[0010]在真核生物中，N-连接聚糖以预合成寡糖形式附着至ER腔中的蛋白上，所述预合成寡糖由具分支寡糖单元(由3个葡萄糖(Glc)、9个甘露糖(Man)及2个N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)构成)组成。所述核心聚糖(Glc3Man9GlcNAc2)经由脂质载体(ER膜中的多萜醇-焦磷酸酯)转移至移位于ER腔中的分泌蛋白上。将聚糖转移至适当序列(即Asn-X-Ser/Thr)上，其中X为初生糖蛋白中除脯氨酸外的任一氨基酸。正确折叠的糖蛋白主动转运至高尔基体中，其中其N-聚糖由葡糖苷酶、甘露糖苷酶及糖基转移酶修饰以产生含有唾液酸、岩藻糖及半乳糖的复合结构。葡糖苷酶及甘露糖苷酶在N-聚糖加工的最早阶段自聚糖去除葡萄糖(Glc)及甘露糖单糖(Man)。然后，N-乙酰基葡糖胺酶催化将N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)添加至附着至N-聚糖的保守核心结构上的甘露糖上，此对聚糖上形成的分支或触角结构的数量具有决定作用。岩藻糖基转移酶将岩藻糖添加至靠近蛋白的N-乙酰葡糖胺上，且半乳糖基转移酶及唾液酸转移酶分别将半乳糖及唾液酸添加至N-聚糖分支的末端上。所述酶的反应通常是不可逆的，从而生成稳定的N-糖基化蛋白。
[0011]经由生成核心寡糖并对其实施差式修饰且可变地添加外臂糖，蛋白糖基化可引入显著异质性。
[0012]已证明不正确糖基化或非糖基化抗体展示不受控制的功能。因此，选择能够一致地生成具有所期望翻译后修饰模式的产物的适当生产系统对于成功的药物制造及应用而言至关重要。糖蛋白的糖型特征及因此带来的功能活性可根据生产系统而显著不同。原核生产系统(例如大肠杆菌(Escherichia coli))中的生物药物蛋白的产生可获得非糖基化蛋白产物，其在活体外必须以经溶解并再折叠的包涵体形式回收。相比之下，酵母表达系统添加高甘露糖含量的糖侧链，在昆虫细胞中产生后获得的糖基化模式亦与特征性哺乳动物模式显著不同。植物可将蛋白差式糖基化，但一致地添加经报导在人类中具有免疫原性或过敏原性的α 1, 3-岩藻糖及β I, 3-木糖。
[0013]多种哺乳动物宿主细胞能够进行差式N-聚糖加工。对所产生糖蛋白的分析显示异质糖型，此根据产生细胞(production cell)所源自的组织或物种而定。因此，重要的是，确保产生用于临床应用的糖蛋白产物的糖基化模式在整个产生批次中及批次之间是均一的,且亦确保保持抗体有利的活体内性质。
[0014]机体内的天然(固有)抗体以及由重组DNA技术在哺乳动物宿主细胞系中产生的抗体二者皆经由IgG-Fc区内CH2结构域中在进化上保守的Asn297处共价附着寡糖来糖基化。该寡糖为IgG-Fc结构的整体部分且系效应子功能所绝对需要的。IgG-Fc上用于效应子配体(例如Fcy R1、Fe Y RH、Fe Y RIII及Clq)的相互作用位点由蛋白质部分构成；然而，基本IgG-Fc蛋白构象的生成取决于寡糖的存在及化学组成。因此，经由效应子配体的接合介导的效应子机制(清除机制，例如吞噬作用、抗体依赖性细胞毒性(ADCC)及补体依赖性细胞毒性(CDC))会因不正确糖基化或非糖基化IgG而严重受损或去除。
[0015]人类？(^1?111&受体具有多态性且已显示？(^1?111&-158￥(缬氨酸)形式与IgGl-Fc的亲和力高于Fcy RIIIa-158F(苯丙氨酸)形式。经活体外证实，IgGl抗体经由带有纯合Fe YRIIIa-158V的细胞比纯合Fe Y RIIIa_158F或杂合Fe Y RIIIa_158V/Fe Y RIIIa-158F细胞更有效地介导ADCC。[0016]正常多克隆人类IgG-Fc的典型寡糖结构系复合双触角结构类型。当糖蛋白经过在核心(岩藻糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc))(或外臂(半乳糖(Gal)及N-乙酰基神经氨酸(Neu5Ac))处具有额外糖残基的高尔基体时，双触角结构核心七糖受到可变修饰(由(Walsh 及 Jefferis, 2006)综述)。
[0017]来自不同脊椎动物物种的血清IgG抗体共同具有基本双触角结构Fe糖结构，但糖链的周围区域的结构及组成有所不同(Hamako等人，1993)。可变性最可能归因于存在于不同物种的B-淋巴细胞中的糖基转移酶的不同活性和/或每一 IgG对于所述转移酶的可及性。若使用重组DNA技术来在不天然分泌IgG的宿主细胞中稳定表达IgG，则糖基化模式同样由存在于该细胞系中的糖基转移酶或聚糖修饰酶的活性所确定。因此，在替代性生产细胞系中产生的重组蛋白的糖基化模式具有细胞型_、组织-及物种特异性且可显著不同(Raju等人，2000)。在CH0、Y0骨髓瘤及NSO细胞中产生相同IgGl抗体可产生三种不同产物，其在糖基化模式及生物活性上不同(Lifely等人，1995)。因此，已充分确定，效应子功能的活化强烈地取决于抗体分子的寡糖组成，且若存在某些糖基化模式，则某些效应子功能的活化将更为有效。
[0018]采用具有修饰的糖基化模式的治疗性抗体的研究表明，缺乏α 1，6-连接的核心岩藻糖可提高IgGl抗体与FcYRIIIa受体的结合亲和力，且因此由天然杀伤(NK)细胞介导的ADCC效果提高高达100倍。[0019]由于补体系统组份与半乳糖基化Fe-聚糖的高结合亲和力，因此Fe聚糖的半乳糖基化经提高的抗体可活化补体系统且补体依赖性细胞毒性(CDC)比具有低半乳糖基化或非半乳糖基化糖型的抗体更有效。
[0020]治疗性抗体可具有不同的作用方法。一些抗体、抗体片段或Fe-融合蛋白经设计以在活体内中和生物分子(例如细胞因子)。相比之下，癌症疗法中的重组抗体经常识别肿瘤细胞上的蛋白，且其功效明确地依赖于敏化效应子细胞以供随后通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)机制实施杀伤。然而，对于其它基于抗体的疗法而言，活化炎性级联可能有害，其会产生不期望的副作用。
[0021]因此，常用的生产细胞系(例如CH0、NS0及SP2/0)中产生的抗体不显示最佳的Fe糖基化模式，这是一种挑战。
[0022]CHO、NSO或人类细胞系中产生的抗体显示主要(约95%)由双触角结构核心七糖结构构成的Fe糖基化特征,该双触角结构核心七糖结构在中心GlcNAc处带有α 1，6连接
岩藻糖残基。
[0023]已充分确定，在Fe聚糖中的双触角结构碳水化合物核心结构内存在α I, 6_连接的岩藻糖会显著损害抗体活化效应子功能(例如抗体依赖性细胞毒性(ADCC))的潜力。已证实另一效应子功能(补体诱导的细胞毒性(CDC))具有半乳糖基化依赖性，其中较高半乳糖含量可使CDC活性增强。因此，具有岩藻糖基化聚糖及低度半乳糖的单克隆抗体在治疗实体肿瘤或非实体肿瘤上尤其有效，这是因为抗体疗法的治疗效果在此情形下主要取决于抗体在募集并活化肿瘤攻击免疫细胞、细胞凋亡诱导或ADCC或CDC活化上的效能。因此，CHO中产生的抗体在癌症疗法上的益处有限，且为了克服其低活性，必须以高剂量给予患者。相比之下，具有经改变的糖基化模式(例如，缺乏α 1，6_连接的核心岩藻糖)的抗体应具有显著增强的治疗效果。[0024]尽管存在以下事实:多数经许可治疗的抗体在CH0、NS0或Sp2/0细胞中产生，但已知在非最佳条件下，所述细胞可产生许多缺乏效能或潜在免疫原性的异常糖基化产物。除不正确加工寡糖外，亦已知鼠类细胞添加通常不会在人类IgG上发现的糖残基。此结构(例如Gal-1, 3-Gal及N-羟乙酰神经氨酸(NeuGc))可触发免疫原性或过敏性反应，其对于拟活体内递送至人类患者的治疗剂而言是不可接受的。
[0025]迄今为止，获得能够产生具有有利糖基化模式的蛋白的细胞系的实验方法集中于对编码糖基化机器的酶的基因的遗传操作，从而以人工方式改变现有产生宿主细胞系中糖基化途径的性质(遗传失活或失调)。由此方法产生的抗体可显示某些糖结构或连接的含量降低或完全缺乏。这些经遗传修饰细胞系可经筛选以获得能够合成某些期望糖基化模式的突变体。
[0026]编码糖基转移酶GntIII的基因在CHO细胞中的转基因过表达可使细胞能够生成具有经改变的糖基化模式的抗体产物及具有减少岩藻糖基化的最终产物，从而在活化ADCC上比具有未修饰聚糖的抗体强20至100倍(Umana等人，1999)。然而，应考虑，这些经遗传修饰的宿主细胞系需要主动选择来稳定遗传改变的效应，此外，遗传改造可具有不期望的副作用，此会增加工业产生过程的调节负担。
[0027]耐凝集素CHO突变细胞系Lecl3 (Ripka等人，1986)因遗传缺陷而缺乏将⑶P-甘露糖转化为GDP-岩藻糖的酶。若细胞不能代谢来自替代(例如外部)来源的岩藻糖，则可使用所述细胞来产生岩藻糖基化降低且ADCC活性提高的产物(Shields等人，2002)。然而，在用小扁豆凝集素(Lens culinaris agglutinin) (LCA)连续选择后仅维持Lecl3细胞在其基因组中含有的突变。然而，就调节角度而言，在大规模产生过程中添加凝集素或其它选择物质系是常令人怀疑的。此外，已知Lecl3细胞的蛋白产量较低，且岩藻糖含量仅部分降低，但高度可变(Kanda等人,2006 ；Shields等人,2002)。
[0028]发明概述
`[0029]本发明令人惊奇地证实大鼠肝癌细胞系H4-11-E是高活性生物药物糖蛋白(例如抗体、尤其是性治疗性抗体及Fe-融合蛋白)的具有改良糖基化性质的极佳生产细胞系。
[0030]本发明还阐述对所选代表各种物种、组织、细胞类型及分化/肿瘤发生阶段的非改造细胞作为宿主细胞系的适用性的分析，所述宿主细胞系用于产生具有有利糖基化模式及因此增进效应子功能的生物药物。
[0031]令人惊奇地，大鼠肝癌细胞系H4-11-E是若干大鼠和/或肝源性细胞系中唯一组合众多用于治疗糖蛋白的增进功效的有利糖性质的细胞系。
[0032]本发明还首次阐述，H4-11-E大鼠肝癌细胞系可用作产生重组糖蛋白(例如抗体或Fe-融合蛋白)的宿主细胞系。本发明证实，H4-11-E大鼠肝癌细胞可经编码抗体或Fe-融合蛋白的轻链及重链的遗传组件稳定转染，且所得产生细胞将高活性功能抗体分子分泌至细胞培养物上清液中，自该上清液可对其实施纯化。H4-11-E细胞中产生的重组抗体因细胞糖基化能力而在质量及活性上优于以常规方式产生的治疗性抗体。
[0033]本发明的H4-11-E细胞系已于2011年6月28日根据布达佩斯条约(Budapesttreaty)以保藏号DSM ACC3129 (H4-11-E)保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ), Inhoffenstrasse7B，D-38124Braunschweig, Germany。[0034]H4-11-E细胞中产生的抗体、尤其是IgGl抗体的糖模式显示复合双触角结构聚糖，其主要不含岩藻糖且同时半乳糖基化高于通常于CHO中产生的抗体。从而，H4-11-E细胞中产生的生物治疗性抗体具有剧烈地且有效地活化抗体介导效应子功能(例如ADCC及OTC)的高潜力。
[0035]本发明还阐述，H4-11-E大鼠肝癌细胞系可在无血清培养基中悬浮培养，此在所述细胞系用作生物治疗剂的生产细胞系时是强制性的。令人惊奇地，在使H4-11-E细胞适应于在无动物组份且无钙离子的化学限定培养基中悬浮生长后，与含血清培养基中H4-11-E细胞呈贴壁细胞层的常用培养模式相比，生长、活力及加倍时间未受影响。在含血清贴壁培养物中以及在适应于无血清、无动物组份且无钙离子的培养基后，在适应阶段期间，H4-11-E细胞培养物的加倍时间在24小时至32小时的范围内或在32小时至60小时的范围内。群加倍时间为24小时至32小时的H4-11-E细胞的悬浮培养的关键方面是使用无钙培养基。与此相比，在化学限定培养基中无血清培育H4-11-E细胞先前已阐述于文献中，但群加倍时间为68.5小时(Miyazaki等人，1991)或4天(Niwa等人，1980),此过慢而不能满足对生物药物的生产细胞系的需求。
[0036]适应于在阐述于本发明中的无血清无Ca2+培养基中悬浮生长的H4-11-E细胞系已于2011年6月28日根据布达佩斯条约以保藏号DSM ACC3130 (H4-1I_Es)保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ, Inhoffenstrasse7B, D-38124Braunschweig, Germany)。
[0037]本发明首次阐述对源自不同物种及组织的细胞系的选择，所述细胞系经分析与其用于产生具有有利糖基化模式(降低的岩藻糖基化、存在末端NeuAc-残基)的重组蛋白的适宜性有关。分析显示，仅大鼠肝癌细胞系H4-11-E能够产生若干有益糖基化模式，此可显著增进治疗蛋白、尤其是糖蛋白(例如抗体)的活性、功效及稳定性。
[0038]H4-11-E细胞最初源自大鼠肝细胞癌(REUBER，1961)且作为适应肝的活体内模型来分析。与此相比，本发明首次阐述H4-11-E细胞作为高活性治疗蛋白的生产系统的用途。源自大鼠肝的H4-11-E细胞不会天然产生抗体，且H4-11-E细胞先前尚未用于重组蛋白产生。H4-11-E细胞源自大鼠肝细胞癌(ΡΙΤ0Τ等人，1964 ;REUBER，1961)且专门用于毒性学分析且用作模型系统来研究细胞压力(stress)反应(例如(Horikoshi等人，1988 ；Houser等人，1992)) ο
[0039]极令人惊奇地，特别是大鼠细胞且尤其是H4-11-E细胞产生具有低岩藻糖含量的糖蛋白或糖基化。与其它物种(例如兔或猫)相比，来自正常大鼠血液血清的抗体为显著岩藻糖基化的(Raju等人,2000)。Hamako及同事分析了来自不同物种的血清IgG抗体的糖组成且发现来自大鼠血液血清的内源性抗体的92.8%是岩藻糖基化的，此比例高于多数其它物种的血清IgG (Hamako等人，1993)。
[0040]因此，预计大鼠H4-11-E细胞会产生具有高岩藻糖含量而非低岩藻糖含量的糖蛋白或糖基化。
[0041]但意想不到的是，大鼠肝癌细胞H4-11-E细胞的情形正好相反。本发明显示，源自大鼠肝的H4-11-E细胞系(例如以保藏号DSM ACC3129(H4-11-E)保藏于DSMZ的细胞及以保藏号DSM ACC3130(H4-11-Es)保藏于DSMZ的细胞)可通过其在产生岩藻糖含量显著低于任一其它细胞系的抗体的能力上令人惊奇地与源自不同物种的许多其它细胞系区别开来。
[0042]Shinkawa及同事阐述大鼠骨髓瘤细胞系YB2/0用于抗体产生的用途(Shinkawa等人，2003)。YB2/0细胞是天然生成岩藻糖基化降低34-91%的Fe糖结构、从而在ADCC分析中产生提高最多50倍的活性的抗体生产细胞系。因此，YB2/0细胞与H4-11-E细胞(已知的产生者细胞)不同。然而，作为骨髓瘤细胞系，YB2/0细胞对细胞凋亡相当敏感，且对细胞压力显示低稳健性，从而使得此细胞系不适于工业产生过程。如所报导，YB2/0细胞中的岩藻糖基化更为高度可变，从而使得难以将岩藻糖基化控制并维持在某些阈值内。相比之下，阐述于本发明中的H4-11-E细胞令人惊奇地显示，去岩藻糖基化程度及一致性高于针对YB2/0细胞所报导的。此外，H4-11-E细胞是稳健的且对压力或其它细胞凋亡诱导刺激物不敏感，如通常使用H4-11-E细胞作为模型系统的许多毒性研究中所显示。直接比较H4-11-E细胞及YB2/0细胞对不同细胞压力(渗透压力、温度压力、机械压力、化学压力)的敏感性显示，H4-11-E细胞在各方面皆优于YB2/0细胞。因此H4-11-E细胞比YB2/0细胞意想不到地更适于用作工业产生过程的宿主细胞系。
[0043]用于获得具有非岩藻糖基化糖结构的产物的另一先前方法是使CHO中编码岩藻糖转移酶8(Fut8)的基因靶向失活，此可导致分泌蛋白(例如抗体产物)的聚糖中完全损失α 1,6-岩藻糖基化(Yamane-Ohnuki等人,2004)。应用siRNA敲弱(knockdown)技术来削弱Fut8基因活性的替代性方法允许产生部分去岩藻糖基化抗体(Mori等人，2004)。这些抗体显示强50至100倍的ADCC活化。然而，所述与使用H4-11-E细胞作为产生细胞不同的策略的缺陷在于，对现有宿主细胞系实施遗传改造一定会比仅仅对所关注分泌蛋白实施糖基化影响更多细胞过程。除期望的突变效应外，与H4-11-E细胞不同的经遗传改造的宿主细胞系亦可显示一些变化，例如在(例如)产生过程发展之后期阶段出现的产量降低或不稳定性或不可预测的问题。此外，经遗传改造的细胞系经常需要主动选择以稳定遗传改变的效应，从而增加工业产生过程的调节负担。
[0044]除显示降低的岩藻糖基化外，H4-11-E细胞亦显示在FutS缺乏的CHO细胞未发现的其他有益性质，例如半乳糖基化及唾液酸化增加。
[0045]优点
[0046]本领域认为候选细胞系的以下性质相对于现有的生产细胞系而言是有利的:
[0047]细胞系应为未经遗传改造的天然(幼稚)宿主细胞系。
[0048]细胞系应能够产生具有有利糖基化模式的蛋白。
[0049]细胞系应稳定显示期望糖模式而无需选择(例如凝集素抗性)。
[0050]这些细胞系可在无血清培养基中悬浮培养。
[0051]这些细胞系的特征在于对压力或细胞凋亡刺激物的高稳健性及低敏感性。
[0052]阐述于本发明中的大鼠肝癌细胞系H4-11-E组合多数所述有利属性。
[0053]与用于获得岩藻糖基化经降低的抗体的先前方法(其主要基于对现有生产细胞系的遗传改造)不同，H4-11-E细胞天然地(即，无遗传操作、诱变或选择)适合用于产生具有有利糖基化模式的重组蛋白及其治疗应用。[0054]与当前使用的产生宿主细胞系中制造的蛋白不同，H4-11-E中产生的抗体显示不同有益糖基化性质的组合，从而显著增进产生质量:
[0055]-低岩藻糖基化或缺乏岩藻糖:>80%非岩藻糖基化双触角结构聚糖
[0056]—提高活化效应子功能(例如ADCC)的潜力
[0057]-高半乳糖基化:>40%半乳糖基化双触角结构聚糖[0058]—提高活化效应子功能(例如CDC)的潜力
[0059]H4-11-E细胞中产生的抗体从而具有活化抗体依赖性效应子功能(例如ADCC及CDC)的高潜力。此活化与抗体与不同Fe受体的结合相关联。除对FcgRIIIa的较高活化外，H4-11-E中产生的抗体亦具有较低程度地活化抑制性受体Fe Y RIIb的潜力。此有益效应使H4-11-E中产生的抗体能够增强由巨噬细胞介导的免疫反应，这是因尤其中性粒细胞亦表达抑制受体。因此，H4-11-E细胞中产生的治疗性抗体尤其对肿瘤靶标且亦对其他适应症在其治疗效率上优于以常规方式产生的抗体。
[0060]-不存在免疫原性残基:缺乏Gal-α I, 3-Gal-连接及NeuGc-残基
[0061]—无过敏或免疫原性反应
[0062]缺乏潜在免疫原性糖结构(例如Gal- α I, 3-Gal-连接糖或NeuGc-残基)是H4-11-E细胞中产生的糖蛋白(例如抗体或Fe-融合蛋白)的另一优点。可在小鼠骨髓瘤细胞系NSO或SP2/0中产生的抗体中发现 这些结构，若将其施加于敏感患者，可诱导不期望的炎性反应或免疫原性排斥。
[0063]-唾液酸化:末端α2，3或α 2，6_连接的NeuAc-残基
[0064]—提高的血清稳定性(血清半衰期)
[0065]Η4-ΙΙ-Ε细胞中所产生抗体的聚糖的末端唾液酸化对治疗性抗体的血清稳定性及分解代谢半衰期具有额外积极效应。
[0066]Η4-ΙΙ-Ε大鼠肝癌未经遗传改造且无需在凝集素存在下进行选择或培养以维持其产生有益糖基化模式的能力的细胞。
[0067]此外，Η4-ΙΙ-Ε细胞系可在无血清培养基中悬浮培养。即使Η4-ΙΙ-Ε细胞(例如以保藏号DSM ACC3129(H4-11-E)保藏于DSMZ的细胞)通常使用含血清培养基进行贴壁培养(其亦由美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection) (ATCC,保藏编号 CRL-1548)或欧洲细胞培养物保藏中心(European Collection of Cell Cultures)(ECACC，保藏编号87031301)所推荐)，亦可在本发明中证实，与在含血清培养基中贴壁培养物的生长相比，H4-11-E细胞可成功地适应于在无血清培养基中悬浮生长而不会损害24至32小时的群加倍时间(例如以保藏号DSM ACC3130 (H4-11-E)保藏于DSMZ的细胞)。
[0068]H4-11-E细胞在无血清培养基中的加倍时间是24至32小时。达成Η4_ΙΙ_Ε细胞在无血清培养基中悬浮恒定生长及这些有利加倍时间的关键因素是在培养基中去掉钙。若在细胞培养基中存在钙，则Η4-ΙΙ-Ε细胞不会悬浮生长且加倍时间更长，此使得按照商业规模应用于生物药物生产不具吸引力。
[0069]Η4-ΙΙ-Ε细胞在生物药物生产过程中用作宿主细胞的另一优点为其高稳健性及低压力敏感性或低细胞凋亡敏感性。其它生产细胞系(例如骨髓瘤细胞系ΥΒ2/0)亦显示出有益糖模式，但同时对任一种类的压力皆极敏感且因此不适于在大规模产生过程中培养。
[0070]除先前提及的优点外，Η4-ΙΙ-Ε细胞中产生的治疗性蛋白亦具有以下额外有益性质:
[0071]较高有效性及稳定性=降低的所需剂量
[0072]提闻的患者便利性(减小的治疗(输注)频率)
[0073]经由降低的循环剂量所达成降低的副作用风险
[0074]用于供应临床及市售材料的缩短的时间线及降低的成本[0075]—总之:降低的治疗成本。
[0076]适用性
[0077]H4-11-E大鼠细胞可用于工业生产在治疗上具有高活性的蛋白、优选抗体或Fe-融合蛋白，从而在给予患者后可有效活化效应子功能。
[0078]具有显著降低的核心岩藻糖含量，H4-11-E产生的抗体或Fe-融合蛋白对多态性受体Fe Y RIII (CD16-F158，CD16-V158)显示较高的亲和力且较低程度地活化抑制受体Fe YRIIb。从而，与岩藻糖基化CHO产生的抗体不同，H4-11-E产生的抗体不仅可快速且有效地募集并活化CD16阳性细胞，而且亦可募集并活化巨噬细胞及中性粒细胞以活化免疫系统的细胞毒性功能。显示半乳糖基化高于以常规方式产生的抗体，H4-11-E细胞中修饰并分泌的产物可另外更有效地结合补体系统的组份(即Clq)且从而活化可最终杀伤靶细胞的另一级联。
[0079]出于多种原因(参见上述优点)，H4-11-E细胞是所选用于产生抗体或Fe-融合蛋白、尤其是那些识别肿瘤靶标者的细胞系。通过H4-11-E细胞中产生的抗体或Fe-融合蛋白对效应子功能ADCC及CDC实施的增进活化，亦使得在抗体治疗后对不受患者免疫系统有效攻击的实体肿瘤实施有效治疗。
[0080]H4-11-E细胞中产生的抗体的经增进血清稳定性在许多治疗领域、尤其是在当前必须将治疗物质频繁地且重复地递送至患者的慢性疾病中有益。
[0081]图1:不同细 胞系中所产生糖蛋白上糖结构的预测性相对含量。
[0082]分析源自不同物种及所述物种内不同组织的已建立细胞系的糖性质。通过测量细胞中的酶促活性及分析细胞表面上的结构来估计所述细胞系中所产生蛋白上岩藻糖、α -2，6唾液酸化结构、N-乙酰基神经氨酸(NeuAc)、半乳糖-1, 3_半乳糖(Gal_l, 3-Gal)及N-羟乙酰神经氨酸(NeuGc)的相对含量。将所获得值标准化为在中国仓鼠卵巢细胞系(CHO)中获得的结果且绘制为各别糖结构的经预测相对含量的曲线。
[0083]缩写:ha,仓鼠；mo,小鼠；gp,豚鼠；rab,兔；go,山羊；sh,绵羊；hu,人类；ch,鸡；du,鸭；te,睾丸；ov,卵巢；pa,胰腺；ki,肾；Ii,肝；carc,肝癌/瘤；eo,食管；Iu,肺；br.canc,乳癌；c0.carc,结肠癌；my,骨髓瘤；pr.1y,初代淋巴母细胞样细胞；pr.b.m,骨髓干细胞；emb.fib,胚胎纤维母细胞。
[0084]图2:CH0、Lecl3、YB2/0及Η4_ΙΙ_Ε细胞中产生的IgGl抗体在其糖基化模式的不
同:岩藻糖基化。
[0085]分析CH0-DG44细胞、CHO-Lec13突变体、ΥΒ2/0大鼠骨髓瘤细胞及Η4_ΙΙ_Ε大鼠肝癌细胞中所产生IgGl抗体的Fe聚糖的结构及组成。在通过用PNGase F实施酶促消化还原后自纯化抗体释放聚糖。将聚糖纯化，用2-氨基苯甲酰胺(2-ΑΒ)进行荧光标记且在用外切糖苷酶α -岩藻糖苷酶或其它外切糖苷酶处理之前及之后，在HPLC柱上进行分级分离。大多数糖结构是非唾液酸化双触角结构聚糖。自外切糖苷消化之前及之后的色谱峰面积比来计算岩藻糖基化及非岩藻糖基化双触角结构聚糖及其它糖苷结构(唾液酸化聚糖、高甘露糖结构或杂合聚糖)的比例。
[0086]图3 =CHO及Η4-ΙΙ-Ε中所产生IgGl抗体的糖模式:半乳糖基化[0087]分析CH0-DG44细胞及Η4_ΙΙ_Ε大鼠肝癌细胞中所产生IgGl抗体的Fe聚糖的结构及组成。在通过用PNGase F实施酶促消化还原后自纯化抗体释放聚糖。将聚糖纯化，用2-氨基苯甲酰胺(2-ΑΒ)进行荧光标记且在用外切糖苷酶半乳糖苷酶或其它外切糖苷酶处理之前及之后，在HPLC柱上进行分级分离。自外切糖苷消化之前及之后的色谱峰面积比率来计算半乳糖基化对非半乳糖基化双触角结构聚糖的百分比。
[0088]图4 =CHO及Η4-ΙΙ-Ε中产生的IgGl抗体的糖模式:唾液酸化
[0089]分析CH0-DG44细胞及Η4_ΙΙ_Ε大鼠肝癌细胞中所产生IgGl抗体的Fe聚糖的结构及组成。在通过用PNGase F实施酶促消化还原后自纯化抗体释放聚糖。将聚糖纯化，用2-氨基苯甲酰胺(2-ΑΒ)进行荧光标记且在用外切糖苷酶神经氨酸酶或其它外切糖苷酶处理之前及之后，在HPLC柱上进行分级分离。自外切糖苷消化之前及之后的色谱峰面积比率来计算唾液酸化双触角结构聚糖的百分比。
[0090]图5:使Η4-ΙΙ-Ε细胞适应于在无血清培养基中悬浮生长
[0091](Α)Η4-ΙΙ-Ε细胞在含有10%FcS的MEMalpha培养基中的贴壁生长。(B)H4-1I_E细胞在适应于振荡烧瓶中的无血清无Ca培养基中生长后的悬浮培养物。(C)以两种不同接种物细胞密度接种的BI SFM培养基中的H4-11-E培养物的生长曲线。在37° (:、5%0)2及120rpm下在振荡烧瓶中培育培养物。在所示时间点测量活细胞浓度。
[0092]缩写:BI_SFM, Boehringer Ingelheim无血清无钙培养基；FcS,胎牛血清；VCC,活细胞浓度；4*105个细胞/ml=400，000个细胞/ml ;6*105个细胞/ml=600，000个细胞/ml。
[0093]图6:H4-11-E细胞 对细胞凋亡的低敏感性及对细胞压力的高稳健性
[0094](A)在将含有等细胞数的细胞悬浮物加热至42° C并维持2小时且随后在37° C、5%C02下培育22小时后，H4-11-E细胞(黑色条形图)及YB2/0细胞(灰色条形图)的相对活细胞密度及活力。将对照细胞在37° C、5%C02下培养24小时。在热压力后，H4-11-E细胞显示显著较高的活细胞密度及活力。(B)在37° (:、5%0)2下在用去矿质水(低离子强度)或10XPBS(高离子强度)稀释的培养基中培育24小时后，H4-11-E细胞及YB2/0细胞的相对活细胞密度及活力。在未稀释培养基中培养对照细胞。在低或高渗透性下培育后，H4-11-E细胞显示显著较高的活细胞密度及活力。(C)在37° C、5%C02下用2μ g/ml或5 μ g/ml嘌呤霉素将含有等细胞数的细胞悬浮物处理48小时后，H4-11-E细胞及YB2/0细胞的相对活细胞密度及活力。在37° C、5%C02下在无嘌呤霉素培养基中将对照细胞培养48小时。在药物处理后H4-11-E细胞显示显著较高的活细胞密度及活力。
[0095]图7:单细胞悬浮培育H4-11-E细胞对Ca2+减少或无Ca2+培养基的需要。
[0096](A)使用Hitachi917 (Roche)来分析两种适于悬浮培育Η4_ΙΙ_Ε细胞的培养基的Ca含量。含有极低Ca浓度的AEM培养基及BI专利培养基的无Ca形式，二者皆适于单细胞悬浮培育Η4-ΙΙ-Ε细胞(B、D)。(B)-(E)以3*105个细胞/ml=300，000个细胞/ml的密度将适应于在AEM中或在BI (无Ca)培养基中悬浮生长的H4-11-E细胞接种于存于12孔板中的添加或不添加CaCl2的所示培养基中。接种后3天对生长形态及细胞聚集进行显微分析。(B)H4-11-E细胞在AEM培养基中以单细胞形式悬浮生长。(C)H4-1I_E细胞在补充有lmM=lmMol/L CaCl2的AEM中形成大聚集体。(D)H4-1I_E细胞在无Ca BI专利培养基中以单细胞形式悬浮生长。(E)H4-11-E细胞在BI培养基(根据(A)中的分析，含有1.38mM=l.38mMol/L Ca)中形成大聚集体。(F)以3*105个细胞/ml=300，000个细胞/ml的密度将适应于在BI (无Ca)培养基中悬浮生长的H4-11-E细胞接种于存于12孔板中的BI培养基(含有Ca)中并将所示量的EDTA添加至培养物中。接种后3天对生长形态及细胞聚集进行显微分析。应注意，培养基中游离Ca2+的剂量依赖性、EDTA介导的消耗可减少细胞聚集并提高悬浮单细胞的比例。
[0097]图8:经悬浮H4-11-E细胞的Ca2+浓度依赖性及Mg2+非依赖性聚集。
[0098](A)以4*105个细胞/ml=400，000个细胞/ml的密度将适应于在BI (无Ca)培养基中悬浮生长的H4-11-E细胞接种于存于12孔板中的BI (无Ca)培养基中并将所示量的CaCl2添加至培养物中。接种后2天对生长形态及细胞聚集进行显微分析。注意经悬浮H4-11-E细胞的浓度依赖性、Ca2+介导的细胞聚集。(B)以4*105个细胞/ml=400，000个细胞/ml的密度将适应于在BI (无Ca)培养基中悬浮生长的H4-11-E细胞接种于存于12孔板中的BI (无Ca)培养基中并将所示量的MgCl2添加至培养物中。接种后2天对生长形态及细胞聚集进行显微分析。应注意细胞独立于Mg2+浓度以单细胞形式悬浮生长。(C)以3*105个细胞/ml=300，000个细胞/ml的密度将适应于在AEM培养基中悬浮生长的H4-11-E细胞接种于存于振荡烧瓶中的AEM培养基中且将所示量的CaCl2或MgCl2添加至培养物中。在37° C、5%C02及120rpm下培育培养物。利用CEDEX细胞量化系统(Innovatis)来分析活细胞密度及细胞聚集率。应注意，若培养基中的CaCl2浓度高于100 μ M，则培养物的活细胞密度显著下降。相比之下，增加MgCl2的浓度对活细胞密度无影响。此外，应注意，细胞聚集率随着CaCl2浓度增加而增加且在CaCl2浓度>250 μ M时达到饱和。相比之下，增加MgCl2的浓度对Η4-ΙΙ-Ε细胞的聚集率无影响。
[0099]图9:CH0及Η4-ΙΙ-Ε中所产生IgGl与Fe YRIIIa的结合亲和力。
[0100]如下使用BIAcore TlOO 仪器及 CM5 传感器芯片(BIACORE, Uppsala, Sweden)来测量不同细胞系中产生的IgGl与Fe Y RIIIa的结合动力学。将可溶性重组Fe y RIIIa固定至BIAcore传感器芯片上。以6种不同浓度(自4.17nM至133.3nM)将经纯化的IgGl稀释于 HBS-EP 缓冲液(0.01M HEPES,0.15M NaCl, 3mM EDTA，0.005%Surfactant Ρ20，ρΗ7.4)中，且以5mL/分钟的流速将每一经稀释的IgGl注射于受体捕获传感器表面上。在25° C利用HBS-EP作为运行缓冲液来实施所述实验。将无试样IgGl的缓冲溶液注射于受体捕获传感器表面上作为空白对照。通过以IOmL/分钟的流速将7.5mM HCl注射30秒来去除结合至传感器表面的可溶性Fe Y RIIIb及IgGl。在数据分析前针对空白对照校正由注射IgGl获得的数据。通过稳态分析使用BIAcore TlOO动力学评估软件(BIACORE)来计算对FcYRIIIa的亲和力(KD)。应注意，H4-11-E细胞系中产生的IgGl与受体的结合亲和力高于CHO中产生的IgGl。
[0101]图10:CH0及H4-11-E中产生的IgGl的效应子功能:ADCC。
[0102]通过乳酸脱氢酶(LDH)释放分析来实施ADCC分析，其中使用通过Lymphoprep (AXIS SHIELD, Dundee, UK) 自健康供体制备的人类外周血液单核细胞(PBMC)作为效应子细胞。将靶肿瘤细胞(表达人类CD20的人类伯基特氏淋巴瘤细胞系Ramos)的等分试样分配至96孔U形底板(存于50 μ I/孔中的10，000个细胞)中且在PBMC (100 μ L)存在下以20/1的Ε/Τ比率与抗体的连续稀释液(50 μ L) 一起培育。在37° C培育4小时后，使用非放射性细胞毒性分析试剂盒(Promega，Madison，WI)测量上清液LDH活性。根据下式自试样活性计算特异性细胞溶解百分比:特异性溶解[%]=100X (E-Se-St)/(M-St)。FU代表荧光单位。
[0103]应注意，与CHO中产生的IgGl相比，H4-11-E中产生的IgGl具有更强ADCC活化。
[0104]图11:CH0及H4-11-E中所产生IgGl与FcRn的结合亲和力。
[0105]使用BIAcore TlOO仪器及CM5传感器芯片来测量人类IgGl-FcRn相互作用的动力学。使用胺偶合试剂盒(BIACORE)将抗人类b2-微球蛋白单克隆抗体(Abeam, Cambridge, UK)固定至芯片上。通过以5mL/分钟的流速注射可溶性FcRn_b2微球蛋白复合物，通过经固定的抗b2-微球蛋白抗体来捕获该复合物。将无该复合物的缓冲溶液注射于抗体捕获传感器表面上作为空白对照。以5种不同浓度(自4.17nM至66.7nM)将每一经纯化的IgG稀释于pH调节至6.0的HBS-EP+缓冲液(0.01M HEPES,0.15M NaCl,3mM EDTA, 0.05%Surfactant P20)中，且以5mL/分钟的流速将每一经稀释的IgGl注射于捕获复合物的传感器的表面或空白上。通过以60mL/分钟的流速将7.5mM HCl注射I分钟来去除结合至传感器表面上的可溶性FcRn及IgGl。在25° C利用HBS-EP+作为运行缓冲液来实施所述实验。使用通过减去空白获得的数据进行数据分析。使用BIAcore TlOO评估软件通过二元拟合模型来计算表观缔合速率常数(ka)、解离速率常数(kd)及结合亲和力(KD)。应注意，H4-11-E中产生的抗体结合FcRn的程度与CHO中产生的抗体相当。
[0106]序列表说明
[0107]SEQ ID NOl:0_连接糖基化位点的氨基酸序列
[0108]SEQ ID N02:抗CD20IgGlmAb重链的氨基酸序列
[0109]SEQ ID N03:抗CD20IgGlmAb轻链的氨基酸序列
[0110]SEQ ID N04:抗CD20IgG4mAb重链的氨基酸序列
`[0111]SEQ ID N05:抗CD20IgG4mAb轻链的氨基酸序列
[0112]SEQ ID N06:MCP1-Fc融合蛋白的氨基酸序列
[0113]SEQ ID N07:EP0-Fc融合蛋白的氨基酸序列。
[0114]发明详述
[0115]已知翻译后蛋白修饰对蛋白的生物活性、稳定性及免疫原性具有关键效应。分泌蛋白的最常见翻译后修饰是糖基化且所有主要的经批准的治疗性生物药物(包括重组抗体或重组Fe-融合蛋白)均为糖蛋白。
[0116]由于正确糖基化模式对于治疗活性及特异性是不可缺少的，因此多数糖蛋白治疗剂在能够生成糖基化模式的复杂光谱的真核表达系统中产生。当前，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞已成为用于产生重组蛋白的标准哺乳动物宿主细胞。然而，已知不同真核生产细胞系产生不同Fe糖基化模式且从而对治疗性抗体的生物活性具有重要影响。此外，已知某些确定的糖结构在活化具体下游效应子机制上比其它更有效。带有多数人类样糖基化模式的治疗性抗体在活化抗肿瘤效应子机制上并不尤其有效，但同时，这些抗体不太可能引起患者的不期望的过敏性或免疫原性排斥反应且因此视为完全的。为增进(例如)由抗癌症抗体诱导的细胞杀伤活性，期望产生不同糖基化模式。同样，经改变的糖基化模式可增进其它抗体依赖性效应子功能或其可改变血清半衰期，而不会损害治疗产品本身的安全性或稳定性。
[0117]在本发明中，具体选择并分析源自多种物种、组织及细胞谱系的不同细胞系。对暴露于细胞表面上的聚糖以及在细胞内的酶促活性进行了检验(图1)。从而，可赋予每一细胞系合成某些糖基化模式的能力。选择及分析显示细胞系在其糖基化能力上明显有差异，此根据其所源自的物种与组织或细胞谱系二者而定。仅少数细胞系天然显示低岩藻糖基化能力，此糖基化特性对抗体依赖性细胞毒性途径(ADCC)的活化具有积极影响。一些细胞系能够生成可增进治疗蛋白的血清稳定性的唾液酸化结构。一些细胞系产生免疫原性糖结构(例如Gal-1，3-Gal及NeuGc)，从而引起人类的炎性反应。对本发明的分析显示，单独给定细胞系的物种来源或组织、器官或细胞谱系皆不能单独确定细胞的糖基化能力。因此，遗传及后生因素影响细胞合成某些糖基化模式的能力。因此，本发明数据证实，仅仅基于对源自相同组织和/或物种的另一细胞系中获得的糖模式的了解，不可能预测细胞系的糖基化性质(图1)。
[0118]显示若干性质(例如降低的岩藻糖基化、缺乏免疫原性残基及存在α _2，6连接的唾液酸)的唯一细胞系系大鼠肝癌细胞系Η4-ΙΙ-Ε。所述性质积极影响重组生物治疗剂、尤其是抗体或Fe-融合蛋白的活性及稳定性。所选细胞系Η4-ΙΙ-Ε是所有所分析细胞系在此分析中唯一未显示可检测的岩藻糖基化迹象者。此令人感到惊奇，这是因其它大鼠细胞系及其它肝细胞系具有不同性质。此外，据阐述，大鼠血液血清抗体为显著岩藻糖基化的，而根据文献，其它物种(例如兔或猫)在血清抗体上具有低于大鼠的岩藻糖含量(Raju等人，2000)。
[0119]糖结构(例如Gal-1，3-Gal及NeuGc)具有潜在免疫原性。H4-11-E大鼠细胞不显示这些潜在免疫原性糖结构。H4-11-E大鼠细胞另外不产生具有这些潜在免疫原性糖结构的抗体或Fe-融合蛋白。实际上，具有潜在免疫原性的诸如Gal-1，3-Gal及NeuGc等的糖结构在所选人类或大鼠细胞系中皆未出现，而源自小鼠、兔及其它物种的细胞系则一致地产生这些可诱导人类的免疫原性反应的结构。因此，根据本发明的实验数据，所述潜在免疫原性糖结构由细胞以物种依赖性方式附着至分泌糖蛋白。
[0120]为验证H4-11-E细胞能够产生具有预测糖基化性质的分泌糖蛋白，通过对相应DNA构建体实施转染并随后选择稳定整合产物基因及抗生素抗性标记物的细胞来生成产生稳定重组抗体的H4-11-E细胞。获得产生抗体的细胞群并将其作为贴壁细胞层培养。H4-11-E细胞另外适应于悬浮生长且可在无血清化学限定培养基中培养(图5)。通过蛋白质A色谱自细胞培养上清液纯化抗体。分析Fe糖基化并将其与在CH0-DG44、CH0-Lecl3突变体及YB2/0大鼠骨髓瘤细胞中产生的抗体上获得的模式进行比较。双触角结构聚糖占所有4种IgGl制剂中的最大部分。在双触角结构聚糖的比例内，CH0-DG44细胞如先前所报导主要(约95%)产生岩藻糖基化形式。相比之下，H4-11-E细胞中表达的IgGl中的80%以上含有无岩藻糖的双触角结构聚糖，此比例显著高于在细胞系YB2/0或CHO突变体Lecl3中产生抗体(图2)。对H4-11-E细胞中产生的抗体上糖基化模式的详细分析亦显示，>40%聚糖是半乳糖基化的，此比例高于在CH0-DG44中产生抗体时所获得的比例，而该CH0-DG44宿主细胞系通常用于生物药物蛋白的产生(图3)。此外，H4-11-E细胞中产生的约8%抗体带有末端唾液酸残基，若在CH0-DG44细胞中产生重组抗体，则通常不会发现所述末端唾液酸 残基(图4)。末端唾液酸残基可对修饰抗体的活性及稳定性具有不同影响。最近出版物显示唾液酸可抑制抗体的炎性活性(Burton及Dwek, 2006 ;Scallon等人,2007)。其它数据显示，不存在唾液酸可提高小鼠肝的代谢速率，从而表明通过基于肝的受体的清除(Wright等人，2000)。发现唾液酸衍生物(例如N-羟乙酰神经氨酸(NeuGc))在人类中具有免疫原性(Noguchi等人，1995)。然而,不能检测出H4-11-E细胞中产生蛋白上NeuGc修饰的证据(图1)。总之，H4-11-E源的抗体缺乏潜在免疫原性残基。
[0121]所述表达数据证实了对有利糖基化模式的预测分析中获得的结果(图1)。总之，大鼠肝癌细胞系H4-11-E本身因能生成若干种有益糖基化模式而与其它细胞系区别开来。H4-11-E细胞中在抗体产生后获得的所述糖基化模式可表 达为在ADCC分析中抗体与FcyRIII受体的经增进结合亲和力及极佳活性、在CDC分析中与补体系统组份的较强结合及增强的活性、与新生儿Fe受体FcRn的较强结合(对抗体稳定性及血清半衰期具有积极效应)。
[0122]除产生有益糖性质外，H4-11-E细胞的特征亦在于对压力或细胞凋亡诱导刺激物的高稳健性及低敏感性。据此，H4-11-E细胞可适应于在无血清培养基中悬浮生长。H4-11-E细胞在不同培育模式下生长良好且可在进料分批过程中以高活力悬浮培养10天以上。总之，H4-11-E细胞可对于大规模工业产生效应子活性突出且血清半衰期延长的生物治疗剂带来极佳质量。
[0123]定义
[0124]一般实施方案“包含”或“包括”涵盖更具体的实施方案“由…组成”。此外，单数及复数形式并不以限定方式使用。本发明所用术语具有以下含义。
[0125]本发明涉及所有源自“Reuber H-35肝癌”的大鼠肝癌细胞系((REUBER，1961)及1964 (ΡΙΤ0Τ等人，1964))。"Reuber H-35肝癌”是在AxC大鼠中通过化学致癌作用所诱导。源自这些“Reuber H_35肝癌”的细胞系包括(例如)H4-11-E及H4-11-E-C3细胞系及其衍生物或子代。
[0126]更特别是，“H4-11-E细胞”意指源自欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC，目录编号87031301)或美国典型培养物保藏中心(ATCC，保藏编号CRL-1548)或源自于1961年(REUBER, 1961)及1964年(ΡΙΤ0Τ等人，1964)分离且首先阐述于文献中的大鼠肝癌细胞系的细胞。特别是，H4-11-E细胞是具有ECACC目录编号87031301或ATCC编号CRL-1548的细胞。
[0127]术语“H4-11-E细胞”另外意指H4-11-E-C3细胞系(CRL-1600或HPACC编号85061112) ;H4II细胞系(HPACC编号89042702)，其亦源自“Reuber H35肝癌”且与H4-11-E-C3 (ECACC 目录编号 85061112)相同；H4_TG 细胞系(CRL-1578)，其为具有 HPRT 缺陷且恒定表达苯丙氨酸羟化酶的CRL-1600衍生物；H5细胞系(HPACC，编号94101905)，其也是H4-11-E-C3 (CRL-1600)的亚纯系；及H4-S细胞系(HPACC编号89102001)，其为经VS病毒感染的大鼠肝癌细胞。
[0128]术语“H4-11-E细胞”亦包含源自最初经保藏的Η4_ΙΙ_Ε细胞的细胞，以及最初保藏Η4-ΙΙ-Ε细胞的子代或源自最初经保藏的Η4-ΙΙ-Ε细胞的细胞。
[0129]因此，术语“Η4-ΙΙ-Ε细胞”包含Η4_ΙΙ_Ε细胞的未经修饰或经修饰的后代/形式。Η4-ΙΙ-Ε细胞的这些未经修饰或经修饰的后代/形式亦称作最初保藏的Η4-ΙΙ-Ε细胞的“衍生物或子代”。
[0130]Η4-ΙΙ-Ε细胞的未经修饰形式是构成Η4-ΙΙ-Ε细胞的未经修饰功能亚单位的所产生的全部细胞。一些实例包括:未经修饰细胞系的亚纯系、其经纯化或分级分离亚群。
[0131]Η4-ΙΙ-Ε细胞的经修饰形式(或衍生物或子代)是经由引入功能DNA序列、尤其是那些赋予各别起始细胞产生重组蛋白、尤其是糖蛋白(包括抗体或Fe-融合蛋白)的潜力者自亲本H4-11-E细胞生成的全部细胞。
[0132]H4-11-E细胞的修饰形式(或衍生物或子代)是经由诱变或靶向基因修饰或基因整合自亲本H4-11-E细胞生成的全部细胞。这些经修饰的H4-11-E细胞系经遗传改造的H4-11-E细胞，其包含转基因(例如脂质转移蛋白CERT，亦称为Goodpasture抗原结合蛋白)、转录因子(例如上游结合因子UBF)或编码Sec-1/MunclS蛋白家族成员的基因。
[0133]经修饰的H4-11-E细胞的其它实例是敲除或敲弱一或多种基因(例如DHFR(二氢叶酸脱氢酶)、GS (谷氨酰氨合成酶)、TIP-5或SNF2H)的Η4-ΙΙ-Ε细胞。尤其敲除DHFR或GS的Η4-ΙΙ-Ε细胞在重组蛋白表达的情形下因有利选择选项而可用于生物药物生产。
[0134]这些敲除或敲弱DHFR或GS的Η4-ΙΙ-Ε细胞是营养缺陷型细胞的实例。敲除或敲弱DHFR的Η4-ΙΙ-Ε细胞是次黄嘌呤(H)及胸苷(T)营养缺陷型。敲除或敲弱GS的Η4-ΙΙ-Ε细胞是谷氨酰氨营养缺陷型。但存在本领域技术人员可生成的其它营养缺陷型Η4-ΙΙ-Ε细胞。
[0135]Η4-ΙΙ-Ε细胞的经修饰形式(或衍生物或子代)另外意指经由对特殊培养基、生长、培养模式或选择物质的适应自亲本Η4-ΙΙ-Ε细胞生成的任一细胞。
[0136]特别是，术语Η4-ΙΙ-Ε细胞涉及两种保藏细胞系。本发明的Η4_ΙΙ_Ε细胞系已于2011年6月28日根据布达佩斯条约以保藏号DSM ACC3129 (Η4-ΙΙ-Ε)保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ, Inhoffenstrasse7B, D-38124Braunschweig, Germany)。
[0137]适应于在阐述于本发明中的无血清无Ca2+培养基中悬浮生长的H4-11-E细胞系已于2011年6月28日根据布达佩斯条约以保藏号DSM ACC3130 (H4-1I_Es)保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ, Inhoffenstrasse7B, D-38124Braunschweig, Germany)。
[0138]本文所用术语“细胞”及“细胞系”尤其是指表达细胞/表达细胞系及宿主细胞/宿主细胞系。
[0139]术语钙减少或优选无钙的培养基意指限定含有I μ mol/L-500 μ mol/L Ca2+离子的培养基，更优选地钙减少的培养基含有I μ mol/L-250 μ mol/L Ca2+离子且甚至更优选地钙减少或无 Ca 培养基含有 O μ mol/L-100 μ mol/L 或 0.5 μ mol/L-100 μ mol/L Ca2+离子。在AEM培养基中，在培养3天后添加250 μ M/L CaCl2或更高CaCl2浓度会显著损害Η4-ΙΙ-Ε细胞生长。在补充有250yM/L CaCl2或更高CaCl2浓度的AEM培养基中，80%以上的细胞形成紧密聚集体。亦可经由将EDTA添加至最初含有钙的培养基中，从而通过与EDTA形成络合物以降低培养基游离钙离子的浓度来获得钙减少的培养基。优选以介于400 μ mol/L-1200 μ mol/L 或 600 μ mol/L-1000 μ mol/L 或 700 μ mol/L-900 μ mol/L 之间的浓度添加EDTA。优选以800 μ mol/L左右的浓度添加EDTA。
[0140]市售无钙培养基的实例是MEM Joklik Modification(Sigma)或 MEM SpinnerModification(Sigma)。用于在血清存在下贴壁培育H4-11-E细胞的典型含钙培养基是含有 1360 μ mol/L Ca2+离子的鹰氏最低必需培养基(Eagle’s Minimum Essential Medium)(Sigma)。用于悬浮培育H4-11-E细胞的无血清钙减少的培养基是AEM(Invitrogen)。
[0141]与钙离子不同，镁离子对大鼠肝癌细胞/H4-11-E细胞的聚集率无影响。因此，大鼠肝癌细胞/H4-11-E细胞聚集具有镁(Mg2+)离子非依赖性，但具有钙(Ca2+)离子依赖性。
[0142]“糖基化位点”是指由真核细胞识别为糖残基附着位置的氨基酸残基。术语“糖苷结构”或“聚糖”是指附着至糖基化位点的糖残基。附着碳水化合物(例如寡糖)的氨基酸通常为天冬酰氨(N-连接)、丝氨酸(O-连接)及苏氨酸(O-连接)残基。具体附着位点通常由本文称作“糖基化位点序列”的氨基酸序列界定。
[0143]用于N-连接糖基化的糖基化位点序列是-Asn-X-Ser-或-Asn-X-Thr-,其中X可为常规氨基酸中除脯氨酸外的任一者。用于O-连接糖基化的主要糖基化位点为-(Thr或Ser)-X-X-Pro-(SEQ ID N01)，其中X为任一常规氨基酸。术语“N-连接”及“O-连接”是指在糖分子与氨基酸残基之间用作附着位点的化学基团。N-连接的糖经由氨基附着；0-连接的糖经由羟基附着。然而，并非蛋白中的所有糖基化位点序列皆必须经糖基化。一些蛋白为以糖基化形式与非糖基化形式二者分泌，而其它蛋白则在一个糖基化位点序列处经完全糖基化，但含有另一未糖基化的糖基化位点序列。因此，并非多肽中存在的所有糖基化位点序列皆必须为实际附着糖的糖基化位点。在生物合成期间初始N-糖基化插入“核心碳水化合物”或“核心寡糖”。
[0144]在N-连接糖基化中，碳水化合物部分经由GIcNAc附着至多肽链中的天冬酰氨残基。N-连接碳水化合物具有不同结构，但全部含有共同核心结构，其中结合天冬酰氨的末端GlcNAc称为还原端且相反侧称为非还原端:
1.一种包含编码抗体或Fe-融合蛋白的核酸序列的大鼠肝癌细胞，其中该核酸序列可操作地连接至至少一种允许表达该编码抗体或Fe-融合蛋白的核酸序列的调节序列。
2.权利要求1的大鼠肝癌细胞，其中该细胞为H4-11-E细胞。
3.权利要求或2的大鼠肝癌细胞，其中该细胞为: a)源自选自以下细胞的细胞:欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC，目录编号87031301)、美国典型培养物保藏中心(ATCC，保藏编号CRL-1548)、H4-11-E-C3细胞系(CRL-1600或HPACC 编号 85061112 或 ECACC 目录编号 85061112)、H4II 细胞系(HPACC Nr.89042702)、H4-TG 细胞系(CRL-1578)、H5 细胞系(HPACC, Nr.94101905)及 H4-S 细胞系(HPACCNr.89102001)，或 b)以编号ECACC目录编号87031301保藏于欧洲细胞培养物保藏中心或以保藏编号CRL-1548保藏于美国典型培养物保藏中心ATCC的细胞，或 c)以保藏号DSMACC3129(H4-11-E)保藏于DSMZ(德国微生物和细胞培养物保藏中心)的细胞，或 d)以保藏号DSMACC3130(H4-11-Es)保藏于DSMZ(德国微生物和细胞培养物保藏中心)的细胞，或 e)a)或b)或c)或d)中任 一细胞的衍生物或子代。
4.权利要求1-3中任一项的大鼠肝癌细胞，其中该细胞是以保藏号DSMACC3129(H4-11-E)保藏于DSMZ(德国微生物和细胞培养物保藏中心)的细胞或其中该细胞是以保藏号DSM ACC3130(H4-11-Es)保藏于DSMZ (德国微生物和细胞培养物保藏中心)的细胞。
5.权利要求1-4中任一项的大鼠肝癌细胞，其特征还在于 a)由该细胞表达的该抗体或Fe-融合蛋白中所含糖苷结构含有岩藻糖的程度小于20%、10% 或 5%,或 b)由该细胞表达的该抗体或Fe-融合蛋白中所含糖苷结构含有岩藻糖的程度在介于0% 至 20%、0% 至 10%、0% 至 5%、0.5% 至 20%、0.5% 至 10%、0.5% 至 5%、1% 至 20%、1% 至 10% 或1%至5%之间的范围内。
6.权利要求1-5中任一项的大鼠肝癌细胞，其特征还在于 a)由该细胞表达的该抗体或Fe-融合蛋白中所含糖苷结构含有至少一个半乳糖残基的程度超过40%、45%或50%，或 b)由该细胞表达的该抗体或Fe-融合蛋白中所含糖苷结构含有至少一个半乳糖残基的程度在介于 40%至 100%、45%至 100%、50%至 100%、51%至 100%、40%至 99.5%、45%至 99.5%、50% 至 99.5% 或 51% 至 99.5%,40% 至 99%、45% 至 99%、50% 至 99% 或 51% 至 99% 之间的范围内， 其中所述糖苷结构优选含有一或两个优选与所述糖苷结构的末端非还原端处的N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)连接的半乳糖残基(Gl或G2)。
7.权利要求1-6中任一项的大鼠肝癌细胞，其特征还在于 a)由该细胞表达的该抗体或Fe-融合蛋白中所含糖苷结构含有末端唾液酸或神经氨酸残基的程度超过5%或超过10%，或 b)由该细胞表达的该抗体或Fe-融合蛋白中所含糖苷结构含有末端唾液酸或神经氨酸残基的程度在介于O至8%、1%至8%、5%至10%、10%至50%或10%至45%之间的范围内。
8.权利要求1-7中任一项的大鼠肝癌细胞，其特征还在于其带有选择标记物基因，例如新霉素-磷酸转移酶(NPT);针对嘌呤霉素、潮霉素或Zeocin的抗性基因；或可扩增选择标记物基因，例如二氢叶酸还原酶(DHFR)或谷氨酰氨合成酶(GS)。
9.权利要求1-8中任一项的大鼠肝癌细胞，其中该允许表达该编码抗体或Fe-融合蛋白的核酸序列的调节序列是 a)启动子，或 b)增强子，或
c)5’-UTR 序列。
10.权利要求1-9中任一项的大鼠肝癌细胞，其中该抗体或Fe融合蛋白含有连接至N-天冬酰氨(N-Asn)残基的糖苷结构，其中该糖苷结构包含以下糖链:
11.权利要求1-10中任一项的大鼠肝癌细胞，其中该抗体或Fe融合蛋白含有连接至N-天冬酰氨(N-Asn)残基的糖苷结构，其中该糖苷结构包含以下糖链:
12.权利要求10或11的大鼠肝癌细胞，其中根据KabatEU命名法，该N-Asn优选为N-Asn(297)。
13.权利要求1-12中任一项的大鼠肝癌细胞，其中使该细胞适应于在无血清且钙减少或优选无钙的培养基中生长。
14.权利要求1-13中任一项的大鼠肝癌细胞，其中使该细胞适应于在悬浮培养物中生长。
15.权利要求1-14中任一项的大鼠肝癌细胞，其中该细胞与YB2/0细胞相比对细胞凋亡具有低敏感性和/或对细胞压力具有高稳健性。
16.一种产生所关注糖蛋白的方法，其特征在于以下步骤: a)提供大鼠肝癌细胞， b)任选使该步骤a)的细胞适应于在悬浮培养物中生长， c)任选使该步骤a)和/或步骤b)的细胞适应于在无血清培养基中生长， d)任选使该步骤a)和/或步骤b)和/或步骤c)的细胞在钙减少或无钙的培养基中生长， e)用编码所关注重组糖蛋白的核酸序列转染此任选经适应的大鼠肝癌细胞， f)在允许表达该所关注糖蛋白的条件下培育该步骤e)的转染细胞， g)任选分离并纯化该所关注糖蛋白。
17.权利要求16的方法，其中该大鼠肝癌细胞是H4-11-E细胞，优选地，该细胞为: a)源自选自以下细胞的细胞:欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC，目录编号87031301)、美国典型培养物保藏中心(ATCC，保藏编号CRL-1548)、H4-11-E-C3细胞系(CRL-1600或HPACC 编号 85061112 或 ECACC 目录编号 85061112)、H4II 细胞系(HPACC Nr.89042702)、H4-TG 细胞系(CRL-1578)、H5 细胞系(HPACC, Nr.94101905)及 H4-S 细胞系(HPACCNr.89102001)，或 b)以编号ECACC目录编号87031301保藏于欧洲细胞培养物保藏中心或以保藏编号CRL-1548保藏于美国典型培养物保藏中心ATCC的细胞，或 c)以保藏号DSMACC3129(H4-11-E)保藏于DSMZ(德国微生物和细胞培养物保藏中心)的细胞，或 d)以保藏号DSMACC3130(H4-11-Es)保藏于DSMZ(德国微生物和细胞培养物保藏中心)的细胞，或 e)a)或b)或c)或d)中任一细胞的衍生物或子代， 最优选地，该细胞是以保藏号DSM ACC3129(H4-11-E)保藏于DSMZ (德国微生物和细胞培养物保藏中心)的细胞，或以保藏号DSM ACC3130(H4-11-Es)保藏于DSMZ(德国微生物和细胞培养物保藏中心)的细胞。
18.权利要求16或17的方法，其中该步骤b)、c)和/或d)的培养基另外不含任一动物来源蛋白/肽。
19.权利要求16-18中任一项的方法，其中该转染步骤e)进一步包括将包含编码该所关注糖蛋白的核酸序列的表达载体引入该大鼠肝癌细胞中，该核酸序列可操作地连接至至少一种允许表达该编码所关注糖蛋白的核酸序列的调节序列。
20.权利要求16-19中任一项的方法，其中该所关注糖蛋白是抗体或Fe-融合蛋白，优选具有以下的抗体或Fe-融合蛋白 a)Fe yRIIIa结合活性且优选ADCC，或 b)补体结合活性且优选CDC，或 c)与新生儿Fe受体FcRn的结合活性且优选血清稳定性。
21.一种产生(重组)抗体或Fe-融合蛋白的方法，该(重组)抗体或Fe-融合蛋白具有 &奸(^1?111&结合活性和/或 b)补体结合活性和/或 c)与新生儿Fe受体FcRn的结合活性， 该方法包括在大鼠肝癌细胞中产生该抗体或Fe融合蛋白， 其中该大鼠肝癌细胞优选为H4-11-E细胞，更优选地，该细胞为: i)源自选自以下细胞的细胞:欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC，目录编号87031301)、美国典型培养物保藏中心(ATCC，保藏编号CRL-1548)、H4-11-E-C3细胞系(CRL-1600或HPACC 编号 85061112 或 ECACC 目录编号 85061112)、H4II 细胞系(HPACC Nr.89042702)、H4-TG 细胞系(CRL-1578)、H5 细胞系(HPACC, Nr.94101905)及 H4-S 细胞系(HPACCNr.89102001)，或 ?)以编号ECACC目录编号87031301保藏于欧洲细胞培养物保藏中心或以保藏编号CRL-1548保藏于美国典型培养物保藏中心ATCC的细胞，或 iii)以保藏号DSMACC3129(H4-11-E)保藏于DSMZ(德国微生物和细胞培养物保藏中心)的细胞，或 iv)以保藏号DSMACC3130(H4-11-Es)保藏于DSMZ (德国微生物和细胞培养物保藏中心)的细胞，或 v)i)或ii)或iii)或iv)中任一细胞的衍生物或子代， 最优选地，该细胞是以保藏号DSM ACC3129(H4-11-E)保藏于DSMZ (德国微生物和细胞培养物保藏中心)的细胞，或以保藏号DSM ACC3130(H4-11-Es)保藏于DSMZ(德国微生物和细胞培养物保藏中心)的细胞。
22.权利要求21的方法，其中 i)如权利要求21 a)所述的抗体或Fe融合蛋白具有抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或 ?)如权利要求21b)所述的抗体或Fe融合蛋白具有补体依赖性细胞毒性(CDC)或 iii)如权利要求21c)所述的抗体或Fe融合蛋白具有血清稳定性。
23.一种生成用于生产重组糖蛋白的宿主细胞的方法，其包括: a)提供大鼠肝癌细胞， b)使该步骤a)的大鼠肝癌细胞适应于在悬浮培养物中生长，及 c)使该步骤a)的大鼠肝癌细胞适应于在无血清培养基中生长，及 d)使该步骤a)的大鼠肝癌细胞适应于在钙减少或无钙的培养基中生长，及 e)任选使该步骤a)的大鼠肝癌细胞适应于在不含任一动物来源蛋白/肽的培养基中生长，及 f)任选选择单细胞纯系， g)获得宿主细胞。
24.权利要求23的方法，其中该大鼠肝癌细胞是H4-11-E细胞，优选地，该细胞为: i)源自选自以下细胞的细胞:欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC，目录编号87031301)、美国典型培养物保藏中心(ATCC，保藏编号CRL-1548)、H4-11-E-C3细胞系(CRL-1600或HPACC 编号 85061112 或 ECACC 目录编号 85061112)、H4II 细胞系(HPACC Nr.89042702)、H4-TG 细胞系(CRL-1578)、H5 细胞系(HPACC, Nr.94101905)及 H4-S 细胞系(HPACCNr.89102001)，或 ?)以编号ECACC目录编号87031301保藏于欧洲细胞培养物保藏中心或以保藏编号CRL-1548保藏于美国典型培养物保藏中心ATCC的细胞，或 iii)以保藏号DSMACC3129(H4-11-E)保藏于DSMZ(德国微生物和细胞培养物保藏中心)的细胞，或 iv)以保藏号DSMACC3130(H4-11-Es)保藏于DSMZ(德国微生物和细胞培养物保藏中心)的细胞，或 v)i)或ii)或iii)或iv)中任一细胞的衍生物或子代，最优选地，该细胞是以保藏号DSM ACC3129(H4-11-E)保藏于DSMZ (德国微生物和细胞培养物保藏中心)的细胞，或以保藏号DSM ACC3130(H4-11-Es)保藏于DSMZ(德国微生物和细胞培养物保藏中心)的细胞。
25.权利要求23或24的方法，其进一步包含 h)用编码所关注糖蛋白的核酸序列转染该如权利要求23的步骤g)的所获得宿主细胞，及 i)任选在允许表达该所关注糖蛋白的条件下培育该步骤h)所转染的细胞， 其中该所关注糖蛋白优选为抗体或Fe融合蛋白、最优选具有ADCC和/或CDC和/或血清稳定性的抗体或Fe融合蛋白。
26.一种根据权利要求23至25中任一项的方法生成的细胞。
27.—种以保藏号DSM ACC3130(H4-11-Es)保藏于DSMZ(德国微生物和细胞培养物保藏中心)的(大鼠肝癌)细胞。
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