专利名称：一种蛋白酶,其基因和其用途的制作方法蛋白酶是一种催化蛋白质或肽中的肽键的水解的酶，存在于所有的生物体中，有着各种各样的生理作用。来自微生物的大多数蛋白酶是分泌到细胞外的环境中的，并且它们的活性受到碳源或氮源的抑制或激活。另外，大多数的微生物蛋白酶起源于动物或植物的病原体微生物，或者说，这些蛋白质具有病原体的特性。微生物蛋白酶可以根据如温度，最适pH，和在活化位点的残基这些特性来分类，从而不同的类别具有不同的工业用途。例如，蛋白酶可以根据温度分成热稳定，嗜中温或喜温的；根据最适pH可分成酸性，弱酸性，中性或碱性；根据活性位点上的残基可分成丝氨酸蛋白酶，半胱氨酸蛋白酶，天冬氨酸蛋白酶或金属蛋白酶。这些蛋白酶的酶活性受到酶的活性位点中所见的金属阳离子如Ca2+，Zn2+，Mg2+，Mn2+的调节。大多数蛋白酶是含锌蛋白质，其中的锌是酶活性所必需的。这样的蛋白酶的代表性例子如从家蚕(Bombyx mori)的肠道中分离到的粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)(ATCC21074)产生的锯肽酶(serrapeptase)，这一酶可以用作抗炎症剂，因为它具有降解纤维蛋白的能力和水解缓激肽和组胺的活性，而这些物质是炎症肽。目前已经克隆和表征的细菌蛋白酶包括从解蛋白弧菌(Vibro proteolyticus)(参见，David，V.A.，A.H.Deutch，A.Sloma，D.Pawlyk，A.Ally，和D.R.Durham.基因，112107-112，1992)，菊欧文氏杆菌(Erwiniachysanthemi)B374 prtA(参见，Ghigo，J.M.，和C.Wandersman.分子基因遗传学236135-144.1992))，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)LasB(参见，Doung，F.，A.Lazdunsk，B.Cami，和Murgier。基因12147-54.1992)，粘质沙雷氏菌PrtSM(参见，Braunagel，S.C.，和M.J.Benedik，分子基因遗传学222446-451，1990))，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)(参见，Lovgren，A.，M.Zhang，A.Engstrom，G.Dalhammar，和R.Landen.分子微生物学，42137-3146，1990))，等等得到的那些蛋白酶。本发明的公开到目前为止，本发明的发明人已经成功地从Nephilia clavata的肠道分离到具有降解蛋白质能力的新的微生物，命名为Aranicola proteolyticus HY-3(KCTC登记号0268BP)。具体地说，本发明人已经从Nephila clavata的肠道分离和鉴定了Aranicola proteolyticus的蛋白酶生产菌株(韩国专利公开文本，No.10-220091，1999年6月18日公开)，并且成功地纯化了在20℃到40℃的温度范围和pH6-10之间稳定的蛋白酶，该酶的表观分子量为51.5千道尔顿。但是，上面的公开文本着重点在于微生物的形态和分类方面的鉴定和表征。本发明人继续研究该微生物和蛋白酶，结果发现了该蛋白酶受到金属蛋白酶抑制剂的抑制，并且在低温和宽的pH范围内或在高盐浓度下表现出大大增加的蛋白质降解活性，并且利用适合该特定微生物的遗传修饰表达系统或纯化方法可以有效地得到该蛋白酶。本发明人也已经发现该蛋白酶具有广泛的工业用途，例如用作去污剂，化妆品，皮革加工剂，用于实验室研究的化学试剂，用于食物的增溶剂或疏松剂，肉类改良剂，饲料或食物添加剂，或油和脂肪的分离剂，以及药物组合物，它可以用作改善营养性疾病、改善消化性疾患或消化器官手术后改良不正常状况的消化酶，用作直接作用于血栓的溶解纤维蛋白的溶栓剂，和作为体内保护系统消除炎性物质或坏死组织的抗炎症酶，或作为缓解外科和外伤后的水肿的抗炎剂，这样，完成了本发明。所以，本发明的目的是提供一种编码包含SEQ ID NO2所述的序列的蛋白酶的新基因，和可以生产所述蛋白酶或它的功能性等同物的该基因突变体或变异体。本发明的另一个目的是提供含有上面的基因、编码上面的蛋白酶或它的功能性等同物的基因突变体或变异体、组成型启动子或调节性启动子、作为选择性标记的营养缺陷基因如URA3(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)或抗生素抗性基因如Ap(氨苄青霉素)抗性基因和转录终止子的新的表达系统，和含有该表达系统的微生物。本发明的其它目的是提供具有前面提到的这些特征和包含SEQ ID NO1阐述的氨基酸序列的蛋白酶。仍然是本发明的其它方面是提供纯化所述蛋白酶的方法，包括步骤a)在培养基中培养Aranicola proteolyticus；b)过滤培养基取得上清液；和c)用树脂纯化上清液中含有的蛋白酶。
仍然是本发明的其它方面是提供该蛋白酶和其基因在工业应用中的用途，如，去污剂，化妆品，皮革加工剂，实验室研究用的化学试剂，作为食物增溶剂或疏松剂，肉类改良剂，饲料或食物添加剂，或油和脂肪的分离剂。
另外，本发明提供了可以用作消化酶的药物组合物，用于改善营养性疾病，改善消化性疾患或在消化器官手术后改良不正常状况，通过直接作用于血栓溶解纤维蛋白的溶栓剂和作为体内保护系统的消除炎性物质或坏死组织的消炎酶，或在外科手术和外伤后减轻水肿的抗炎症剂，药物组合物还含有作为活性试剂的蛋白酶、酶变体或其变异酶和药物学可接受载体。
本发明其它的目的和优点在阅读了本说明书的剩余部分后就显而易见了。
附图的简要说明参考附图，本发明进一步得到说明，其中附

图1说明了各种抑制剂对来自Aranicola proteolyticus的蛋白酶的抑制效果。根据实施例1所述的方法，利用azokazein作为底物制备本蛋白酶。
附图2表示了来自Aranicola proteolyticus的蛋白酶的热稳定性。根据实施例1所述的方法制备蛋白酶；利用azokazein作为底物。
附图3表示了不同的pH下，该蛋白酶的活性和稳定性。根据实施例1所述的方法制备该蛋白酶，利用azokazein作为底物；和附图4画出了编码本发明的蛋白酶的DNA序列和该蛋白质的相应氨基酸序列。
施行本发明的最好方式由此将更详细地说明本发明。
一方面，本发明提供了编码包含SEQ ID NO2中所述的序列的蛋白酶的新基因，和可以生产所述蛋白酶和功能性等同物的该基因突变体或变异体。
本发明的基因具有后面所附序列表中的SEQ ID NO2列出的核苷酸序列，基因的大小是2.48kb。此基因含有由1,461个减基对组成的ORF(开放读码框架)，在上游具有16个碱基对间隔的-35区(TGTGCA)和-10区(TATAAT)，和在起始密码子前面的已知是核糖体结合位点的Shine-Dalgarno(SD)序列。终止密码子是TAA，怀疑是转录终止位点的回文序列出现在下游。这一基因是在Aranicola proteolyticus HY-3中得到分离的。
用于本文的术语“突变体或其变异体”对于一个突变的基因意味着在该基因中一个碱基或两个或更多的碱基已经通过突变(如，替代，缺失，添加或插入)而改变，但仍然能够产生同一蛋白酶或它的功能性等同物。所以，本领域的技术人员完全明白，这样的突变体或变异体是属于本发明的范围的。通常，在本发明的蛋白酶和基因的情况中，具有约80％或更大的同源性，优选90％或以上的同源性的突变体或变异体可以属于本发明的上下文的范畴，可以称为本发明的变异体或其突变体。
在另一方面，本发明提供了含有编码上述蛋白酶的基因、编码该蛋白酶或其功能等同物的基因的突变体或其变异体、组成型启动子或调节性启动子、作为选择标记的营养缺陷基因如URA3(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)或抗生素抗性基因如Ap(氨苄青霉素)抗性基因和转录终止子的新的表达载体，和用该表达载体转化的微生物。
根据本领域的技术人员已知的常规重组DNA技术可以制备含有编码该蛋白酶的载体系统和转化体，在该技术中，从野生型菌株(如Aranicolaproteolyticus)中分离了含有编码前面所述的蛋白酶的序列的DNA片段，并且与适当的表达信号一起克隆进适当的调节元件，得到的载体而后导入自主复制的质粒或导入细菌的染色体中。
构成常规重组方法的一系列步骤基本上是本领域技术人员已知的，例如技术人员可以利用Mamiatis等人的《分子克隆实验室手册》8.11-8.13(冷泉港实验室出版(1989))指导的方法容易地实现本发明的目的。
本发明另外还提供了具有前面提到的特征，并具有SEQ ID NO1列出的氨基酸序列的蛋白酶，或酶变异体或其突变的酶。
本文利用的术语“酶变异体或突变的酶”对于功能与本发明蛋白酶相同的酶意味着该酶中的一个或多个氨基酸由于亲本基因的DNA核苷酸序列变化已经被修饰或改变，或意味着该酶的衍生物。所以，虽然本发明的优选的蛋白酶可以从Aranicola proteolyticus，如Aranicola proteolyticus HY3-1得到，但功能相当的蛋白酶是可以利用载体系统和适当的寄主微生物从变异体或其突变体的形式得到的，这样的宿主微生物可能基本上不是与亲本基因所源自的微生物相同的有机体。
本发明人分离和纯化了Aranicola proteolyticus产生的蛋白酶，分析了其酶学特征，进行了基因克隆并测定其序列。序列分析的结果是SEQ ID NO1中列出的蛋白酶的氨基酸序列与粘质沙雷氏菌SM6的蛋白酶显示出92.6％的相似性。另外，发现在大多数金属蛋白酶中存在的Zn2+结合位点和活性位点上的氨基酸序列是非常保守的。在存在等浓度的金属蛋白酶抑制剂，例如EDTA和二氮杂菲时，蛋白酶的相对活性变低(参见图1)。这些观察到的现象支持了本发明蛋白酶是酶活性需要锌离子(Zn2+)的锌结合金属蛋白酶的说法。除此之外，根据在4℃到80℃范围的不同温度测量酶的相对活性的实验，在37℃观察到最大酶活性，并且在20℃到40℃之间的温度时观察到至少75％的相对活性(参见图2)。在底物为azokazein和不同的pH下测量酶的相对活性显示在pH为8.0时酶活性最大；而在pH7.0到9.5至少为最大活性的80％(参见图3)。对酶的SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶)电泳表明本发明蛋白酶带的表现分子量约为51.5kDa。
所以，本发明的蛋白酶的表观分子量为51.5kDa，酶活性的最适温度在20℃到37℃之间(pH7.6)，最适pH为7.0到9.5之间(37℃)。蛋白酶在高盐浓度下保持了高活性，但受到金属蛋白酶抑制剂如EDTA和二氮杂菲的抑制。
本发明进一步提供了纯化蛋白酶的方法，该方法包括a)在培养基中培养Aranicola proteolyticus；b)过滤培养基得到上清液；和c)用树脂纯化上清液中含有的蛋白酶。
在本发明的一个实施方案中，在含有氮源和无机盐的适当的营养培养基中培养Aranicola proteolyticus，接着回收蛋白酶，或利用常规的重组DNA技术可以生产本蛋白酶。
Aranicola proteolyticus HY-3是运动、需氧革兰氏阴性细菌，呈球状，直径在0.5到0.8毫米。其生长反应在存在过氧化物酶时呈阳性，在存在氧化酶时呈阴性。
该微生物可以在含有可同化碳源和氮源以及其它基本营养物的培养基中培养。培养基可以用常规方法制备。在发酵肉汤中产生的细胞外蛋白酶可以用本领域已知的常规方法回收和纯化。
为了分离本发明的蛋白酶，首先如前所述培养Aranicola proteolyticus。分离细菌沉淀和上清液，然后浓缩上清液。用树脂纯化浓缩的溶液。在优选的实施方案中，用DEAE纤维素离子交换树脂和Tris-HCl缓冲液预处理的Sephadex G-75的凝胶过滤交换树脂纯化浓缩的溶液。最后，在纯化的蛋白酶中任选地加入防腐剂。
在本发明的另一实施方案中，通过常规的重组DNA技术可以生产该蛋白酶，在该技术中，例如含有编码前面提到的蛋白酶序列的DNA片段是从野生型菌株如Aranicola proteolyticus中得到的，并且该片段与适当的表达信号一起克隆进了适当的调节元件，然后，得到的载体导入了自主复制的质粒或导入细菌染色体中。然后，在优化的培养基中培养细菌，表达蛋白酶，用前面提到的方法，从培养基中回收蛋白酶。优选的宿主生物体包括，但不限于例如，大肠杆菌，芽孢杆菌属，曲霉属，链霉菌属或酵母属。
仍然在其它方面，本发明提供了该蛋白酶在工业应用中的用途，例如用作去污剂，化妆品，皮革加工剂，实验室研究用的化学试剂，食物的增溶剂或疏松剂，肉类改良剂，饲料或食物添加剂或油和脂肪分离试剂以及可以用作消化酶的药物组合物，这种消化酶可以改善营养性疾病，改善消化性疾患或在消化器官手术后改良不正常的状况，通过直接作用于血栓溶解纤维蛋白的溶栓剂和用作体内保护系统消除炎性物质或坏死组织的抗炎症的酶，或作为外科手术和外伤后减轻水肿的消炎剂。
本发明的蛋白酶的蛋白水解特性可以应用于去污剂工业。在优选的蛋白酶应用的实施方案中，本发明提供了含有本发明的蛋白酶，其它酶成分和添加剂的去污剂组合物。
本领域技术人员已知的酶成分包括，但不限于包括选自淀粉酶，脂酶，纤维素酶，氧化酶，过氧化物酶和/或其混合物的组中的一种或其它多种酶。
本发明的去污剂组合物可以含有一种或多种表面活性剂，可以是阴离子的，非离子的，阳离子的，兼性的，或兼性离子的类型，或这些类型的混合。阴离子表面活性剂的典型例子包括线性烷基苯磺酸酯(LAS)，烷基硫酸酯(AS)，α-烯烃磺酸酯(AOS)，脂肪醇乙氧基硫酸酸盐(AES)和天然脂肪酸的碱金属盐。非离子表面活性剂的例子包括烷基聚乙二醇醚，壬基苯酚聚乙二醇醚，蔗糖和葡萄糖的脂肪酸酯，和聚乙氧基化烷基葡糖苷的酯。
本发明的去污剂组合物也可以含有本领域技术人员已知的其它去污剂成分，如增效剂，漂白剂，漂白活性剂，防腐剂，螯合剂，抗土壤再沉积剂，芳香剂，酶和漂白剂的稳定剂，配方辅助剂，增光剂，泡沫增效剂，螯合剂，填充剂和纤维软化剂。
本发明的去污剂组合物可以配制成任何便利的形式如粉末，液体等等。
通过加入含有已知的去污剂蛋白酶的单个的添加剂，或加入含有不同去污剂酶的组合添加剂可以将该蛋白酶包含在去污剂组合物中。
本发明的添加剂可以配制成如颗粒，液体，糖浆等等。优选的去污剂添加剂配方有非起尘(non-dusting)颗粒，液体，特别是已稳定的液体，糖浆，或已保护好的酶。无灰颗粒可以根据GB专利公开文本1,362,365或美国专利号4,106,991来进行生产，并且可以用本领域已知的方法任选地进行包衣。去污剂酶可以在颗粒化前或颗粒化后混合。例如，液体酶制剂可以根据已确定的方法加入多元醇如丙二醇，加入糖或糖醇，乳酸或硼酸来稳定。其它酶稳定剂是本领域技术人员非常熟悉的。根据欧洲专利公开文本238,216中公开的方法，可以制备已保护的酶。在一个有用的实施方案中，本发明的蛋白酶可以根据例如欧洲专利公开文本342,177；368,575；378,261；和378,262掺入去污剂配方中。
在另一个优选的实施方案中，本发明提供了含有作为活性剂的本发明的蛋白酶，其酶变异体或突变的酶和药物学可接受的载体的药物组合物。
本发明的药物组合物可以用作消化酶，改善营养性疾病，消化不适，或改良消化器官手术后的非正常状况，用作直接作用于血栓溶解纤维蛋白的溶栓剂，和当遭受外来毒性成分的攻击时作为体内保护系统消除炎性物质或坏死组织的抗炎症的酶，或作为在外科和外伤后减轻水肿的抗炎剂，本领域的普通技术人员利用标准的诊断技术是能够容易地鉴定怀疑患了这些疾病，状况，和紊乱的个体。
本发明的药物组合物含有与本发明的蛋白酶组合的药物学上可接受的载体。药物配方是已知的，一个本领域的普通技术人员就可以按常规配制含有该蛋白酶的药物组合物。该蛋白酶的给药方式可决定生物体中蛋白酶递送的位点。对于肠胃外给药，即静脉内，皮下或肌肉内给药是可能的。静脉内给药是优选的途径。药物组合物最好用无菌的水溶液的形式使用，可以含有其它溶质，例如充足的盐，葡萄糖或葡聚糖使溶液等渗。对于口服的给药方式，本发明的蛋白酶可以以片剂，胶囊，锭剂，糖锭，粉末，糖浆，酏剂，水溶液和悬浮液，和诸如此类形式使用。可以利用多种崩解剂如淀粉，和润滑剂。对于胶囊形式的口服给药，可利用的稀释剂是乳糖和高分子量的聚乙二醇。当口服需要水性悬浮液时，可以加入一些甜味剂和/或调味剂。其它适当的药物载体在引入本文作为参考的本领域标准参考文章，Remington的药物科学，A.Osol中有叙述。
每天服用的活性成分蛋白酶的浓度约为10微克～100毫克/公斤体重。但是，本领域的技术人员认识到剂量根据已知的因素如特定试剂的药物动力学特征，和它的给药的方式和途径；服药人的年龄，健康，和体重；症状的特性和程度，同时进行的治疗的类型，治疗的频率，和期望的效果而变化。参见，Gennaro，Alfonso，等，Remington，药物科学，第18版，1990年，Mack出版公司，Easton Pa。
在其它优选的实施方案中，本发明提供了含有本发明的蛋白酶和/或酸缓冲液、酸性蛋白酶或无机酸以及化妆品可接受的载体、媒介物和赋形剂的化妆品组合物。
酸性缓冲液的化妆品可接受载体、媒介物或赋形剂成分选自洗液，酊剂，膏，乳剂，凝胶，软膏，水，水可加工的膏，聚乙烯醇，羟乙基纤维素，纤维素，亲水性丙烯酸聚合物，润肤剂，皮肤湿润成分，酶稳定剂，甘油，表面活性剂，防腐剂，用于药物配方的亲水性增稠剂和上述成分的混合物。酸性蛋白酶选自真菌蛋白酶，细菌蛋白酶或哺乳动物蛋白酶或上述酶的混合物，或选自胃蛋白酶，组织蛋白酶，人尿酸蛋白酶，根霉菌胃蛋白酶，青霉菌胃蛋白酶，内皮胃蛋白酶或上述酶的混合物。无机酸的代表性例子选自磷酸，焦磷酸，三磷酸，聚磷酸，硫酸氢钠，硫酸氢钾或上述酸的混合物。
另外，在另一个优选的实施方案中，本发明的蛋白酶可以用作皮革加工剂。所以，提供水性酶制剂，或特别适用于处理无水有机溶液的皮革工业的组合物。
蛋白酶的利用占据了皮革制造成本的很大部分。在下面，本发明的蛋白酶和皮革加工工业相关的用途将得到更详细的解释。
为了制造皮革产品，将原材料经过浸泡过程，用石灰熟化处理，去石灰(deliming)过程，用脱灰碱液将生皮软化的过程，泡腌过程，鞣皮过程，染色过程，干燥过程和后整理过程。在这些过程中，在去石灰过程和生皮软化过程中利用了蛋白酶。去石灰过程和软化过程包括中和和酸处理步骤，其中的条件被调节到使皮革的皮中的胶原蛋白不受破坏解体。用另一句话说，直接将无毛的皮经过泡腌和鞣皮过程，跳过去石灰和软化过程，会引起构成皮的蛋白质致命地降解或变性。
通过蛋白酶的消化，在去石灰过程中除去了皮革加工过程中皮中的不需要成分。在软化过程中，通过酶的处理使皮松软和有弹性，弥补了去石灰过程中不够松弛的皮毛的肉皮中的纤维组织。正是去石灰过程中，蛋白酶的作用最重要。
该蛋白酶能消化和洗脱表皮细胞、毛根、汗腺、钙皂、在用石灰水泡腌部分水解后留在脱毛的皮中的乳化脂肪，本蛋白酶还清洁脱毛的皮的表面并使之光滑。另外，它消化和洗脱了各种不需要的蛋白质，并作用于弹性蛋白纤维或网硬蛋白纤维，将它们的生理化学特性修饰到一定程度。
根据特定的目的，在各种实施方案中构思了实验室研究中蛋白酶的各种用途。例如，它可以用于在DNA分离和纯化过程中除去不需要的蛋白质。它也可以用于涉及蛋白质化学如氨基酸测序的研究。实施例下面，借助于下面的实施例，本发明将更详细地得到说明。但显然，本发明的范围将不局限于这些实施例。实施例1蛋白酶的生产为了纯化本发明的蛋白酶，在培养基(细菌用的胰蛋白胨0.5％，酵母提取物0.5％，NaCl0.1％，KCl0.05％，CaCl20.02％，MgCl20.02％)中，在22℃下培养Aranicola proteolyticus HY-3 18小时。用2微米的滤膜从培养肉汤中分离出上清液，然后用10千道尔顿的膜滤浓缩。由于本发明的蛋白酶基本上是阴离子蛋白质，该蛋白酶可以用50mM Tris-HCl的缓冲液(pH7.6)预处理的DEAE纤维素的离子交换树脂纯化，然后利用20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.6)预处理的的Sephadex G-75凝胶过滤交换树脂来纯化。随后，用10％的SDS-PAGE分析如此纯化的酶溶液，鉴定其谱带图形。结果证明本发明的蛋白酶是表观分子量约为51.5千道尔顿的单体。实施例2本发明的基因和蛋白酶的序列测定用氨基酸测序分析器(精密蛋白质测序系统，应用生物系统)测定实施例1中得到的蛋白酶的部分氨基酸序列。根据这样得到的如SEQ ID NO3(Ala GluGln Gln Gln Gln Ala)和SEQ ID NO4(Ile Gly His Ala Leu Gly)所述的氨基酸序列，设计了如SEQ ID NO5(正向引物gcggaacagc agcagcaggc)和SEQ IDNO6(反向引物gcccaacgca tggccaat)的PCR引物。利用合成的引物，将从Aranicola proteolyticus HY-3纯化的基因组DNA作为模板进行PCR。结果，得到了长度为2.48千道尔顿的DNA片段，然后确定了PCR产物的序列。在这样确定的序列的基础上，设计了如SEQ ID NO7(ataatggccg ggacgatcct ggctgtagtt ac)和SEQ ID NO8(cttacgcctt cctgccgaac accatttatc ag)所述的PCR引物。利用合成的引物，在将从Aranicola proteolyticus HY-3纯化的基因组DNA作为模板时，进行反向PCR。
本发明的基因具有序列表中的SEQ ID NO2中列出的核苷酸序列，大小为2.48kb。该基因具有一个含有1,461个碱基对的ORF(开放读码框架)，在上游有16个碱基对间隔的-35区(TGTGCA)和-10区(TATAAT)，和在起始密码前面的已知为核糖体结合位点的Shine-Dalgarno(SD)序列。TAA用作终止密码，怀疑为转录终止位点的回文序列出现在下游。
如SEQ ID NO1中所述的蛋白酶的氨基酸序列与从粘质沙雷氏菌SM6得到的蛋白酶表现出92.6％的相似性。另外发现，在大多数金属蛋白酶中存在的Zn2+结合位点和活性位点上的氨基酸序列是非常保守的。实施例3新蛋白酶的酶学特征实验(1)蛋白酶抑制剂对蛋白酶的作用根据Braun和Shmitz(Braun，V.和Schmitz，G.，Arch.Microbiol.124，55-61，1980)所述的方法测定蛋白酶的酶学活性。在10毫升50mM的磷酸盐缓冲液(pH7.5)中溶解0.24克偶氮酪蛋白(azocasein)制备底物溶液。将300微升的底物溶液与100微升的细菌培养液混合，在37℃下反应30分钟。然后，在反应溶液中加入300微升10％的三氯乙酸，在室温下温育1小时。在7,000rpm离心反应溶液直到沉淀和上清液基本分离。在上清液(300微升)中加入30微升10％的氢氧化钠(NaOH)后，在420纳米测量吸光值。将酶效价确定为当吸光值增大1倍时为1个单位。
为了检测蛋白酶抑制剂对蛋白酶的活性的影响，在酶溶液中加入在下面列出的抑制剂各1mM，并在测量相对酶活性前在37℃下温育5分钟。测试的抑制剂包括氨肽酶抑制剂antopain，金属内肽酶抑制剂磷酰二胺，天冬氨酸蛋白酶抑制剂胃酶抑素，胰蛋白酶抑制剂抗蛋白酶二盐酸盐，半胱氨酸抑制剂E-64(L-反-exoxy-琥铂酰-亮氨酰-4-fuanidino丁烷)，胰凝乳蛋白酶之抑制剂(chymostatin)，亮抑肽酶，petabloc SC，抑酶肽，和丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF，金属蛋白酶抑制剂EDTA和二氮杂菲。结果显示EDTA抑制了约30％的酶活性，二氮杂菲抑制了约70％(附图1)。
(2)盐对蛋白酶的影响为了检测盐对蛋白酶活性的影响，在存在从0到1700mM范围的各种浓度的氯化钠溶液时，在37℃预处理酶溶液4小时后测量相对酶活性。根据实施例3(1)所述的方法，测量相对活性。为了比较，将从粘质沙雷氏菌SM6得到的蛋白酶作为对照。结果表示在下面的表1。
<表1>

正如表1所示，本发明的蛋白酶的相对活性与盐浓度成比例地提高了约1.3到2.0倍。
(3)热对蛋白酶的活性和稳定性的影响为了检测热对本蛋白酶的活性和稳定性的影响，在4℃到80℃的温度范围检测相对酶活性。根据实施例3(1)所述的方法进行活性的测量。结果表示在表2。
<表2>

正如表2所示，虽然在37℃测到了最大的相对活性，但甚至在低到4℃到15℃蛋白酶也保持了约最大活性的一半的酶活性(参见图2)。另外，‘Ea值’(偶氮酪蛋白水解)它代表了在阿累尼乌斯曲线中指示了相应温度的活化能的斜率，该‘Ea值’显示在4℃和37℃的温度范围斜率为2,432千卡/摩尔。这些结果证明酶在低温下具有强活性。
(4)pH对蛋白酶的活性和稳定性的影响为了检测本发明的蛋白酶对pH的依赖性，本发明人制备了具有不同pH的多种底物溶液。分别用柠檬酸-磷酸(pH3.0到7.0)，磷酸钠(pH7.0到9.0)，Tris-HCl(pH7.0到10.0)和甘氨酸-碳酸钠(pH9.0-12.0)缓冲每种底物溶液。在37℃，在将酶和上面的各个底物溶液混合30分钟后测量相对蛋白酶活性。接着，用实施例3(1)描述的方法测量相对蛋白酶活性。结果表示在表3。
<表3>

正如表3所示，在pH8.0测得最大的相对酶活性。在7.0-9.5的pH范围观察到至少80％的最大酶活性，甚至在pH5.0到12.0也能测得至少70％的活性(参见图3)。
(5)蛋白酶对各种底物的活性为了检测酶对各种底物的降解能力，对底物如白蛋白，酪蛋白，胶原蛋白，弹性蛋白和血红蛋白进行了酶反应。当将在24小时的反应中酶对白蛋白的降解能力定义为100时，在2小时的反应中，除了血红蛋白，所有其它底物的酶降解能力为20～30。在24小时的反应中，所有底物包括血红蛋白测得的酶降解能力至少45。这些结果表明，相对于各种底物，本发明的蛋白酶的降解范围是宽的，提示了该蛋白酶的工业用途。
实施例5药物制剂制剂的形式(片剂)
蛋白酶 50毫克乳糖 80毫克淀粉 17毫克硬脂酸镁 3毫克结晶纤维素 10毫克本发明的一个实施方案是蛋白酶作为片剂的成分的用途，片剂的示例性组成如上所示。用常规方法可以制备片剂。符合期望的代表性药物制剂是具有常规的肠溶包衣(例如羟丙基甲基纤维素苯二甲酸酯)、糖包衣或膜包衣的片剂。
实施例6蛋白酶在皮革工业中的应用将20克原粗皮仔细地分成适当大小的块，在50毫升的试管中与14毫升的蒸馏水混合。然后，根据皮的重量，在其中加入0.5％的亚硫酸氢钠和0.5％的硫酸铵，并在26℃将混合物温育15分钟。然后，在其中加入0.2％的去污剂和0.5％的去石灰剂，分别保持30分钟和1小时，测量从皮洗脱的蛋白质的量。在存在0.5％的蛋白酶时，在30分钟和1小时后，洗脱的蛋白质的量分别达到1054毫克/毫升和1062毫克/毫升。在没有蛋白酶时，在30分钟和1小时后，洗脱的蛋白质的量分别达到304.5毫克/毫升和329.5毫克/毫升。这些结果暗示了该蛋白酶在皮革加工工业中的用途。
工业应用本发明的蛋白酶在高盐浓度下、在大范围的pH、温度中有稳定的酶活性。所以，它具有各种工业用途，如去污剂，化妆品，皮革加工剂，实验室研究用的化学试剂，食物的增溶剂或疏松剂，肉类改良剂，饲料或食物添加剂，或油和脂肪的分离剂，以及药物组合物。


本发明涉及一种蛋白酶,更具体地说,涉及从Aranicola proteolyticus得到的蛋白酶,涉及编码所述酶的基因,涉及所述蛋白酶的基因表达系统,纯化该蛋白酶的方法,和所述蛋白酶在工业应用中的用途,如,去污剂,化妆品,皮革加工剂,用于实验室研究的化学试剂,用于食品的增溶剂或疏松剂,肉类改良剂,饲料或食物添加剂,或油和脂肪分离剂,以及药物组合物。