专利名称：小金海棠MxHA5蛋白及其编码基因与应用的制作方法铁是人体所必需的矿质元素。因为植物是世界人ロ主要的食用铁来源，所以植物含铁量低了直接会影响人类的身体健康。据世界卫生组织调查显示，近20亿人口遭受着贫血的折磨。早产、先天性缺陷病、智力发育迟缓和健康指数下降主要是由贫血引起的。研究表明，植物只能吸收土壤中的可溶性铁-Fe (II)，但在碱性土壤(pH7. 4 8.5)中，可溶性铁的浓度不到I(TltW)I *L-1，导致许多植物表现出缺铁胁迫症状。植物轻度缺铁会导致叶绿素合成减少和光合速率降低，严重缺铁导致叶绿素合成停止，新叶变黄， 生物量大幅度下降。弄清铁吸收和自动调节机能的分子机理，对改善植物和人类的营养失衡具有重大意义。为了有效地吸收和利用土壌中的铁，植物在长期的进化过程中对缺铁形成了广泛的适应性。Romheld和Marschner教授在总结前人研究工作的基础上首先提出了高等植物在长期适应缺铁胁迫过程中所形成的两种适应性机理——机制I和机制II。机理I植物指双子叶植物和非禾本科单子叶植物。它们对缺铁的适应性反应分为形态学变化和生理学变化。形态学上的变化包括形成大量的侧根和特异的转运細胞， 这两种变化都可以增加植株发生氧化还原反应的表面积，并提高植株对铁的转运效率。 生理学上的变化由三个部分組成一个狗(111)还原酶系统、一个强有力的质子外泌泵 (H+-ATPase)和有机物质的分泌系统。这三个部分都位于形态上特化的根尖表皮細胞的细胞质膜上，并有效地对缺铁胁迫发生反应。机理I植物必须先将狗(III)还原为!^e(II) 才能被吸收利用。在供铁充足的条件下，植物的根部先将狗(III)-螯合物还原，把还原得到的 ^(ΙΙ)通过细胞质膜进行转运；在缺铁胁迫条件下，机理I植物通过激活一种特异的 H+-ATPase使土壌酸化，从而增加铁的可溶性；同时分泌一些有机酸(铁的鳌合剂)，将土壤中的!7e(III)以狗(111)-螯合物的形式溶解；然后通过细胞质膜上一种特异的根部还原酶将!^e(III)-螯合物还原。这种还原酶催化电子从胞质中还原态的吡啶核苷酸(NADH)跨膜传递给胞外作为电子受体的狗(III)-螯合物，使其还原成为狗(II)，然后再由质膜上的 Fe(II)转运蛋白转运进入根細胞。机理II植物仅指禾本科植物。禾本科植物在碱性土壤中生长时与双子叶植物和非禾本科植物相比发生的缺铁失绿症状很少，原因是禾本科植物分泌和释放高铁载体，高铁载体与铁结合形成载体复合物，并在质膜上产生ー种对植物铁载体复合物具有高度亲和力的吸收转运系统，从而使禾本科植物可以有效地吸收和利用三价铁来对抗环境中的铁胁迫。高铁载体为麦根酸类(MAs或!^)，这是ー类低分子量的非蛋白质氨基酸，对狗(111)有着強烈的亲和能力井能形成稳定的、八面体的三价铁鳌合物，并在质膜上产生ー种对む或 MAs具有高度亲和カ的转运蛋白YSL，由YSL将狗(III) -Ps转运进胞质中，从而使禾本科植物可以有效地吸收和利用三价铁来对抗环境中的铁胁迫。植物细胞质膜H+-ATPase属P型ATPase，是质膜上的插入蛋白，具有利用水解ATP 产生的能量，将细胞质膜内侧的H+泵到质膜外侧的特征，简称为质子泵。它对植物細胞营养物质的吸收、細胞内的PH的调节、气孔运动的调节、細胞伸长生长的调节和环境胁迫的调节等生理过程有重要的调节作用。此外，植物质膜H+-ATPase还參与种子萌发、細胞极性生长等生理过程的调节。植物细胞质膜H+-ATPaSe是植物生命活动的“主宰酶”。自从Hodges 等在离体质膜中证实AIPase活性以来，质膜H+-ATPase的研究受到了广泛的重视。有研究表明，缺铁条件下，黄瓜根系H+-AIPase活性升高，也会诱导黄瓜根系顶端細胞H+-AIPase蛋白和H+-ATPase的mRNA的增加。并且研究得出在缺铁黄瓜的根部CsHAl 基因的转录水平提高了，而给缺铁植株在重新供铁以后CsHAl基因的转录水平会下降。目前，已经从拟南芥中发现了 12个H+-AIPase基因家族(AHA1 AHA12)。研究发现其中有5 个基因的表达受缺铁胁迫的影响。在缺铁胁迫下，其中AHA2和AHA7的表达量上调分别为 3. 3和4. O倍，AHA3和AHA4的表达量上调约2倍，AHAll的表达量下调约2倍。小金海棠(Malus xiaojinensis Cheng et Jiang)是ー个苹果铁高效基因型，属于机理I植物。虽然已经有很多研究证明H+-AIPase基因对提高植物的耐性有很大作用， 但还未见关于小金海棠中质膜H+-ATPase基因的报导。
本发明的目的是提供ー种小金海棠MxHA5蛋白及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白质，获自小金海棠，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白质；(b)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过ー个或几个氨基酸残基的取代和/ 或缺失和/或添加且与植物中P型H+-ATPase酶活性相关的由(a)衍生的蛋白质。为了使(a)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1标签的序列 本发明公开了一种小金海棠MxHA5蛋白及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白质，获自小金海棠，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物中P型H+-ATPase酶活性相关的由(a)衍生的蛋白质。本发明所提供的MxHA5基因对于缺铁胁迫的植株具有很重要的调节作用，本发明为进一步研究小金海棠的耐缺铁性提供了很好的理论依据。本发明对于培育耐逆植物具有重大价值。