专利名称：一种金属镉抗性相关蛋白DbsCPA2及其编码基因和应用的制作方法随着矿产资源的开发利用、工业发展，重金属对环境造成的污染日趋严重，土壤重金属污染已经成为一个危害全球环境质量的问题。土壤重金属会影响植物的生长发育，降低农作物的产量和质量，带来了严重的经济损失。此外，受土壤重金属污染的作物在植物体中积累，并通过食物链富集到人体和动物体中，危害人畜健康，引发癌症和其他疾病等。治理重金属污染刻不容缓，各种修复技术和措施正在研究和应用中。各国政府和科学家着力通过两个途径解决这一问题一为利用物理的，化学的方法试图清除土壤或水体的重金属污染二为利用现代生物技术清除污染。自从20世纪80年代以来，生物修复技术因其具有处理费用低、对环境影响小、效率高等优点，越来越受到广大科技人员的广泛关注。生物修复一般分为植物修复、动物修复和微生物修复三种类型，其中植物修复和微生物修复是研究的热点。微生物修复就是利用微生物将环境中的污染物降解或转化为其他无害物质的过程。近年来，基于微生物对重金属的作用机理，以修复有毒有害金属污染或回收有经济价值重金属为目的的生物处理技术日趋成熟。植物修复指利用植物去治理水体、土壤和底泥等介质中的污染的技术。然而用于重金属污染修复的生物往往会受到重金属的毒害，生长缓慢、生物量小，甚至不能生存，所以重金属对植物和微生物的毒害作用是生物修复的主要限制因素。解决生物修复中重金属对生物的毒害作用的根本途径在于研究耐受重金属的分子生物学机制，克隆对重金属耐受的关键基因，通过基因工程手段获得用于生物修复中性能优良的转基因工程生物。由于技术上的原因，直到最近，对微生物基因资源的利用主要局限于可培养微生物。然而，已培养微生物仅占自然界中微生物的不到1%，因此各种生境中的微生物宏基因组是一个巨大而未发掘的基因资源库。极端环境具有丰富的微生物资源，当中许多与逆境和关键生命过程相关的基因在长期的适应进化中获得了更强的耐性潜能，发掘这些抗性基因已成为国际重要的研究热点。酸性矿山废水(AMD)是极端生境微生物学研究的重要系统。 AMD来源于采矿活动使含硫矿物(主要为黄铁矿，FeS2)暴露于空气和水中，在微生物催化作用下迅速氧化产酸所致，其PH值一般在1- 4左右，而且富含硫酸盐以及I^b、Zn、Cu、Cd和 Ni等重金属，是采矿业面临的最严重环境问题之一。在AMD中生存的原核微生物在长期的进化过程中逐渐形成了一些独特机制，以应对低PH值、高盐度以及高重金属等多种极端环境协迫。因此，AMD生境成为极具特色和丰富的抗逆基因库。钾离子转运蛋白通过控制K+在细胞中的吸收和排出，从而调节细胞质pH和细胞膨压，对细胞的生长和生存起着重要的作用。钾离子转运蛋白有三种类型钾离子吸收转运蛋白(Trk)、钾离子通道(Kch)、钾离子外排转运蛋白(Kef)。目前研究的最清楚的是大肠杆菌的钾离子外排系统(Kef)。Kef是一个位于细胞膜内膜的K+/H+反向运输蛋白。Kef由一个N端疏水性跨膜结构域禾口一个C端亲水性KTN(potassium transport and NAD—binding domain)结构域组成。 Kef的活性由谷胱甘肽控制还原型谷胱甘肽抑制Kef的活性；谷胱甘肽加合物激活Kef蛋白。Kef在激活的状态把细胞内的K+排除细胞外，同时将细胞外的H+运输到细胞内，使细胞质酸化。大肠杆菌暴露在有毒的亲电试剂下，例如丙酮醛，Kef有利于提高大肠杆菌的的生存能力。当细胞受到亲电试剂的毒害时，细胞质中的谷胱甘肽与亲电试剂结合，形成谷胱甘肽加合物，谷胱甘肽加合物能够激活Kef，将K+从细胞质排出，同时H+运输到细胞内，使细胞质酸化。细胞质酸化能够抵抗有毒亲电试剂的进攻，同时防止DNA损伤。Roosild (2009)等人研究发现谷胱甘肽以及谷胱甘肽加合物通过与Kef的羧基端的KTN结构域结合，控制Kef的活性。因此，KTN结构域对于感知细胞内信号和调节跨膜结构域构象变化都十分重要。KTN结构域比较小，大约有140个氨基酸，靠近跨膜结构域位置的氨基酸也非常保守。这些充分说明了为什么KTN结构域在调节K+在细胞膜内外流动的重要性。然而，迄今为止Kef基因在微生物中对重金属镉抗性究竟起什么作用仍不清楚， 也没有从AMD微生物中克隆到Kef基因的报道。
本发明的目的在于针对现有技术中的上述不足，提供一种金属镉抗性相关(Kef) 蛋白，命名为DbsCPA2，编码该蛋白的基因序列，以及该蛋白和基因的应用。本发明通过以下技术方案实现上述几个目的一种金属镉抗性相关蛋白DbsCPA2，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。含有上述金属镉抗性相关蛋白DbsCPA2的生物制剂。该蛋白在治理环境镉污染中的应用。编码上述金属镉抗性相关蛋白DbsCPA2的核苷酸序列，如SEQ ID NO:2所示。上述金属镉抗性相关蛋白DbsCPA2的编码基因在治理环境镉污染中的应用，如可用于制备能够治理镉污染的转基因植物等。一种金属镉抗性相关蛋白DbsCPA2的表达载体，该载体含有上述金属镉抗性相关蛋白DbsCPA2的编码基因。所述表达载体优选的出发载体为pED8a，即载体pET28a中插入 DbsCPA2的编码基因的编码序列。一种基因工程菌，含有上述的表达载体，具体是由该表达载体转染大肠杆菌得到的。该基因工程菌在治理环境镉污染中的应用，如可以用于制备具有镉离子抗性的转基因植物或直接投放到环境镉污染中。尤其是对于镉离子浓度在200μΜ以下的环境治理效果最好。本发明具有以下有益效果本发明首次公开了一种新的金属镉抗性相关蛋白DbsCPA2及其编码基因，发现该蛋白对于(Γ200μΜ浓度的镉离子都具有良好的抗性，在提高微生物和植物对重金属镉的抗性方面有重大应用价值。图1为DbsCPA2在大肠杆菌中的表达时相，M为蛋白分子量标准，1为携带空载体 pET28a的BL21 (DE3)菌株的电泳结果，2、为携带pET28a- DbsCPA2的BL21 (DE3)菌株诱导表达(Γ7小时后的电泳结果。图2为表达DbsCPA2的大肠杆菌在不同镉浓度下培养12小时后的生长情况。图3为表达DbsCPA2的大肠杆菌在150μΜ镉胁迫下的生长曲线。

在广东云浮铅/锌矿选取不同酸化阶段(PH值为2，4，6)的酸性矿山废水(AMD)，使用 0. 22 Mm的滤膜收集20L AMD里面的细胞。为了保持核酸的完整性，保存样品冻于液氮中， 24小时内带回实验室，并放于-70°C冰箱长期保存。2.核酸的提取
DNA提取采用EST方法，过程如下向SET buffer中加入溶菌酶及蛋白酶K，消化30 min后，15，OOOrpm离心15 min后用氯仿抽提2次，用异丙醇沉淀过夜后，75 %乙醇清洗2 次，最后溶于灭菌水中。用Qiagen tip-100柱纯化回收基因组DNA，用核酸蛋白分析仪检测 DNA质量及浓度。3.基因组测序
用 Roche 公司的 GS FLX Titanium General Library Preparation Kit 制备上机样品。 使用Roche 454 Genome Seqencer FLX测序仪，通过进行测序，用PyrcAayer软件获取碱基序列。4.基因组序列分析
去除低质量的测序结果后，对基因组进行如下分析
序列拼接使用Euler-SR及454公司的GS De Novo Assembler Software进行序列拼接。用N50指数评价拼接的效果。基因组注释将拼接好的微生物的全基因组序列用IMG和SEED系统进行基因组的注释，发现新的基因。5. DbsCPA2基因片段的克隆
通过PCR方法，以从AMD中提取的DNA为模板，根据基因组测序并拼接得到的基因序列设计一对引物
DBS276-F: ATGGGCTATCCCATTCCCAAT (SEQ ID N0:3); DBS276-R: TCATGTGTCAAGTTCCTGTGG (SEQ ID NO:4)。PCR获得一条31Λ大小的条带，并克隆到PCR2. 1 (购自invitrogen公司)载体中， 得PCR2. 1- DbsCPA2载体，序列委托invitrogen公司测定。6. DbsCPA2基因序列分析
测序结果表明DbsCPA2基因大小为2019bp(SEQ ID N0:2)，编码672个氨基酸(SEQ IDNO: 1)。根据PSORT分析，DbsCPA2基因表达产物很可能是细胞膜蛋白。实施例2 DbsCPA2基因的功能分析
本实施例中利用大肠杆菌转化实验分析DbsCPA2基因的功能。1.构建重组表达载体
设计以下一对引物，在DbsCPA2基因5’引入酶切位点，3’引入损ol酶切位点。DbsCPA2 -F: 5，CGCGGATCCATGGACACGGTATGTTCAGAAGG3，(SEQ ID NO:5); DbsCPA2 -R 5， CCGCTCGAGTGATCCCTGCATCAACCATTGT3， (SEQ ID NO:6)。以PCR2. 1- DbsCPA2载体为模板进行PCR。分别将PCR产物和酵母穿梭表达载体 pET28a用及和损ο I进行酶切，将酶切产物回收、连接、并转化大肠杆菌DH5 α。经测序并酶切鉴定，得到了 pET28a- DbsCPA2重组子。(一)蛋白表达
将重组子pET28a- DbsCPA2转化大肠杆菌表达菌株BL21 (DE3)，通过PCR验证筛选阳性克隆。挑取含重组质粒的菌体单斑至10ml LB(含Kan 50 μ g/ml)中37°C过夜培养。将Iml 菌液加入到含100ml LB培养基(含Kan 50 μ g/ml)，37°C震荡培养至0D600约为0. 4 1· 0 (最好0.6，大约需》ir)。加入IPTG至终浓度为ImM进行诱导，每隔1小时收集Iml菌液，离心12000gX60s 收获沉淀，用80μ1 ddH20重悬，加入20μ 1 5XSDS-PAGE上样缓冲液，混勻，沸水浴 IOmin0取上清作为样品做SDS-PAGE分析(见附图1)。(二)转化子对重金属镉抗性的测定
挑取含重组质粒的菌体单斑至10ml LB(含Kan 50 μ g/ml)中37°C过夜培养。将100 μ 1 菌加入到 IOml Cd2+浓度分别为 0μΜ、50μΜ、100μΜ、150μΜ、200μΜ 的 LB培养基(含Kan 50 μ g/ ml、IPTG ImM)中，37°C、200rpm震荡培养12小时，分别测定0D600值。根据实验结果，选取Cd2+浓度为150μΜ作为胁迫条件，进行了生长曲线的测定。挑取含重组质粒的菌体单斑至10ml LB (含Kan 50 μ g/ml)中37°C过夜培养。将100μ1菌加入到 IOml Cd2+浓度为 150μΜ 的 LB 培养基(含 Kan 50 μ g/ml, IPTG ImM)中，37°C、200rpm 震荡培养，每隔2小时测定0D600值。实验结果表明，表达DbsCPA2基因的BL21 (DE3)在0 200μΜ Cd2+浓度下都可以正常生长，而空载体对照在Cd2+浓度超过150μΜ时便不能生长(见附图2)。在15(^MCd2+浓度下，表达DbsCPA2基因的BL21(DE3)在培养过程中都可以生长，而空载体对照的生长一直受到抑制(见附图3)。实验结果说明，DbsCPA2对重金属镉的防御起着重要作用。


本发明公开了一种金属镉抗性相关蛋白DbsCPA2及其编码基因和应用。该金属镉抗性相关蛋白DbsCPA2氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，其编码基因如SEQIDNO:2所示。通过转化大肠杆菌实验证明该基因在大肠杆菌中的表达可以提高其对重金属镉的抗性。本发明的DbsCPA2编码基因可用于提高微生物和植物对重金属镉的抗性，进一步用于清除环境重金属污染，为生物修复提供性能优良的生物资源。