专利名称：一种纤维素原料的糖化方法随着世界经济的发展，温室气体排放、全球气候变暖、流行疾病等越来越威胁着人 类自身的生存安全。如何处理好人类与自然环境的关系，维持好生态平衡，成为各国政府未 来面临的最大挑战。唯一的解决途径是我们需逐渐摆脱对化石能源的依赖，寻找没有污染 的替代性能源。而纤维素是地球上最丰富的可再生资源，每年陆生植物就可以产生纤维素 大约500亿吨。此外，纤维素资源还是最主要的生物质资源，它占地球生物总量的60-80%。 我国的纤维素原料非常丰富，仅农作物秸秆、皮壳一项，每年产量就达7亿多吨，其中玉米 秸秆(35% )、小麦秸秆(21% )和稻草(19% )是我国的三大秸秆资源。纤维素类资源具 有来源丰富、种类多、生产周期短等优点，因此如何有效地利用这些纤维素具有非常重要的 战略意义。传统的纤维素原料生产生物燃料过程包括预处理、纤维素和半纤维素水解糖化和 酵母发酵等环节。其中，纤维素和半纤维素预处理和水解糖化技术是制约生产生物燃料的 关键环节。目前，生产商普遍采用的纤维素糖化方法为先用高温高压汽爆法或者浓硫酸水 解法，然后采用来自真菌的纤维素酶降解。但是这些方法存在成本高、污染严重等高耗能问 题，且产生如糠醛、有机酸、芳香族化合物等化学抑制剂，对后续的产乙醇发酵存在抑制作 用。此外，来自真菌的纤维素酶不耐高温、不耐化学抑制物等问题。因此，现有方法严重制 约植物纤维质的开发利用。针对纤维素原料预处理存在的诸多问题，本发明公开了一种利 用高温菌如热纤梭菌(Clostridium thermocellum)及其分泌的纤维素酶进行纤维素原料 糖化的方法。通过本发明优化发酵条件及其酶反应条件，大大提高了对不经过预处理的纤 维素原料进行糖化的酶解速率和产量。严格厌氧纤维素降解菌是一类能够直接利用纤维素 进行生长的微生物。它们分泌产生一种超分子多蛋白亚基的纤维素酶复合体_纤维小体， 能够有效降解植物细胞壁。纤维小体被认为是自然界已知的水解不溶性纤维素的最有效的 酶系统。与真菌的非纤维小体酶系相比，纤维小体酶组分更复杂(热纤梭菌有七十多种组 分)、功能更为全面。纤维小体的各组分之间比例精确，空间上具有更优的协同作用能力，能 够降解结构更为复杂的结晶纤维素和木质纤维素。同时，本发明采用高温细菌进行纤维素 糖化发酵，不仅可以降低发酵过程中出现杂菌污染的概率，而且由于其分泌的纤维素酶具 有更好的热稳定性，能够持续更长的发酵时间。
本发明的目的在于提供一种纤维素原料的糖化方法。通过该方法，秸秆等纤维素 原料不经过任何酸或碱等方法的预处理，可以直接被利用，大大降低了纤维素生物燃料的 生产成本。克服了传统纤维素预处理过程中能耗大、污染严重和对设备的苛刻要求等不足，因此提高了经济性能，有利于我国低碳经济的发展。为实现上述目的，本发明提供的纤维素原料的糖化方法，其主要步骤为1)将纤维素原料烘干后粉碎至20-60目，按固液质量比1 10-1 50加入GS-2液体培养基；2)将嗜热厌氧纤维素降解菌接种到含有碳源的液体培养基中，于50-60°C厌氧培 养至0D_为0. 5-1. 5，制备嗜热厌氧纤维素降解菌的种子液；3)将种子液接种至步骤1中含纤维素原料的液体培养基中，50-60°C厌氧密封发 酵至纤维素原料利用完全；4)固液分离，取上清液。本发明的纤维素原料的糖化方法，其主要步骤还可以是1)将嗜热厌氧纤维素降解菌接种到含有碳源的GS-2液体培养基中，于50-60°C厌 氧培养至0D_为0. 5-1. 5，制备嗜热厌氧纤维素降解菌的种子液；2)将种子液按1-15%的接种量接种至步骤1的GS-2液体培养基中，于50-60°C厌 氧密封发酵至纤维素原料利用完全；3)将步骤2中的发酵液离心，冷却后，上清液中加入100-200目的纤维素颗粒；4)提取步骤3产物中的纤维小体，按10_50U/g比例加入至含有固液质量比 1 10-1 50纤维素颗粒和pH为6-7磷酸盐缓冲液的悬浮液中，50-70°C进行酶解；磷酸 盐缓冲液的组成为0. 07-0. 137mol/L磷酸二氢钠，0. 01-0. 063mol/L磷酸氢二钠，3_5mM氯 化钙，20-25mM乙酸钠；5)固液分离，取上清液。所述的方法中，每升GS-2液体培养基的组成为1-1. 5g磷酸二氢钾，2-2. 9g磷酸 氢二钾，8-10g MOPS (3-吗啉丙磺酸钠盐)，l_3g 二水柠檬酸钠，1. 5-2. lg尿素，0. 7-1. 0g六 水氯化镁，100_150mg二水氯化钙，1-1. 25mg六水硫酸亚铁，4-6g酵母提取物和0. 5_lg半胱 氨酸盐，并且添加0. 08-0. 15ml 99%冰醋酸。所述的方法中，嗜热厌氧纤维素降解菌包括高温梭菌flostridiumthermocellum 禾口 Clostridium stramini sol vents ；以及！^温厌氧菌 Thermoanaerobacter brockii、 Thermoanaerobacterium mathranii>Thermoanaerobacter saccharolyticum。所述的方法中，纤维素降解过程整个降解体系处于无氧、密闭空间，且充入1-10 个大气压的氮气/氢气混合气，其中氢气含量为0-10%。与现有技术相比，本发明的效果是1)纤维素原料直接粉碎即可使用，不经过气爆、酸水解等纤维素预处理过程。不仅 节约糖化成本，而且避免了酸或碱的污染，从而有利用后续发酵；2)本发明中的高温细菌能够分泌果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶、木质素酶、淀粉 酶、酯酶等多种酶。因此本发明在纤维素原料方面具有广谱性，从简单的废纸、结晶纤维素 到复杂的木质纤维素如锯末等都能够进行高效糖化；3)本发明还能从高温细菌糖化纤维素原料的发酵液中提取纤维素酶，并利用其进 行纤维素原料的糖化，不仅能够节约纤维素糖化成本，而且能提高纤维素降解速度。1)将玉米秸秆烘干，粉碎成40目颗粒，取2g粉碎好的原料，加入100ml GS_2液体 培养基(每升1.5g磷酸二氢钾，2. 9g磷酸氢二钾，10gM0PS，3g 二水柠檬酸钠，2. lg尿素，1.0g六水氯化镁，150mg 二水氯化钙，1. 25mg六水硫酸亚铁，6g酵母提取物和lg半胱氨酸 盐，并且添加0. 15ml 99%冰醋酸，pH= 7.4)，通入0. 2MPa氮气/氢气混合气(5%氢气)5 分钟除氧后121°C灭菌15分钟；2)制备热纤梭菌种子液，挑取热纤梭菌单克隆，接种到5ml GS_2液体培养基 (0. 5%微晶纤维素)中，60°C厌氧培养至0D_为1. 5 ；3)将lml种子液接种至步骤1中含玉米秸秆的培养基中，60°C厌氧密封发酵5天， 纤维素原料利用完全；4)8，000rpm,30min离心，固液分离，上清液即为糖液，该糖液可用于下一步的燃料 生产。测定玉米秸秆的降解率为80%，糖转化率为29. 3%。实施例21)配制100ml含有0.5%结晶纤维素的GS-2液体培养基(每升1. 5g磷酸二氢钾，2.9g磷酸氢二钾，10g MOPS，3g 二水柠檬酸钠，2. lg尿素，1. 0g六水氯化镁，150mg二水氯化 钙，1. 25mg六水硫酸亚铁，6g酵母提取物和lg半胱氨酸盐，pH = 7. 4)，通入0. 2MPa氮气/ 氢气混合气(其中氢气含量5% ) 5分钟除氧，121°C灭菌15分钟；2)制备热纤梭菌种子液挑取热纤梭菌单克隆，接种到5ml GS_2液体培养基 (0. 5%微晶纤维素)中，60°C厌氧培养36小时至0D6(K1为1. 5 ；3)将1ml种子液接种至步骤1的培养基中，60°C厌氧密封发酵72小时，然后测定 发酵液中纤维小体的滤纸酶活；4)将100ml发酵液(约含有20U的纤维小体)8，OOOrpm离心30min, 4°C冷却。然 后加入lg粉碎成200目玉米秸秆颗粒4°C过夜放置；5) 12，OOOrpm离心30min，收集沉淀即将纤维素秸秆与酶混合物，上清糖液回收。 然后将纤维素秸秆与酶混合物与10ml磷酸盐缓冲液(0. 137mol/L磷酸二氢钠，0. 063mol/L 磷酸氢二钠，5mM氯化钙，25mM乙酸钠，pH = 6. 5)混合，65°C酶解96h。6)8，OOOrpm，30min离心，上清即为糖液，该糖液可用于下一步的燃料生产。测定玉 米秸秆的降解率为57. 2%，糖转化率为45. 8%。


一种纤维素原料糖化的方法，是基于一种高温嗜热厌氧菌分泌的纤维小体，该纤维素小体能够有效降解结构复杂的结晶纤维素。本发明通过在其培养基和酶反应缓冲液中添加低浓度乙酸盐以及在其发酵器中通入低浓度的氢气，大大提高酶反应速度和糖的累积。本发明能够使不经过物理或化学的方法预处理的纤维素材料，直接进行发酵或酶处理，并高效水解为还原糖。