专利名称：一种提高疫苗生产中鸡毒支原体增殖能力的方法鸡毒支原体病是由鸡毒支原体(Mycoplasma gallis印ticum，简称MG)引起的鸡、 火鸡慢性呼吸道病(Chronicrespiratory disease，CRD)。临床上主要表现为咳嗽、流鼻涕， 呼吸时发出罗音，严重时张口呼吸。随着养鸡规模加大、饲养方式改变和饲养密度提高，该病的发病率越来越高。据统计，鸡毒支原体感染鸡群后，雏鸡的弱雏率增加10%左右，蛋鸡的产蛋率下降10 20%，肉鸡的体重减少38%，出栏期延长，饲料转化率降低，感染鸡群的免疫受到抑制并引起其它疾病的继发或伴发，可间接地引起大量的药费开支，是危害养鸡业的重要疾病之一。目前对支原体感染的防治主要在于药物治疗、疫苗预防及健康畜群的建立。用药物治疗CRD虽然有效，但不能清除带菌状态，又有药物残留的弊病；有效的疫苗免疫是防控该病的重要手段，疫苗免疫研究成为不可忽视的领域。目前鸡毒支原体疫苗生产中，培养鸡毒支原体主要应用改良Frey氏培养基或其他支原体培养基。其制苗用菌液培养工艺为将合格的鸡毒支原体生产用种子按10%的量接种于培养基，逐步扩大培养，一直到所需的量；每代均置36 37°C培养24 48h，待培养基的PH下降到7. 0左右收获；按此传统培养工艺所获得的鸡毒支原体制苗用菌液(半成品) 的菌液浓度最高只能达到1. OX 109(XU/ml。以上述传统培养基及培养工艺所培养的鸡毒支原体增殖能力差、培养滴度低(培养菌液浓度低)，制苗用菌液(半成品)生产灭活疫苗时不能直接使用，需对半成品进行一定浓缩后方可制备成品疫苗，而半成品的浓缩操作繁琐、浓缩过程损失较大，最终影响成品疫苗的保护效力，并且使疫苗生产成本提高。
本发明所要解决的问题是提供一种提高疫苗生产中鸡毒支原体增殖能力的方法， 用以提高鸡毒支原体增殖能力及菌液滴度。本发明所述问题是以下述技术方案解决的一种提高疫苗生产中鸡毒支原体增殖能力的方法，所述疫苗经种子制备、鸡毒支原体培养基配制、制苗菌液制备及灭活疫苗制备工序制成，改进后，所述鸡毒支原体培养基按如下工艺配制PPLO 肉汤23. 0 26. Og,葡萄糖8. 0 10. 0g，质量浓度为1%的醋酸铊溶液10ml，质量浓度为25%的酵母浸出液100ml，
质量浓度为1%的酚红溶液1. 0 2. 0ml，
3用去离子水定容到790 840ml，在115°C灭菌20min，待冷却后，在无菌条件下加入以下成份
质量浓度为10%的精氨酸溶液(已过滤除菌) 10ml， 猪血清150 200ml，
青霉素80 120万单位，
用氢氧化钠溶液调PH值至7. 6 7. 8。上述提高疫苗生产中鸡毒支原体增殖能力的方法，所述制苗用菌液培养按如下步骤进行
(1)将鸡毒支原体生产用种子按10%体积量接种于所述支原体培养基中，在36 37°C 培养16 18h收获；选取收获菌液体积量的10%，以同体积培养基、同样方法再传代1次；
(2)将上述传代后的菌液按10%的量接种于本发明支原体培养基，36 37°C培养24 48h，待培养基的PH下降到7. 0左右收获。依照此法逐步扩大培养，一直到所需的量，此菌液作为半成品即可用于制备疫苗。本发明将上述半成品菌液进行活菌数测定，获得的鸡毒支原体菌液浓度可达 1.0X1013 CCU/ml 1. 0 X 1014CCU/ml。本发明在传统鸡毒支原体培养方法的基础上，改良了培养基，改进了培养工艺， 提高了鸡毒支原体增殖能力及菌液滴度(由原来的1. OX 108 9CCU/ml提高到了目前的 1.0X1013(XU/ml 1. 0 X 1014(XU/ml )，培养的制苗用菌液可以直接或稀释后制备成品疫苗，免除了浓缩工艺，解决了传统方法培养鸡毒支原体增殖能力差，菌液滴度低，浓缩成本高、操作繁琐等问题。本发明经实验证明，有下述优点
1、本发明用改良的支原体培养基及改进的增殖培养工艺培养鸡毒支原体，提高了菌体的增殖能力及菌液滴度，菌液滴度高达1. OX 1013(XU/ml 1. 0 X 1014(XU/ml。在培养制苗用菌液时，前两代采用16 18h的短时间方式培养，培养时间短，产生的衰亡因子或毒素等代谢产物少，可以降低代谢产物的毒性作用对菌体增殖活力的影响，提高菌体增殖活力，将这种高活力的支原体培养物在含有充足营养的条件下进行扩大培养，可使菌液浓度大大提尚ο2、以本发明方法培养的鸡毒支原体菌液无需浓缩，可以直接或稀释后制备成品疫苗；该培养方法应用于鸡毒支原体疫苗的生产中，可以简化生产工艺、降低生产成本。3、应用本方法制备鸡毒支原体疫苗，成品疫苗免疫鸡群后，免疫效果好，免疫力坚强，能抵御鸡毒支原体强毒的攻击。本发明除用于鸡毒支原体CR株，也可用于鸡毒支原体R株或其他菌株。

应用鸡毒支原体(CR株)分别通过本发明支原体培养基、支原体培养基、改良Frey氏培养基对鸡毒支原体进行增殖培养 1、本发明支原体培养基培养法a、配制本发明支原体培养基
PPLO 肉汤23g，
葡萄糖8.0g，
1%醋酸铊溶液10ml，
25%酵母浸出液100ml，
1%的酚红溶液1.5ml， 用去离子水定容到840ml，在115°C灭菌20min，待冷却后，在无菌条件下加入以下成
份
10%的精氨酸溶液(已过滤除菌)10ml，
猪血清150ml，
青霉素100万单位，
用氢氧化钠溶液(2M)调PH值至7. 8。b、制苗用菌液培养
(1)将鸡毒支原体(CR株)生产用种子按10%接种于本发明支原体培养基(1800ml)中， 37°C培养18h收获；选取收获菌液的10%，以同体积培养基(1800ml)、同样方法再传代1次；
(2)将上述传代后的菌液按10%的量接种于本发明支原体培养基(18000ml)，37°C培养 30h，测定培养基的PH下降到了 7. 1，收获菌液。继续传代，菌液按10%的量接种于本发明支原体培养基(180000ml)，37°C培养31h，测定培养基的PH下降到了 7. 0，收获菌液。(3)取适量上述半成品菌液进行活菌数测定，浓度为1. OX 1014(XU/ml。比较实例
2、支原体培养基培养法
a、配制“支原体培养基” PPLO肉汤葡萄糖
10%的精氨酸溶液 10倍浓缩MEM培养液 1%醋酸铊溶液 25%酵母浸出液 8万单位/ml青霉素猪(马)血清 1%的酚红溶液
21. Og, 5. Og, 10. Oml, 10. Oml, IOml, 100ml, 10. Oml, 100ml, 1. Oml,
用去离子水定容至IOOOml，用氢氧化钠溶液(2M)调整PH值至7. 8，0. 22微米滤过除菌备用。b、制苗用菌液培养
(1)将鸡毒支原体(CR株)生产用种子按10%接种于支原体培养基(1800ml)中，37°C培养44h，培养基的PH下降到7. 0时收获。(2)将上述传代后的菌液按10%的量接种于支原体培养基(18000ml)，37°C培养 42h，测定培养基的PH下降到了 7. 1，收获菌液。继续传代，菌液按10%的量接种于支原体培养基(180000ml)，37°C培养42h，测定培养基的PH下降到了 7. 1，收获菌液。
(3)取适量上述半成品菌液进行活菌数测定，浓度为1. OX 108(XU/ml。3、改良Frey氏培养基培养法 a、配制改良Frey氏培养基
(1)基础液
NaCl5g
KCl0.4g
MgS04 · 7H200. 2g
Na2HP04 · 12H201. 6g
K2HP040. Ig
葡萄糖IOg
乳蛋白水解物5g
溶于1000ml去离子水中，115°C 20分钟灭菌。(2)培养基
基础液IOOml
猪血清13ml
25%酵母浸出液IOml
青霉素10万单位
1% 酚红0. Iml
1/80醋酸铊Iml
以IN NaOH调PH值至7. 7。b、制苗用菌液培养
(1)将鸡毒支原体(CR株)生产用种子按10%接种于改良Frey氏培养基(1800ml)中， 37°C培养36h，培养基的PH下降到7. 1时收获。(2)将上述传代后的菌液按10%的量接种于改良Frey氏培养基(18000ml)，37°C 培养38h，测定培养基的PH下降到了 6. 9，收获菌液。继续传代，菌液按10%的量接种于改良Frey氏培养基4 (180000ml )，37°C培养37h，测定培养基的PH下降到了 7.0，收获菌液。
藏号为心。
(3)取适量上述半成品菌液进行活菌数测定，浓度为1.0X109(XU/ml。 所述鸡毒支原体名称为Mycoplasma gallis印ticum，简称为MG，菌株为CR株，保 = CGMCC No. 3900，于2010年06月25日保藏在中国微生物保藏委员会普通微生物中
实施例2
应用鸡毒支原体(R株)分别通过本发明支原体培养基、支原体培养基、改良Frey氏培养基对鸡毒支原体进行增殖培养。
1、本发明支原体培养基培养法 a、配制本发明支原体培养基
PPLO 肉汤24g，
葡萄糖10.0g，
1%醋酸铊溶液10ml，
25%酵母浸出液100ml，
61%的酚红溶液
1. 5ml,
用去离子水定容到790ml，在115°C灭菌20min，待冷却后，在无菌条件下加入以下成
份
用氢氧化钠溶液(2M)调PH值至7. 7。b、制苗用菌液培养
(1)将鸡毒支原体(R株)生产用种子按10%接种于本发明支原体培养基(1800ml)中，， 37°C培养18h收获；选取收获菌液的10%以同体积培养基(1800ml)、同样方法再传代1次；
(2)将上述传代后的菌液按10%的量接种于本发明支原体培养基(18000ml)，37°C培养 32h，测定培养基的PH下降到了 7.0，收获菌液。继续传代，菌液按10%的量接种于本发明支原体培养基(180000ml)，37°C培养30h，测定培养基的PH下降到了 7. 1，收获菌液。(3)取适量上述半成品菌液进行活菌数测定，浓度为1. OX 1013(XU/ml。比较实例
2、支原体培养基培养法
a、按实施例1中相应方法，配制支原体培养基；
b、制苗用菌液培养
(1)将鸡毒支原体(CR株)生产用种子按10%接种于支原体培养基(1800ml)中，37°C培养42h，培养基的PH下降到7. 0时收获。(2)将上述传代后的菌液按10%的量接种于支原体培养基(18000ml)，37°C培养 39h，测定培养基的PH下降到了 7. 1，收获菌液。继续传代，菌液按10%的量接种于支原体培养基(180000ml)，37°C培养40h，测定培养基的PH下降到了 7. 1，收获菌液。(3)取适量上述半成品菌液进行活菌数测定，浓度为1. OX 109(XU/ml。3、改良Frey氏培养基培养法
a、按实施例1中相应方法，配制改良Frey氏培养基，调PH值至7.8 ；
b、制苗用菌液培养
(1)将鸡毒支原体(CR株)生产用种子按10%接种于改良Frey氏培养基(1800ml)中， 37°C培养37h，培养基的PH下降到7. 1时收获。(2)将上述传代后的菌液按10%的量接种于改良Frey氏培养基(18000ml)，37°C 培养36h，测定培养基的PH下降到了 7. 1，收获菌液。继续传代，菌液按10%的量接种于改良Frey氏培养基4 (180000ml )，37°C培养37h，测定培养基的PH下降到了 7.0，收获菌液。(3)取适量上述半成品菌液进行活菌数测定，浓度为1. OX 108(XU/ml。实施例3
用实施例1中应用本发明支原体培养基培养的鸡毒支原体(CR株)半成品菌液制备鸡毒支原体灭活疫苗，并进行疫苗的安全检验和效力检验。a、鸡毒支原体(CR株)灭活疫苗制备
(1)灭活在鸡毒支原体菌液中加入甲醛溶液灭活，34%甲醛溶液灭活培养液=2 1000 (体积体积)，37°C作用20h，每2h摇勻一次。
10%的精氨酸溶液(已过滤除菌) 猪血清
IOml 200ml 100万单位
青霉素
(2)水相制备取灭菌吐温-80 4份加入到96份灭活培养液中，在灭活容器内摇勻，制得水相物。(3)油相制备取兽用白油94份，加司本-80 6份，混勻后加入2%硬脂酸铝2份， 加热至完全溶解后，115°C灭菌40分钟，冷却后即得油相物备用。(4)乳化取油相3份加入到胶体磨中，在低速搅拌的同时，缓慢加入水相1份，以 8000r/min搅拌12分钟，即制得鸡毒支原体(CR株)灭活疫苗。b、安全检验取40日龄SPF鸡8只，大腿肌肉注射疫苗，每只lml，连续观察14天。 结果表明，注苗鸡无体温升高现象，饮食及精神状态无异常。注射部位无红肿、无组织液化及肉芽组织增生等不良反应，注射部位吸收良好。C、效力检验取40日龄SPF鸡8只，颈背部皮下或大腿肌肉注射疫苗，每只0. 5ml, 30日后，连同条件相同的对照鸡6只，在3m2的密室内喷雾攻击R株培养物600ml (每Iml 含109颜色变色单位)，雾滴在2微米左右。观察14日，剖检观察气囊病变，对其评分，免疫组鸡平均气囊损伤保护率应在60%以上，疫苗判为合格。检验结果，本次生产的疫苗保护率达到100%。


一种提高疫苗生产中鸡毒支原体增殖能力的方法，所述疫苗经种子制备、鸡毒支原体培养基配制、制苗菌液制备及灭活疫苗制备工序制成，改进后，加大了PPLO肉汤、猪血清和葡萄糖含量，去掉了MEM成份，调整后的培养基成份配比更科学、营养价值更高。本发明方法制备的半成品菌液浓度高达1.0×1013～CCU/ml～1.0×1014CCU/ml，菌液无需浓缩，可以直接或稀释后制备灭活疫苗，既简化了生产工艺，又降低了生产成本。