专利名称：人类心房颤动致病基因和编码蛋白及其用途的制作方法 根据世界卫生组织的定义，心房颤动(atrial fibrillation)是心房不规则的、杂乱无章的电活动，心电图上P波消失，代之以基线上形状、大小、方向和时程不一的颤动波，在没有高度或完全性房室传导阻滞情况下心室率完全不等。心房颤动是临床上最常见的心律失常之一，它促发心力衰竭或血流动力学障碍，诱发室速或室颤等致命性心律失常，导致血栓和栓塞事件，增加基础心脏病的死亡率，心房颤动本身还可以引起心脏扩大。根据统计，美国心房颤动发生率为0.9％。随着年龄的增长，心房颤动发生率激剧增高，在65岁以上者则高达5.9％。根据Framinham研究，老年人(＞65岁)卒中1/3由心房颤动引起。欧洲心房颤动发生率与美国相仿，亚洲略低。心房颤动严重地危害着人类的健康，也给社会带来了相当的经济负担。1904年Mackenzie较详细地描述了心房颤动，从此以后将近一个世纪已经过去了，然而心房颤动的发生机制依然莫衷一是，心房颤动依旧是医学所面临的一大挑战。作为心房颤动的特殊类型，特发性心房颤动指无明确的心脏病变基础的心房颤动。其命名比较混乱，其他的名称有孤立性特发性心房颤动、良性特发性心房颤动和家族性特发性心房颤动。多达三分之一的心房颤动归类为特发性心房颤动(Lip GYH，Beevers DG(1995)ABC of atrial fibrillationhistory，epidemiology，and importance ofatrial fibrillation.BMJ 3111361-1363)。KCNQ1是一种已知的基因(Genbank登录号No.AJ006345)。KCNQ1的其它名称有KCNA9，KVLQT1，LQT1，KCNA8和LQT。KCNQ1基因位于人类11号染色体11p15.5。目前已知KCNQ1有4种转录产物，主要转录产物有两种(为了便于陈述，把这两种转录产物称为转录产物1和转录产物2)。这两种转录产物都包含16个外显子，转录产物1的第一个外显子为1a，转录产物2的第一个外显子为1b，转录产物1和转录产物2的后15个外显子(即外显子1-15)完全一样。该基因表达产物是缓慢激活的延迟整流钾通道Iks的α亚单位，与钾离子外流有关。已有的研究表明，KCNQ1基因突变可以导致先天性长QT综合征，该病可以引起严重心律失常和猝死。然而，没有公开或暗示过KCNQ1与人类心房颤动有关。总之，在本申请之前尚未公开或报道与人类心房颤动有关的人类心房颤动致病基因。因此，本领域迫切需要开发与人类心房颤动有关的基因以及有关的药物筛选模型和方法。

本发明的目的是提供一种新的人类心房颤动致病基因(Causative Gene ofAtrial Fibrillation，简称为“AFGene”)及其编码的蛋白多肽、它们的片段、类似物和衍生物，提供生产这些蛋白多肽和编码序列的方法以及该蛋白多肽和编码序列的用途。
发明的另一目的是提供了转入AFGene基因的转基因细胞模型及其制法和和用途。
在本发明的第一方面，提供了一种分离的AFGene基因编码多肽，它包括具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽，或其含有氨基酸序列FLIVLVCLIFGVLSTIEQYAALATGTLFWM(SEQ ID NO4)的保守性变异多肽或其活性片段或其活性衍生物。
较佳地，所述的多肽选自下组(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有使该多肽与-KCNE1构成的复合物的离子流增大功能的、由(a)衍生的多肽。
在本发明的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组(a)编码上述AFGene多肽的多核苷酸；(b)与(a)中所述多核苷酸互补的多核苷酸。
较佳地，所述的多核苷酸含有选自下组的核苷酸序列(1)编码具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
(2)SEQ ID NO1中1-2031位的核苷酸序列；(3)SEQ ID NO1中1-2028位的核苷酸序列。
在本发明的第三方面，提供了含有本发明上述的多核苷酸的载体以及被所述的载体转化或转导的遗传工程化的宿主细胞。
在本发明的第四方面，提供了一种制备人AFGene基因编码蛋白的制备方法，该方法包含(a)在表达蛋白的条件下，培养上述的宿主细胞；(b)从培养物中分离出人AFGene基因编码蛋白。
在本发明的第五方面，提供了一种检测心房颤动的试剂盒，它包括(1)特异性扩增人AFGene基因的引物对，(2)用于检测扩增产物与正常AFGene基因相比是否存在变化所需的试剂。
在本发明的第六方面，提供了一种检测心房颤动易感性的方法，它包括步骤检测心脏细胞样品中AFGene转录本与正常AFGene转录本相比是否有变化，有变化就表示存在心房颤动易感性；或者检测心脏细胞样品中AFGene基因编码蛋白的活性与正常AFGene基因编码蛋白的活性相比是否有变化，有变化就表示存在心房颤动易感性；或者检测基因组样品中AFGene基因组序列与正常AFGene基因组序列相比是否有变化，有变化就表示存在心房颤动易感性。
在一优选例中，所述的变化包括外显子1中的核苷酸的缺失、插入和置换突变。更佳地，所述的变化选自下组SEQ IDNO1中核苷酸418由A→G，SEQ ID NO3中核苷酸32由A→G，SEQ ID NO2中140位氨基酸由S→G，SEQ ID NO4中11位氨基酸由S→G。
在本发明的第七方面，提供了一种制备遗传性心房颤动非人动物模型的方法，所述的动物是非人哺乳动物，该方法包括步骤(a)将一遗传构建物转入动物细胞，所述的遗传构建物包括5＇同源臂和3＇同源臂，以及位于同源臂之间的供筛选的标记基因和引入AFGene外显子1突变的突变元件，并且所述的5＇同源臂和3＇同源臂分别同源于基因组中人AFGene外显子1第32位核苷酸上游和下游的核苷酸序列；(b)通过同源重组，获得基因组整合入有突变元件的动物细胞；(c)从步骤(b)的动物细胞再生获得转基因动物。
在一优选例中，所述的突变元件与5＇同源臂或3＇同源臂相连。
在另一优选例中，步骤(b)的动物细胞是ES细胞，并且所述的步骤(c)包括将ES细胞显微注射装置注入小鼠囊胚腔，然后植入代孕小鼠子宫，产生嵌合小鼠。
在另一优选例中，所述的方法还包括步骤(d)将嵌合小鼠与正常小鼠交配，以产生杂合的转基因小鼠。
在另一优选例中，所述的方法还包括步骤(e)将杂合的转基因小鼠交配，产生AFGene纯合的转基因小鼠。
在另一优选例中，所述的步骤(b)的动物细胞是ES细胞，并且所述的步骤(c)包括将ES细胞的细胞核显微注射装置注入去核的小鼠卵细胞，然后植入代孕小鼠子宫，产生转基因小鼠。
在本发明的第八方面，提供了一种转基因非人哺乳动物，其基因组中KCNQ1对应于人AFGene基因外显子1的核苷酸序列发生了改变，从而患有心房颤动。
在一优选例中，所述的动物是小鼠，其基因组中KCNQ1的外显子2的核苷酸32由A→G。
在本发明的第九方面，提供了一种复合物，它由具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的KCNQ1S140G和KCNE1(Iks)构成。
本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。


图1显示了一种人类心房颤动致病基因的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。其中，带框的序列为外显子1a，下划线部分为外显子1，突变位点用斜体表示。
图2显示了线性化的打靶构建物。“3＇Arm”表示3＇臂，“5＇Arm”表示5＇臂，PA是聚腺苷酸信号，neo为新霉素抗性基因。
图3显示了PCR筛选阳性ES克隆的电泳图。其中“3＇Arm”表示3＇臂，“5＇Arm”表示5＇臂。18，21，35为克隆编号。
图4显示Southern印迹法鉴定ES克隆的结果。其中18，21等数字为克隆编号。
图5显示了AFGene基因的转基因细胞的心电图。
图6显示了复合物KCNQ1S140G-KCNE1(Iks)的离子流增大。
图7是质粒X_pPNT的结构图。

为了找到AFGene基因，本发明人对一个常染色体显性遗传特发性房颤的大家系进行微卫星全基因组扫描、连锁分析和单倍型分析，将AFGene基因定位于染色体上一个较小的区域(11号染色体11p15.5)。然后通过候选基因的方法，对候选基因(KCNQ1等)的外显子进行PCR直接测序，寻找可能致病的基因突变。在该家系中确立了突变(KCNQ1 S140G或日AFGene基因)与心房颤动的关系后，进一步排除必须数量以上正常随机个体存在同样的基因突变的可能性。然后，将该AFGene基因转染到哺乳动物细胞(COS-7)，再通过膜片钳检测AFGene基因表达蛋白所形成的离子流变化。研究发现AFGene基因导致独特的KCNQ1-KCNE1(Iks)和KCNQ1S140G-KCNE2功能增益效应。因而，最终确立了AFGene基因为人类心房颤动致病基因。通过将该AFGene基因敲入小鼠，产生出房颤表现型，更加确立AFGene基因为人类心房颤动致病基因。本发明鉴别出的AFGene基因是KCNQ1的一种变异体。该AFGene基因和编码蛋白导致人类心房颤动。
本发明中人类心房颤动致病基因的特征是，它具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列，与人类KCNQ1基因序列不同之处为AFGene基因418位(SEQ IDNO1)核苷酸为G，而KCNQ1基因418位核苷酸为A。
由于在SEQ ID NO.1所示核苷酸序列中418位核苷酸发生了A→G置换，因此，本发明AFGene基因编码具有SEQ ID NO.2所示蛋白序列。与人类KCNQ1基因编码的蛋白序列不同之处为，前者140位氨基酸(SEQ ID NO2)为甘氨酸(glycine，G)，后者的140位氨基酸为丝氨酸(serine，S)(图1)。
在基因组DNA水平，两者的区别为AFGene基因的83879位核苷酸为G，KCNQ1的83879位核苷酸为A(注采用AJ006345中核苷酸编号)。
研究已表明，人类KCNQ1由16个外显子构成。本发明的AFGene基因与人类KCNQ1仅在1号外显子上有差别，而其余外显子则完全相同。1号外显子在KCNQ1蛋白中位于S1区，与心房颤动有关。这提示，KCNQ1基因中1号外显子的变异是一种导致人类心房颤动的病因。在一个特发性心房颤动家族中检测出一种变异形式是，人类KCNQ1基因1号外显子编码序列中32位核苷酸由A变为G。一种AFGene基因的1号外显子具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列，编码的外显子具有SEQ ID NO4所示的氨基酸序列，即FLIVLVCLIFGVLSTIEQYAALATGTLFWM(SEQ ID NO4)。
在本发明中，术语“AFGene蛋白”、“AFGene多肽”、“AFGene编码蛋白”和“KCNQ1S140G”可互换使用，都指具有人AFGene基因编码蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO2)的蛋白或多肽。该术语还包括含有或不含起始甲硫氨酸的AFGene基因编码AFGene蛋白。
术语“正常AFGene基因”、和“正常AFGene蛋白(多肽)”分别指具有野生型KCNQ1 cDNA序列、基因组序列的核苷酸序列，或KCNQ1氨基酸序列的蛋白或多肽。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，“分离的AFGene蛋白或多肽”是指AFGene多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化AFGene蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。AFGene多肽的纯度能用氨基酸序列分析。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽、优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括人AFGene基因编码蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然人AFGene蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明中，术语“人AFGene基因编码多肽”指具有人AFGene基因编码蛋白活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。该术语还包括具有与人AFGene基因编码蛋白相同功能的、SEQ ID NO.2序列的变异形式。
该多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与人AFGene基因DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗人AFGene多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。
发明还提供人AFGene基因编码蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然人AFGene基因编码多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。
修饰形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，“人AFGene基因编码蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO2的蛋白质，但与SEQ ID NO1所示的编码区序列有差别的核苷酸序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码AFGene基因编码蛋白的多聚核苷酸。
本发明的人AFGene基因核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；2301350-1354)被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或AFGene基因蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术(Science，1984；2241431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的AFGene基因编码多肽。一般来说有以下步骤(1).用本发明的编码人AFGene基因编码多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，人AFGene基因多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含人AFGene基因编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
通过AFGene基因或它们的片段、类似物和衍生物植入受精卵或胚胎中，可以遗传给后代。这样的转基因动物可以产生重组多肽。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
重组的人AFGene基因编码蛋白或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)直接做为药物治疗AFGene基因编码蛋白功能低下或丧失所致的疾病，和用于筛选促进或对抗AFGene基因编码蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。用表达的重组人AFGene基因编码蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能抑制或刺激人AFGene基因编码蛋白功能的多肽分子。
另一方面，本发明还包括对人AFGene基因DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人AFGene基因产物或片段。较佳地，指那些能与人AFGene基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。一种特别优选的抗体是识别心房颤动蛋白但不识别KCNQ1蛋白的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人AFGene基因编码蛋白的分子，也包括那些并不影响人AFGene基因编码蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人AFGene基因产物结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab＇或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人AFGene基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人AFGene基因编码蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。本发明的各类抗体可以利用人AFGene基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人AFGene基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
本发明的AFGene基因编码蛋白抗体可以用来鉴定表达AFGene基因编码蛋白的细胞，如心肌细胞。例如，可以用一种可检测的分子例如荧光素异硫氰酸(FITC)来标记AFGene基因编码蛋白特异抗体，然后让AFGene基因编码蛋白特异抗体与细胞样品接触，再用荧光显微镜或流式细胞仪检测出与AFGene基因编码蛋白特异抗体结合的细胞。
除了在细胞表面检测AFGene基因编码蛋白外，还可以用Western印迹技术分析该蛋白质。细胞裂解液可以从培养细胞或取自病人的组织标本如心肌中提取，并溶解在含有去污剂的裂解缓冲液中。然后用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离细胞提取物(同时将提纯的AFGene基因编码蛋白多肽作为阳性对照)，接着通过电泳杂交将其转移到硝酸纤维素上。为了用Western印迹免疫探测AFGene基因编码蛋白，可以使用典型的抗体结合检测方法，例如放射自显影或碱性磷酸酶检测方法。并可使用免疫接种血清或不相关的单克隆抗体作为非特异反应的对照。
还可用Nothern印迹法技术分析AFGene基因编码蛋白的表达，即分析AFGene基因编码蛋白RNA转录物在细胞中的存在与否和数量。
AFGene基因编码蛋白DNA的Nothern印迹分析和AFGene基因编码蛋白特异抗体的Western印迹分析可以联合使用，以证实AFGene基因编码蛋白在生物样本中的表达。AFGene基因编码蛋白DNA还可以用于Southern印迹分析或原位杂交分析，以将该基因定位于染色体上，并可进行遗传连锁分析以找出其它可能的疾病相关基因。
另一方面，本发明还提供了转入AFGene基因的动物。通过同源重组方法和胚胎干细胞途径，或基因显微注射法，或其他一切将AFGene基因或它们的片段、类似物和衍生物转入体细胞、生殖细胞、受精卵、胚胎、胚胎干细胞的方法，可以将AFGene基因或它们的片段、类似物和衍生物植入受精卵或胚胎等中，建立遗传性心房颤动动物模型，从而将AFGene基因或它们的片段、类似物和衍生物遗传给后代。该转基因动物可以用于房颤机制研究、药物筛选和治疗手段的探索。
随着人类心房颤动分子遗传机制的部分确立，AFGene基因诊断已经可能在特定人群开展。基因诊断方法包括测序技术、DNA芯片技术等。目前的测序技术和DNA芯片都可方便地检测出某一核苷酸序列中单个或多个核苷酸的变化。一种优选的检测方法是检测AFGene基因(包括cDNA序列和基因组序列)中外显子1是否存在核苷酸变化，例如SEQ ID NO3中32位核苷酸是否由A→G。
随着AFGene基因的发现，已经可以采用转基因技术在细胞中表达相应蛋白，进而通过膜片箝或电压箝技术研究心房颤动电生理。也可以通过同源重组方法和胚胎干细胞途径或基因显微注射法，建立遗传性心房颤动动物模型，然后通过多导生理记录仪等研究心房颤动电生理。该电生理基础可能正是非应用遗传决定的心房颤动发病的电生理机制或环节之一。
通过电生理技术在转基因细胞模型和转基因动物细胞模型上可以直接筛选心房颤动新药先导化合物。
通过计算机模拟或计算机辅助技术可以推断编码蛋白空间结构，为心房颤动新药模拟设计提供基础。
遗传决定的人类心房颤动的发病机制的阐明有望从新的视角(离子通道)研究其它类型人类心房颤动，促成其他类型人类心房颤动的研究取得突破性进展。
遗传决定的人类心房颤动的新药的发掘和优化可能促成其他类型人类心房颤动的研究取得突破性进展。
利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与AFGene基因编码蛋白发生相互作用的物质，如受体、抑制剂、激动剂或拮抗剂等。
本发明蛋白及其抗体、抑制剂、激动剂、拮抗剂或受体等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)肌内、腹膜内、静脉内、皮下或局部给药。
本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明AFGene基因编码多肽或其激动剂、拮抗剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的AFGene基因编码蛋白或其拮抗剂、激动剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明还涉及定量和定位检测人AFGene蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。试验中所检测的人AFGene蛋白水平，可以用作解释人AFGene蛋白在各种疾病中的重要性和用于诊断AFGene蛋白起作用的疾病。
一种检测检测样品中是否存在AFGene蛋白的方法是利用AFGene基因编码蛋白的特异性抗体进行检测，它包括将样品与AFGene基因编码蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在AFGene基因编码蛋白。
AFGene蛋白的多聚核苷酸可用于AFGene基因编码蛋白相关疾病(如心房颤动)的诊断和治疗。一种方法是检测AFGene基因的突变，以诊断心房颤动疾病或心房颤动易感性。AFGene基因编码蛋白突变的形式包括与正常AFGeneDNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等，尤其是位于外显子1中突变形式。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。此外，本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于基因诊断。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1人类心房颤动致病基因的定位通过标准程序提取外周血白细胞基因组DNA，本发明使用第二版ABIPrism多态微卫星连锁标测试剂盒做全基因组扫描。首先做粗定位，然后对关键区域做精细定位。关键区域精细定位所采用的微卫星选自Généthon连锁图，微卫星扩增引物根据Généthon集合成。
运用多重PCR扩增微卫星，反应体积为5ul，含基因组DNA20ng、MgCl23.0mM、5-15对引物(每种引物浓度0.04uM)和0.2U AmpliTaq GoldTM酶(PerkinElmer Applied Biosystems)。采用Touchdown方法做PCR，PCR循环如下首先94℃12min；然后94℃30sec、63℃lmin(每个循环递减0.5℃)、72℃1.5min，计15个循环；继之94℃30sec、56℃lmin、72℃1.5min，计25个循环；最后72℃10min。
在自动化激光_荧光DNA测序仪(377 DNA sequencers，Perkin Elmer AppliedBiosystems)上分离PCR扩增产物，通过Genescan软件(Perkin Elmer AppliedBiosystems第三版本)计算未知DNA片段大小，应用Genotyper软件(Perkin ElmerApplied Biosystems 2.1版本)做基因型分析。采用5.1版本LINKAGE软件包(Lathrop等，1984)的MLINK程序做两点连锁分析，假定心房颤动表型为常染色体完全显性遗传，设致病基因频率为0.001，男女重组频率相同，分别在重组率为0、0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5时计算Lod值，通过人工方法做单倍型分析。
基因定位结果表明，人类心房颤动致病基因的定位于人类11号染色体11p15.5。
实施例2人类心房颤动致病基因的识别在本实施例中采用的识别人类心房颤动致病基因的策略为(1)在定位区间，首先检查已知的离子通道基因(包括KCNQ1和CHRNA10等基因)有没有发生突变；(2)如果没有在已知的离子通道基因上找到突变，将在定位区间寻找与已知的离子通道基因高度同源的DNA片段，然后以这些片段为探针筛选心脏cDNA文库，从而克隆出新的离子通道基因，接下去再检测这些新克隆的离子通道基因在家系中是否发生突变；(3)倘若在这些已知的离子通道基因和新克隆的离子通道基因中没有发现任何突变，那么将根据心律失常的病理生理机制，确定落在该区间的其他候选基因，并作突变检测，最终克隆出特发性房颤致病基因。
在本实施例中，识别人类心房颤动致病基因的关键的步骤为(1)全面和正确地确立定位区间的已知的离子通道基因；(2)不遗漏不确定定位区间的已知的离子通道基因；(3)系统地在定位区间识别与已知的离子通道基因高度同源的DNA片段；(4)从心脏cDNA文库中筛选出定位区间的新的离子通道基因；(5)根据心律失常的病理生理机制，确定落在定位区间的其他候选基因。
在本实施例中，分析了一种电压依赖性钾离子通道基因-KCNQ1的外显子。根据KCNQ1基因序列，应用Primer3软件设计了17对外显子引物，表1列出了用于外显子1A、1B、1和2的4对引物序列。
表1引物序列

采用Touchdown方法做PCR，PCR反应体系如下所需试剂 试剂初始浓度 体系终浓度缓冲液 10× 1×dNTP 10uM0.2uMMgCl225mM3mM引物 20mM0.3uMTaq 5U/ul 0.03-0.05U/ul模板(抽提的基因组DNA)25ng/ul 1ng/ulQ-溶液 5×1×反应的总体积为25ul，用ddH2O来补足体积。
将加好样的Eppendorf管放入Perkin Elmer 9700热循环仪上进行PCR反应。PCR反应条件根据不同的引物设置不同的参数。取PCR产物，在含0.5μg/μl溴已锭的2％琼脂糖凝胶中电泳，证实扩增效果。PCR扩增的目的片段经电泳鉴定和纯化后，用DNA Sequencing Kit(Big DyeTM Terminator Cycle Sequencing，PEBiosystems，Foster City，CA，USA)进行双向测序反应。测序反应条件95℃变性20s，50℃退火15s，60℃延伸1min，30个循环。产物经乙醇沉淀后，在ABI377自动测序仪进行核苷酸序列测定。通过PolyPhred软件和肉眼对测序结果进行分析，综合正反双向序列结果识别突变。
经过测序结果和基因型表现型分析，初步证实KCNQ1基因存在致病突变。之后，进一步对200例正常随机个体的KCNQ1基因进行的测序，排除了存在同样的基因突变的可能性，从而最终确立了人类心房颤动致病基因，它具有SEQID NO.1所示核苷酸序列，其中开放阅读框位于1-2028，其编码蛋白具有SEQ IDNO2所述的氨基酸序列。1号外显子核苷酸序列如SEQ ID NO3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO4所示。
与正常的KCNQ1基因和编码蛋白相比，AFGene基因和蛋白存在以下变化SEQ ID NO1中核苷酸418由A→G，SEQ ID NO3中核苷酸32由A→G，SEQID NO2中140位氨基酸由S→G，SEQ ID NO4中11位氨基酸由S→G。
实施例3利用knock-in技术建立遗传性房颤小鼠模型本实施例中通过基因敲入建立遗传性房颤动物模型，在动物中证实S140G突变的致房颤作用。
将人和鼠的KCNQ1基因进行同源性比较发现，KCNQ1基因高度保守，人类1-8外显子分别对应于小鼠2-9外显子，其氨基酸同源性达100％，人类第1外显子对应于小鼠第2外显子，其核苷酸同源性为90％，氨基酸同源性达100％。因此，将小鼠第2外显子的第32位核苷酸的A变成G应能使小鼠发生遗传性房颤。
通过对小鼠KCNQ1基因的基因组序列进行酶切分析，将用于基因打靶的两个同源重组臂设计在第2、3外显子间(包括部分第2外显子)，即5＇臂44807-47832，3＇臂40739-43790(GeneBankAJ251835)。分别用以下两对引物5＇臂引物5＇-CGTGAATTCTTTAGGGTTGTTGGATCTGTGTT-3＇(SEQ ID NO13)，5＇-TGTGAATTCCTCATCTTCGGTGTCCTGTG-3＇(SEQ ID NO14)；3＇臂引物
5＇-GTTGCGGCCGCAGCIGAAATGGAGAAGATA-3＇(SEQ ID NO15)，5＇-TTGGCTCGAGCTGGC TGTGTCTAGTGG-3′(SEQ ID NO16)。
以小鼠基因组DNA为模板，通过PCR扩增两臂。(注A→G置换点突变设计在扩增5＇臂的引物上)。先将3＇臂扩增产物用XhoI和NotI酶切，连入相同打靶载体X_pPNT(图7)(质粒X_pPNT是将pPNT(Okada K，et al.Characterizationand targeting of the murine alpha2-antiplasmin gene.Thromb Haemost.1997 Sep；78(3)1104-10.)消去二个XhoI位点而形成的)。形成的载体在用EcoRI酶切，与EcoRI酶切过的5＇臂扩增产物连接，所获得的阳性重组载体克隆后，经测序证实已经引入了定位突变。
用NotI线性化打靶载体(图2)。将45μg(30μl)纯化过的线性化重组载体与1ml约2×107个ES细胞(源于129/Sv鼠系)混合后装入电穿孔槽，置于电穿孔仪进行电击打靶(240V，500μF)，体外培养24小时后加入G418和GANC作正负双选择，生存下来的83个ES细胞克隆再经PCR(鉴定两臂用引物各有一条在外源载体序列上)及Southern印迹(BamHI酶切)杂交筛选，获得3个阳性ES细胞克隆(图3和4)。
将一个ES细胞克隆培养扩增后通过显微注射装置注入C57BL/6J小鼠囊胚腔，每一囊胚腔注入10-15个ES细胞，共注射了18个囊胚，再将注射过ES细胞的囊胚37℃培养2小时许，分别植入代孕C57BL/6J小鼠子宫，17天后有5胎发育成熟，其中一胎产生3只嵌合体小鼠，依据毛色判断(注AFGene与毛色基因连锁)，其嵌合度均在90％以上，且全为雄性，分别与C57BL/6J雌鼠交配，有一只嵌合体小鼠3个多月后生产出F1代杂合子，杂合子同胞配对1个多月后就生产出F2代纯合子。经过心电图检测，证实F1代和F2代产生了房颤表型(显性)(图5)。
实施例4人类心房颤动致病基因编码蛋白的制备和提纯在该实施例中，将全长的AFGene基因序列或片段构建入商品化的蛋白质融合表达载体之中，以GST融合蛋白的形式在大肠杆菌中进行原核表达，并提纯重组蛋白。
(1)原核表达载体的构建，以及转化大肠杆菌根据AFGene基因编码蛋白全长编码序列(SEQ ID NO.1)，设计扩增出完整编码阅读框的引物(分别对应于编码序列5＇和3＇端的约20个以上核苷酸)，并在正反引物上分别引入限制性内切酶位点(这根据选用的pGEX-2T载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将AFGene在保证阅读框正确的前提下克隆至pGEX-2T载体(Pharmacia，Piscataway，NJ)。鉴定好的表达载体利用CaCl2方法转入大肠杆菌DH5α，筛选鉴定得到含有pGEX-2T-AFGene表达载体的工程菌DH5α-pGEX-2T-AFGene。
(2)表达GST-AFGene重组蛋白的工程菌的分离鉴定挑取单菌落的DH5α-pGEX-2T-AFGene工程菌于3ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中振摇培养过夜，按1∶100的浓度吸取培养液于新的LB培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)中培养约3小时，至OD600达0.5后，加入IPTG至终浓度1mmol/L继续于37℃分别培养0，1，2，3小时。取培养时间不同的1ml菌液离心，在细菌沉淀物中加入裂解液(2×SDS上样缓冲液50μl，蒸馏水45μl，二巯基乙醇5μl)，混悬细菌沉淀，沸水浴中煮5分钟，10000rpm离心1分钟，上清加入12％SDS-PAGE胶中电泳。染色后观察预期分子量大小的蛋白量随IPTG诱导时间增加而增加的菌株即为表达GST-AFGene融合蛋白的工程菌。
(3)GST-AFGene融合蛋白的提取纯化按上述方法诱导表达GST-AFGene融合表达蛋白的工程菌DH5α-pGEX-2T-AFGene。诱导后的细菌离心沉淀，按每400ml菌加入20ml PBS重悬细菌，超声破碎细菌。破菌完全的超声液按每毫升加入20微升的量加入PBS饱和的50％谷胱苷肽Sepharose 4B，37℃振摇结合30分钟，10000rpm离心10分钟沉淀结合了GST-AFGene的谷胱苷肽Sepharose 4B，弃上清。按每毫升超声液所得沉淀加入100μl PBS的量清洗两次，而后按每毫升超声液所得沉淀加入10μl还原型谷胱苷肽洗脱液，室温置10分钟，10000rpm离心10分钟，上清即为洗脱的融合蛋白。重复洗脱两次。洗脱的上清保存于-80℃，并进行SDS-PAGE电泳，检测纯化效果，获得的重组AFGene融合蛋白的分子量与预计分子量相符。
实施例5AFGene基因编码蛋白或多肽在昆虫细胞中进行真核细胞表达(1)AFGene基因杆状病毒表达载体的构建及转染Sf9昆虫细胞株根据AFGene基因的全长编码序列(SEQ ID NO.1)，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在正反引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，从而构建表达载体。将AFGene cDNA在保证阅读框架的前提下克隆至pVL1392载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)。鉴定好的表达载体3μg，野生型线性杆状病毒DNA(BaculoGoldTM ACMNPV DNA，Pharmingen，San Diego，CA)1μg和Lipofection(Gibco-BRL，NY)25μl，加入1ml无血清的昆虫培养基中，振荡15秒混匀，室温孵育15分钟备用。取1ml(2×106)Sf9昆虫细胞悬液于60mm组织培养板中，贴壁1小时后换转染培养基，室温孵育15分钟后弃培养基，加入前面制备好的DNA载体转染混合物，Parafilm密封培养板，于室温27℃振摇培养4小时，而后换完全培养基培养3天，收集上清备用。
(2)转入重组表达载体的昆虫细胞株的筛选鉴定转染3天后的昆虫细胞用新鲜培养基制成细胞悬液(2×106/1ml)，取1ml细胞悬液置于60mm组织培养皿中，加入3ml培养基，100μl收集的培养上清，贴壁1小时，弃2ml培养基，继续室温培养1小时，弃去所有的培养基，加入预热的含20μl 4％X-gal的3ml半固体培养基，培养5-7天后挑取白色细胞克隆于96孔培养板中培养3-5天，而后吸取上清感染Sf9昆虫细胞。
收集感染的细胞进行Western鉴定。将细胞裂解后进行SDS-PAGE电泳，电泳后的胶于Pharmacia的Multiphor II半干电转移仪中将蛋白质转印到硝酸纤维膜上，将硝酸纤维膜置于封闭液中封闭1小时，而后于抗AFGene基因编码蛋白的抗体溶液中封闭1小时，TBS液振摇清洗5分钟共2次，而后将膜置于生物素标记的抗AFGene编码蛋白一抗的第二抗体溶液中振摇1小时，TBS清洗，加入亲和素-碱性磷酸酶复合物反应30分钟，TBS清洗2次，加入新鲜配制的显色液显色观察蛋白条带。
挑取高表达人AFGene基因的Sf9细胞克隆。
(3)AFGene基因编码蛋白提取纯化用高表达AFGene基因编码蛋白的Sf9细胞克隆的上清大量感染Sf9细胞，感染48小时后收集细胞，PBS洗涤。每2×108细胞加入20ml细胞裂解液(0.5％Triton X-100，20mM Na3PO4(磷酸钠，pH7.8)，500mM NaCl，1mM Na3VO4(钒酸钠)，1mM Pefabloc，1μg/ml胃蛋白酶抑制剂，亮抑蛋白酶肽和抑蛋白酶肽)破细胞，12000×g离心20min去除细胞碎片，上清按每2×108的细胞加入2ml NTA-琼脂糖(Qiagen，Germany)，4℃吸附1小时。而后用含100nM咪唑的His缓冲液洗涤两次，用含20mMN，N＇-二哌嗪，500mM NaCl，300mM咪唑的缓冲液洗脱以得到纯化的蛋白。洗脱液保存于4℃，并进行SDS-PAGE电泳检测提取的AFGene编码蛋白的纯度。根据分子量识别AFGene基因编码蛋白。
实施例6抗AFGene基因编码蛋白抗体的制备(1)免疫小鼠和脾细胞的制备将获得的人AFGene基因编码蛋白用层析法进行分离后备用，也可以用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中割下，并用等体积的完全Freund＇s佐剂乳化。取6-8周龄Balb/C雌鼠，用50-100μg/0.2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund＇s佐剂乳化的同样抗原对小鼠以50-100μg/0.2ml的剂量再加强免疫一次，3-5天后用于融合。其中，脾细胞制备，制备饲养细胞，和细胞融合按常规方法进行。
(2)抗体的检测在细胞融合10-15天后，需逐孔进行检查，一旦发现旺盛的杂交细胞集落生长，就应用人AFGene蛋白做抗体活性的初步筛选，常用的方法有免疫荧光试验、发射免疫试验(RIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)。检查出抗体活性的孔后，立刻进行克隆培养，并分离出抗体。
实施例7复合物KCNQ1S140G-KCNE1(Iks)的离子流增大如实施例5获得KCNQ1S140G表达载体，然后将其单独或与KCNE1表达载体共同转染COS-7细胞。通过膜片钳技术分析上述基因表达蛋白形成的电流。同时运用野生型KCNQ1作为对照。
结果发现，与复合物KCNQ1-KCNE1相比，复合物KCNQ1S140G-KCNE1(Iks)产生了独特的功能增益Iks电流，其离子流增大(图6)。功能增益的KCNQ1S140G-KCNE1(Iks)可以作为其他研究或治疗方法针对的对象或靶。例如，抑制KCNQ1S140G-KCNE1(Iks)的物质就可能成为治疗心房颤动的手段。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>同济大学<120>人类心房颤动致病基因和编码蛋白及其用途<130>027868<160>16<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2031<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>1atggccgcgg cctcctcccc gcccagggcc gaaaggaagc gctggggttg gggccgcctg60ccaggcgccc ggcggggcag cgcgggcctg gccaaaaaat gccccttctc gctggaactg 120gcggagggcg gcccggcggg cggcgcgctc tacgcgccca tcgcgcccgg cgccccaggt 180cccgcgcccc atgtgtcccc ggccgcgccc gccgcgcccc cagttgcttc cgaccttggc 240ccgcggccgc cggtgagcct agacccgcgc gtctccatat acagcacgcg ccgcccggtg 300ttggcgcgaa cccacgtcca gggccgcgtc tacaacttcc tcgagcgtcc caccggctgg 360aaatgcttcg tttaccactt cgccgtcttc ctcatcgtcc tggtctgcct catcttcagc 420gtgctgtcca ccatcgagca gtatgccgcc ctggccacgg ggactctctt ctggatggag 480atcgtgctgg tggtgttctt csggacggag tacgtggtcc gcctctggtc cgccggctgc 540cgcagcaagt acgtgggcct ctgggggcgg ctgcgctttg cccggaagcc catttccatc 600atcgacctca tcgtggtcgt ggcctccatg gtggtcctct gcgtgggctc caaggggcag 660gtgtttgcca cgtcggccat caggggcatc cgcttcctgc agatcctgag gatgctacac 720gtcgaccgcc agggaggcac ctggaggctc ctgggctccg tggtcttcat ccaccgccag 780gagctgataa ccaccctgta catcggcttc ctgggcctca tcttctcctc gtactttgtg 840tacctggctg agaaggacgc ggtgaacgag tcaggccgcg tggagttcgg cagctacgca 900gatgcgctgt ggtggggggt ggtcacagtc accaccatcg gctatgggga caaggtgccc 960cagacgtggg tcgggaagac catcgcctcc tgcttctctg tctttgccat ctccttcttt 1020gcgctcccag cggggattct tggctcgggg tttgccctga aggtgcagca gaagcagagg 1080cagaagcact tcaaccggca gatcccggcg gcagcctcac tcattcagac cgcatggagg 1140tgctatgctg ccgagaaccc cgactcctcc acctggaaga tctacatccg gaaggccccc 1200cggagccaca ctctgctgtc acccagcccc aaacccaaga agtctgtggt ggtaaagaaa 1260
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本发明公开了一个人类心房颤动致病基因及其编码蛋白。人类心房颤动致病基因是KCNQ1基因的一个变异体，突变位置发生在KCNQ1基因外显子1。此外，本发明还公开了该基因的核苷酸序列、编码蛋白以及其制备方法和用途。该发明特别涉及到转该人类心房颤动致病基因的细胞模型和动物模型的制备方法和用途。该发明还公开了人类心房颤动致病基因编码蛋白形成的功能增益的KCNQ1S140G－KCNE1(Iks)复合物。