专利名称：一种禾本科植物过敏原的dna序列和重组生产的方法图1)的核酸序列组成，编码一种过敏原。禾本科的花粉粒，例如特别是梯牧草、黑麦草、鸭茅(Dactylis glomerata)、草地早熟禾(Poa pratensis)、狗牙草(Cynodon dactylon)、绒毛草(Holcus lanatus)的花粉粒用作天然的原材料。分离和纯化所述的天然过敏原后，进行N末端的蛋白测序。依据从蛋白推导的核酸序列，产生引物。用该引物，通过PCR、克隆并确定特性，从花粉的cDNA库中获得相应的cDNA。根据本发明，从编码过敏原的该DNA分子中产生片段和部分序列。通过合适的表达载体，在细胞体系中表达该重组DNA分子或其片段和部分序列后，纯化该过敏原或其低变应原性的变体或片段。用二步方法，从梯牧草花粉中纯化天然过敏原。将花粉经水相提取后，通过疏水相互作用层析法，把得到的提取物分为2个级分，过层析柱的级分和洗脱液。过层析柱的级分含有3个过敏原，Phl p1(30-35kDa)，Phl p2/3(11-14 kDa)和一种未知的过敏原(55-60 kDa)。这些蛋白可从另一种用Superdex 75的凝胶过滤法中分离出来。至此，该未知过敏原(工作名为p55)通过SDS-PAGE法分离出来，接着印迹到PVDF膜上，分离得到精制的级分。经Edman降解法测定该p55分子的N末端的氨基酸序列。为了产生和克隆p55相对应的cDNA，按照本发明构建了一条基于该N末端序列(图3)的特异DNA引物(21mer)。第2条所用的引物是一种锚定序列，该序列定位在用于反转录寡-dT引物中。用来自梯牧草花粉的代表性mRNA群体产生的cDNA和按照本发明的引物以及所述的锚定引物，在严格条件下进行PCR反应。在PCR反应物的分析性凝胶电泳中，鉴别出了一条大小为1.65kb的扩增DNA。把该扩增的DNA连接到pCR2.1载体中，并成功地转化。对2个不同克隆插入片段的测序得到一致的序列。在这种初始扩增的DNA中，鉴别出了1个1492bp的可读框(ORF)(见图1)。为了从所述的核酸中产生相应的重组蛋白(图4)，首先用限制性内切酶把pCR2.1载体重新克隆到表达载体pProEx Htb中。该表达产物表达并经生化纯化后，对该产生的具有过敏原性质的蛋白进行了多种分析。在所有的分析中，例如蛋白印迹法和点印迹法，重组蛋白与来自被诊断为草类花粉变态反应临床症状的病人的IgE特异地反应。所用的对照蛋白是天然的p55。因此，该重组蛋白显然是一种过敏原。这样，本表达产物被用于对草类花粉变态反应患者的高度特异改进的诊断方法中。
为了产生低变应原性变体以改进治疗用途，按照本发明从克隆到表达载体中的核酸开发了确定片段和部分序列的组合。此外，导入了特异定点突变，优选地在编码半胱氨酸的三联体中导入。因此，本发明的这部分内容与开发用于诊断目的的本发明内容不同点，在于降低或缺乏IgE反应性。这样，由于减低(lacuna)而明显低或没有副作用的制备物，可用于脱敏治疗。如果编码低变应原性蛋白变体的核酸或编码p55的未修饰核酸与一种人表达载体相连接，这些构建体同样能用作特异免疫治疗的制备物。
因此，本发明的内容是a)一种重组DNA分子，该DNA分子含有一种编码作为过敏原的多肽的核苷酸序列，优选地由禾本科(Gramineae)(禾本科(Poaceae))和单子叶植物表达；b)一种所示的具有来源于梯牧草核苷酸序列的DNA分子；c)一种如图1所示的DNA分子的核苷酸序列；d)一种含有如下核苷酸序列的DNA分子，所述的核苷酸序列能与上面提到的图1中描述的核苷酸序列杂交；e)按照c)或d)项所述的核苷酸序列的部分序列和部分序列的组合；f)一种含有如a)-d)所述的核苷酸序列的DNA分子，该DNA分子可通过单个密码子的特异突变和消除或添加而修饰；g)一种按照c)所述的核苷酸序列，该核苷酸序列编码一种免疫调节T细胞反应片段；h)一种按照d)所述的核苷酸序列，该核苷酸序列编码一种免疫调节T细胞反应片段；i)一种按照e)所述的核苷酸序列，该核苷酸序列编码一种免疫调节T细胞反应片段；j)一种按照f)所述的核苷酸序列，该核苷酸序列编码一种免疫调节T细胞反应片段；k)一种重组DNA表达载体或克隆体系，该载体或体系包括在a)-d)中描述重组DNA分子，它与一种表达控制序列有功能地相连接；1)一种由按照c)所述的核酸编码的多肽；m)一种由按照d)所述的核酸编码的多肽；n)一种由按照e)所述的核酸编码的多肽；o)一种由按照f)所述的核酸编码的多肽；p)一种由按照g)所述的核酸编码的多肽；q)一种由按照h)所述的核酸编码的多肽；r)一种由按照i)所述的核酸编码的多肽；s)一种由按照j)所述的核酸编码的多肽；t)一种生产多肽、片段或其衍生物的方法，该方法培养已被权利要求11的表达载体转化的单核或真核细胞，然后从培养物中分离相应的蛋白或多肽；u)一种应用按照1)-n)所述的多肽，体内或体外诊断花粉变态反应的方法；v)一种药学制备物，该制备物包括按照1)-n)所述的多肽、片段或衍生物，用于治疗患花粉变态反应的人类或动物；w)一种使用v)中描述的药学制备物，治疗患花粉变态反应的人类或动物的方法；x)一种通过使用k)中描述的构建体DNA免疫接种，治疗花粉变态反应的方法；y)一种通过使用k)中描述的含有免疫刺激DNA片段的构建体DNA免疫接种，治疗花粉变态反应的方法。因此，本发明作为病人特异的分辨过敏原组分敏感谱的鉴别部分，用于改进体外诊断方法。同样地，本发明也用于生产免疫治疗草类花粉过敏原患者而明显改进的的制备物。
序列表<110>Merck Patent GmbH<120>DNA-Sequenz und rekombinante Herstellung einesGraminaen-Allergens<130>DNA-Sequenz<140><l41><160>4<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1187<212>DNA<213>禾本科<214><400>1gggaagaagg aggagaagaa ggaggagaag aaggagagtg gagatgctgc gtccggggcc 60gacggaacct acgacatcac caagctcggc gccaaacccg acggcaagac ggactgcacc 120aaggaggtgg aggaggcatg ggcttcggct tgcggtggta ccgggaagaa tacgatcgtc 180atccccaagg gtgatttcct gaccgggcct ctgaatttca ccgggccatg caagggcgac 240agcgtcacca tcaagctgga cggcaacctg ctgagctcca acgacctggc caagtacaag 300gctaactgga tcgagatcat gcggatcaag aaactcacta tcaccggcaa aggcacgctc 360gacggccaag gcaaggccgt gtggggcaag aacagctgcg ccaagaacta caactgcaag 420atcttgccaa acacattggt gctggacttc tgtgacgacg ctctcatcga aggcatcacc 480ctcctaaacg ccaagttctt ccatatgaac atctacgagt gcaagggcgt gaccgtcaag 540gacgtgacca tcaccgcgcc cggggacagc cccaacaccg acggcatcca catcggcgac 600tcgtccaagg tcaccatcac cgacaccacc atcggcaccg gcgacgactg catctccatc 660ggccccggaa gcaccggcct caacatcacc ggcgtgacct gcggtccagg ccacggcatc 720agcgttggca gcctgggacg gtacaaggac gagaaggacg tgaccgacat caccgtaaag 780aactgcgtgc tcaagaagtc caccaacggc ctccggatca agtcgtacga ggacgccaag 840tcgccgctga cggcgtcgaa gctgacctac gagaacgtga agatggagga cgtgggctac 900cccatcatca tcgaccagaa gtactgcccc aacaagatct gcacctccaa gggagactcc 960gccagggtca ccgtcaagga cgtcaccttc cgcaacatca ccggcacctc ctccaccccc 1020gaggccgtca gcctgctctg ctccgacaag cagccctgca atggtgtcac catgaacgac 1080gtcaagatcg agtacagcgg caccaacaac aagaccatgg ctgtctgcac caacgccaag 1140gtcaccgcca agggtgtcag cgaggctaac acctgcgccg cctgatg 1187<210>2<211>20<212>PRT<2l3>Künstliche Sequenz<214>人工序列<220><223>人工序列描述p55特异性引物<400>2Gly Lys Lys Glu Glu Lys Lys Asp Glu Lys Lys Glu Ser Gly Asp Ala1 5 10 15Ala Ser Xaa Ala20<210>3<211>26<212>DNA<213>Künstliche Sequenz<214>人工序列<220><223>人工序列描述p55特异性引物<220><221>变体<222>(3)<223>n＝次黄嘌呤核苷<220><221>变体<222>(6)<223>n＝次黄嘌呤核苷<220><221>变体<222>(9)<223>n＝次黄嘌呤核苷<220><221>变体<222>(12)<223>n＝次黄嘌呤核苷<220><221>变体<222>(15)<223>n＝次黄嘌呤核苷<220><221>变体<222>(18)<223>n＝次黄嘌呤核苷<220><221>变体<222>(21)<223>n＝次黄嘌呤核苷<220><221>变体<222>(24)<223>n＝次黄嘌呤核苷<400>3ggnaanaang anganaanaa nganga 26<210>4<211>394<212>PRT<213>禾本科<400>4Gly Lys Lys Glu Glu Lys Lys Glu Glu Lys Lys Glu Set Gly Asp Ala1 5 10 15Ala Ser Gly Ala Asp Gly Thr Tyr Asp Ile Thr Lys Leu Gly Ala Lys20 25 30Pro Asp Gly Lys Thr Asp Cys Thr Lys Glu Val Glu Glu Ala Trp Ala35 40 45Ser Ala Cys Gly Gly Thr Gly Lys Asn Thr Ile Val Ile Pro Lys Gly50 55 60Asp Phe Leu Thr Gly Pro Leu Asn Phe Thr Gly Pro Cys Lys Gly Asp65 70 75 80Ser Val Thr Ile Lys Leu Asp Gly Asn Leu Leu Ser Ser Asn Asp Leu85 90 95Ala Lys Tyr Lys Ala Asn Trp Ile Glu Ile Met Arg Ile Lys Lys Leu100 105 110Thr Ile Thr Gly Lys Gly Thr Leu Asp Gly Gln Gly Lys Ala Val Trp115 120 125Gly Lys Asn Ser Cys Ala Lys Asn Tyr Asn Cys Lys Ile Leu Pro Asn130 135 140Thr Leu Val Leu Asp Phe Cys Asp Asp Ala Leu Ile Glu Gly Ile Thr145 150 155 160Leu Leu Asn Ala Lys Phe Phe His Met Asn Ile Tyr Glu Cys Lys Gly165 170 175Val Thr Val Lys Asp Val Thr Ile Thr Ala Pro Gly Asp Ser Pro Asn180 185 190Thr Asp Gly Ile His Ile Gly Asp Ser Ser Lys Val Thr Ile Thr Asp195 200 205Thr Thr Ile Gly Thr Gly Asp Asp Cys Ile Ser Ile Gly Pro Gly Ser210 215 220Thr Gly Leu Asn Ile Thr Gly Gly Ala Cys Gly Pro Gly His Gly Ile225 230 235 240Ser Val Gly Ser Leu Gly Arg Tyr Lys Asp Glu Lys Asp Val Thr Asp245 250 255Ile Thr Val Lys Asn Cys Val Leu Lys Lys Ser Thr Asn Gly Leu Arg260 265 270Ile Lys Ser Tyr Glu Asp Ala Lys Ser Pro Leu Thr Ala Ser Lys Leu275 280 285Thr Tyr Glu Asn Val Lys Met Glu Asp Val Gly Tyr Pro Ile Ile Ile290 295 300Asp Gln Lys Tyr Cys Pro Asn Lys Ile Cys Thr Ser Lys Gly Asp Ser305 310 315 320Ala Arg Val Thr Val Lys Asp Val Thr Phe Arg Asn Ile Thr Gly Thr325 330 335Ser Ser Thr Pro Glu Ala Val Ser Leu Leu Cys Ser Asp Lys Gln Pro340 345 350Cys Asn Gly Val Thr Met Asn Asp Val Lys Ile Glu Tyr Ser Gly Thr355 360 365Asn Asn Lys Thr Met Ala Val Cys Thr Asn Ala Lys Val Thr Ala Lys370 375 380Gly Val Ser Glu Ala Asn Thr Cys Ala Ala385 390


本发明描述鉴别和确定一种草类过敏原的特点,以及描述编码该过敏原的重组DNA分子和相应的DNA和肽序列。