科手术介入，包括牙齿外科手木、鼻出血、心脏血管外科手术，例如颈动脉脉内膜切除术、股胭(femOTopopliteal)旁路或者冠状动脉旁路接枝(CABG);美容外科手术、脊椎外科手术、神经外科手术，例如后路腰椎椎体间融合术、微椎间盘切除术(microdiscectomy)或开颉术；淋巴、胆汁和脑脊液(CSF)瘘，胸肺外科手术期间的漏气，胸腔外科手术，包括气管、支气管和肺的外科手术，骨外科手术(orthopaedic surgery),例如膝关节或髋关节置换；妇科外科手术过程例如剖腹产手术、子宫切除术、纤维瘤外科手术；血管科外科手术，例如分流术(shunts)；泌尿道、骨(例如松质切除木)，和急救外科手木。特别优选的外科手术介入包括骨外科手术、肝切除术、软组织损伤或外科手术和血管科外科手木。本发明的干粉血纤蛋白密封剂组合物表现出优于现有的包含血纤蛋白原和凝血酶的液体体系的优点，其中这些现有技术产品需要重组、一旦重建则具有短储存寿命、由于它们在液态的不相容性因此必须使用双桶装注射器输送。此外，这种液体形式难以用于不方便或复杂的创伤和/或器官的表面，并且还容易溢出并且郁积在空穴中。本文所述的干 粉血纤蛋白密封剂组合物和制剂克服了这些缺陷。在本发明的另ー个方面，本发明的组合物在外科手术期间或之后给药。可以将本发明的组合物给药到患者的创伤，包括人、哺乳动物和其他兽医应用。本发明进ー步包括通过施加包含止血有效量的本文所述干粉组合物的组合物,在溢血位置減少出血的方法。在本发明的另ー个方面，粉末组合物作为非灭菌或灭菌制剂配制用于单ー输送应用于创伤位置，或者作为多用(multi-use)制剂配制。所述制剂可以包装并且以几种优选的剂型提供，包括干粉、干涂胶(dry adhesive coating)、气溶胶、干气溶胶、泵压喷剂、医用敷布；膜；涂覆的石膏；含药的海绵或者外科手术贴片(參见Tachosil);止血绵(參见Tachocomb);纱布；药膏、半凝胶、凝胶、泡沫、糊剂、悬浮液、软膏、乳液、可模塑形式、鼻栓、外科手术敷料、创伤包扎、绷带、药签、导管、光学纤维、注射器、子宫托、栓剂，或者液体或不含水液体中的悬浮液等。制剂局部施加于创伤位置。作为择ー的选择或者额外地，在例如较深的裂ロ、动脉创伤的情形下或者在外科手术过程期间，制剂可以在内部引入创伤位置。本发明的另ー个方面提供一种用于局部输送到轻微擦伤、切ロ、刮伤、划伤、烧伤、晒伤、溃疡、内静脉出血、外静脉出血，和外科手术外伤上的作为悬浮液的包含血纤蛋白密封剂粉末的液体止血组合物。本发明的另ー个优选实施方案提供一种用于局部输送到轻微擦伤、切ロ、刮伤、划伤、烧伤、晒伤、溃疡、内静脉出血、外静脉出血,和外科手术外伤上的液体止血组合物,所述组合物包含在非-含水液体载体中的血纤蛋白密封剂粉末组合物以在伤ロ位置形成薄膜阻隔。该制剂可以变化的量容易地施加于创伤位置并且将迅速停止出血。本发明还包括一种制备粘稠水溶性血纤蛋白密封剂糊剂、药膏、油膏或悬浮液组合物的方法，包括以下步骤将本发明的血纤蛋白密封剂粉末组合物和具有约200 — 6000的分子量范围的聚こニ醇混合。优选使用各种分子量的PEG的共混物。优选地，PEG是具有500 - I, 000平均分子量的共混物，如PEG 300丽和1500丽的1:1或1:2或1:3或1:5或者1:9的共混物。使用较低等级的PEG将制得较淡的较少粘稠的悬浮液，所述悬浮液可以包装并且通过泵压喷雾输送。这类悬浮液可以任选包括表面活性剂或其他合适的悬浮剂以防止絮凝。这类形式的制备和配制是本领域那些技术人员已知的。所述糊剂、药膏、油膏或悬浮液组合物也可与例如明胶海绵、纱布或者胶原材料通过以下方式组合使用用组合物涂覆作为基质的这些材料并且将其施加于溢血位置，或者首先将组合物施加于溢血位置并且将凝胶海绵、纱布或者胶原放在组合物顶上，并且向其上加压。本发明的油膏、药膏或糊剂具有足够高的粘度和效能以允许其通过将戴手套的手指浸入糊剂并且将糊剂放在出血位置而止血有效应用。在该方面使用的聚こニ醇具有约500 一 1000或者更优选约900的平均分子量范围。聚こニ醇等级可以彼此组合以产生独特性能。例如，可以将在室温下为固体而在室温下不溶于液体PEG 300的PEG 1500—起组合并且在较高熔点ニ醇(即PEG 1500)的熔点以上加热形成溶液。例如，将作为液体的PEG300与相等重量的在43°C下熔融的固体PEG 1500混合，并且将两者一起加热在PEG 1500的熔点或者以上，使得它们液化成均匀溶液，并且当该溶液冷却至室温时形成光滑的软糊齐U。该糊剂是水溶的，并且足够柔软而容易地散布在组织或皮肤上。 本发明进一歩包括ー种通过将在包含聚こニ醇的基质中包含止血有效量的本发明的干粉血纤蛋白密封剂组合物的糊剂组合物施加于对象的溢血位置，从而在溢血位置减少出血的方法。所述糊剂可与纤维纱布材料组合或者単独以糊剂形式施加于溢血位置。在本发明的另ー个实施方案中，将血纤蛋白密封剂粉末组合物与推进剂，任选地与聚合物例如PVP混合并且包装在气溶胶容器中(參见US4，752，466)。因此这提供将干粉状凝血酶直接输送到创伤，或者直接输送到本文所述的止血或支承材料上的便利方式。每ー种中使用的血纤蛋白密封剂粉末组合物的量可以根据希望的效能而不同，但通常可以为0.5-1.0克大小的量级。然后从罐中通过阀将液化形式的推进剂充入气溶胶容器，推进剂在罐中以液化形式存在。使用的推进剂的量通常可以为10克的量级。填充气溶胶容器的其他方法是公知的并且如果希望可以使用。在气溶胶容器内，合成聚合物例如PVP完全溶于推进剂中。血纤蛋白密封剂粉末组合物不溶解，但以非常细碎的状态存在，即其悬浮于推进剂中，其中其作为细碎的乳状悬浮液存在。当压下阀以从气溶胶容器喷射材料吋，放出血纤蛋白密封剂粉末组合物、推进剂和任选地PVP的混合物。血纤蛋白密封剂粉末组合物作为干燥白色粉末出来。推进剂迅速蒸发并且消失。设计用于分配粉末喷射的气溶胶容器和其的组件可商购获得，并且可用于本发明。在Paul Sanders的“气溶胶技术手册”(VanNostrand, Reinhold Company, N. Y. 1979,第 2 版，21 章，题为“气溶胶悬浮液”)(Powders)中给出了有用的背景信息。优选的推进剂包括HFA系列的那些。本发明的气溶胶包装应该以使得其的内容物当喷射时将为无菌的之方式制备和处理。细菌过滤器和无菌加工技术的使用得到无菌产品。本发明的气溶胶被设计为在室温下储存。在该形式中，由于血纤蛋白密封剂粉末组合物的玻璃态性质，因此其相对稳定至少6个月时间。在本发明的最优选实施方案中，使用同在申请中的申请WO 2010/070333的粉末输送设备(Fibrospray )施加血纤蛋白密封剂粉末组合物，该申请在此引入作为參考，用于例如胃肠系统，例如食管、胃、小肠、大肠、肠、直肠中，实质性器官例如肝、胰腺、脾、肺、肾、肾上腺、淋巴腺和甲状腺上的外科手术介入；耳、鼻和喉区域(ENT)中的外科手术介入，包括牙齿外科手术、鼻出血、心脏血管外科手术，例如颈动脉脉内膜切除术、股胭旁路或者冠状动脉旁路接枝(CABG);美容外科手术、脊椎外科手术、神经外科手术，例如后路腰椎椎体间融合术、微椎间盘切除术或开颅术；淋巴、胆汁和脑脊液(CSF)瘘，胸肺外科手术期间的漏气，胸腔外科手术，包括气管、支气管和肺的外科手术，骨外科手术，例如膝关节或髋关节置换；妇科外科手术过程例如剖腹产手术、子宮切除术、纤维瘤外科手术；血管科外科手术，例如分流术；泌尿道、骨(例如松质切除木)，和急救外科手木。特别优选的外科手术介入包括骨外科手术、肝切除术、软组织损伤/外科手术和血管科外科手木。在包含支承材料例如纱布、海绵、绷带等的本发明的优选实施方案中，其中提出将血纤蛋白密封剂粉末组合物以预定的浓度例如20%、40%、60%或80%或者任何其他优选浓度，喷射或者另外包埋或施加干支承上并且标明施加于其上的血纤蛋白密封剂粉末的浓度。将血纤蛋白密封剂粉末组合物，或者血纤蛋白密封剂粉末组合物和其他材料的组合施加于处理的支承中的方法是本领域那些技术人员公知的。处理的支承的标记可以采取将百分比浓度例如20%、40%或60%压印在处理的支承表面(一面或两面)或者刚好在其的ー个层下面的形式。如果希望，百分比标记可以为任何其他优选的数字，例如25%、50%和75%，或者 甚至1、2、3、4、5。进行标记后，如果希望，将处理的支承进行灭菌。通过在其中嵌入和/或涂覆干粉血纤蛋白密封剂的创伤和装置表面促使凝血形成，该新的干粉血纤蛋白密封剂或局部止血剂形式与単独的粉末相比表现出协同性和/或更大的功效。现有的浸溃支承和海绵等允许在出现凝血前血液渗入结构。本发明的其他优选方法可用于密封外科手术过程期间在生物组织中的切ロ、穿孔和/或流体或气体泄露，并且包括使组织与有效量的血纤蛋白密封剂粉末组合物接触，由此密封切ロ、穿孔或者流体或气体泄露。
实施例实施例I如同在申请中的申请US 61/122,063中所述制备干粉血纤蛋白密封剂。简单地说，如该申请中所述制备血纤蛋白原(ZLB, Marburg, Germany)和海藻糖(Pfanstiehl,Waukegan, IL, USA)中空球形颗粒。颗粒中血纤蛋白原的浓度为12%(w/w)。将凝血酶(SNBTS, Glasgow, Scotland)和海藻糖喷雾干燥获得中空颗粒。凝血酶以1000IU/克颗粒的浓度存在。颗粒以I: I比例共混；所得粉末具有6%w/w的血纤蛋白原浓度和500IU/克粉末。该共混物在下文称为Fibrocaps 。为了制备本发明的进ー步实施方案的混合物,将上述Fibrocaps粉末进ー步与流体吸收颗粒(Sephadex G200superf ine, GE Healthcare, Uppsala, Sweden) 1:1 重量/ 重量混合。Sephadex G200superfine具有10 — 40 μ m的干珠粒尺寸。为了清楚，所得粉末由3%w/w血纤蛋白原、250IU/克凝血酶和50%w/w SephadexG200颗粒组成。该共混物称为Sephadex 共混的 Fibrocaps 。功效试验没有通用的动物模型用于试验有效的局部止血剂的功效，因为外伤出血本身表现为从具有高压的动脉伤ロ到整块渗出的不同形式。大的动物模型(猪)仅是人的情形的模型代表(Pusateri 等(2003) J. Trauma 55 (3)，518-526)。在选择的动物模型中，Sephadex共混的Fibrocaps 产品将与市场上或者开发中并且可以潜在用于外伤应用的其他产品比较。为了模拟肝的外伤伤ロ，包括不能控制的严重出血，在猪肝上通过ー副外科手术剪刀从肝上切掉4x5cm宽和I. 5-2cm深的片(n=2)，造成肝扇形伤ロ。在该过程期间切掉的静脉或动脉没有一个结扎，并且在制造伤口前动物已经接受标准剂量的肝素 15分钟。使用“标准”方案处理ー个伤ロ，其中将6克Fibrocaps 材料倒在创伤上，用帕拉膜(parafilm)覆盖，之后加压30秒。在取下帕拉膜期间还取下显著部分的粉末，并且将另外的I. 5 — 2克施加于创伤，用标准外科手术纱布加压。出血在2 — 3分钟内显著减缓，但花费 5分钟实现完全止血。第二个扇形伤ロ用6克具有増加的吸收能力但仅包含一半量的血纤蛋白原和凝血酶的Sephadex共混的Fibrocaps 处理。然后用一片可生物分解的Vicryl片(Ethicon)覆盖粉末，并且使用纱布加压30秒。纱布可以容易地取下并且Vicryl留在创伤上防止破坏Fibrocaps 药栓。在1-1. 5分钟内没有观察到出血并且实现完全止血(还參见图IA — C)。该时间被称为止血时间(TTH)。仅有S印hadex不能停止动物中的严重出血。 该实验清楚地说明Sephadex共混的Fibrocaps优于Fibrocaps的优点。对于Sephadex共混的Fibrocaps,将等量的这些粉末施加于严重出血创伤上在I. 5分钟内得到完全止血，而Fibrocaps能够在5分钟内停止出血,但只有在加入额外的粉末后。这是令人惊奇的，因为与Fibrocaps相比，Sephadex共混的Fibrocaps只包含一半浓度的血纤蛋白原和凝血酶。更低浓度的血纤蛋白原和凝血酶还意味着Sephadex共混的Fibrocaps与Fibrocaps相比成本显著降低。实施例2为了制备具有增强的流动和止血作用的硅化组合物，将实施例I的Fibrocaps粉末进一步与0. 5%w/w Aerosil 200 Pharma (Evonik)在Turbula低剪切共混机中混合10分钟，制得自由流动粉末。实施例3将实施例I的Fibrocaps粉末放在开ロ的气溶胶罐或瓶中，将阀杆和盖子放在上面并且现场卷边。血纤蛋白密封剂粉末组合物的量约为I. 5克。然后从罐中通过阀将液化形式的推进剂充入气溶胶容器，推进剂在罐中以液化形式存在。然后通过开动阀将气溶胶罐的内容物放出，将气溶胶施加于创伤，得到快速止血。实施例4将实施例I的Fibrocaps粉末与PEG 200以I: I比例和0. 5%w/w Tween 80混合，制得浅色液体悬浮液并且包装在瓶中，然后将其施加于创伤，得到快速止血。实施例5将实施例I的Fibrocaps粉末与PEG 800以I: I比例混合，制得糊剂并且包装在管中，然后将其施加于创伤，得到快速止血。实施例6本实施例详细概述了评价单独的Fibrocaps (得自实施例I)或者与各种加压片(例如明胶USP、胶原和氧化纤维素)的组合以促进止血并且減少失血的几个药理研究。药理模型包括在软组织(肝和脾)中制造的创伤和血管模型(AV植入)。模型包括轻度出血(<5g/min)至中等出血(>20g/min)。这些研究中的几个还包括纱布或其他“机械”止血控制以及“活性”局部止血剤，比如人的凝血酶和FloSeal，使得可以与Fibrocaps进行比较。总的来说，这些研究表明通过单独或者与加压片例如明胶、胶原和氧化纤维素的组合而減少的TTH和失血所度量的那样，Fibrocaps是药理活性的并且能够促进止血。另外，Fibrocaps表现出与其他市场化的局部止血剂类似的止血活性。姆表面积推荐的Fibrocaps 剂量为 I. 5g/100cm2。猪脾穿刺活组织止血模型的开发在该研究中，在外科手术前将两头动物禁食并且如果合适则麻酔。通过插入股动脉的导管測量平均动脉压力(MAP)并且每5min记录。一旦血压稳定20min，则进行中线剖腹手术并且从腹中取出脾。通过用浸入盐水的棉卷海绵覆盖，将未处理的脾区域保持潮湿。使用6_直径活组织穿刺3_深制造创伤。通过用剪刀切除取出活组织。每ー个创伤隔开足够的空间以允许仔细评价。
使用如WO 2010/070333中所述的Fibrospray设备将得自实施例I的Fibrocaps粉末作为干粉(O. 25g)施加于每ー创伤位置。使用盐水预先润湿的外科手术材料AviteneUltrafoam (胶原),和不粘结的纱布垫(Dukal)施加轻微手工压カ以允许Fibrocaps与创伤床紧密接触。使用生产商的推荐应用对照物品。处理的伤ロ最初施加轻微的手工压カI分钟，随后30秒止血评价。如果继续出血，则进行另外30秒填塞/30秒止血评价直到出现止血或者直到预试验达到10分钟，并且记录处理为失败。对每ー要评价的处理制造4 一 13个创伤。从将加压片施加于出血位置开始，直到敷料可视化使出血停止和/或观察到穿过敷料或者在敷料周围没有出血为止来度量止血时间。在评价第一头猪上不同类型/尺寸的创伤后，观察到深度3mm的6mm穿刺活组织得到各组动物全部一致的出血速率。使用该方法，可靠地实施模型，并且活组织产生得到约
I.5 一 2g/min失血的创伤。在创伤或者施加止血处理后，没有注意到MAP变化。表I试验的处理


本发明涉及用于外科手术、外伤和其他创伤或伤害的包含血纤蛋白原和凝血酶的混合物的干粉血纤蛋白密封剂。本发明进一步涉及用于创伤治疗或用于外科手术介入或者用作局部止血剂的包含所述干粉血纤蛋白密封剂的新制剂。