一类set蛋白小分子抑制剂及其用途[0002]随着人类生活水平的提高及医疗条件的改善，全球人均寿命有了很大的提高。但由于环境污染，不良生活、饮食习惯的盛行以及人口老龄化等因素的影响，癌症、老年痴呆症等疾病的发病率呈逐年攀升的趋势。世界卫生组织报告显示，2008年全世界约有1270万新增癌症患者，760万死于癌症(约占所有死亡人数的13%)。据推测到2020年前，全球每年将新增1500万癌症患者，到2030年癌症的死亡人数可能会增至1310万。癌症己成为仅次于心血管疾病的第二大死因。目前治疗癌症的化学治疗药物主要是烷化剂，顺钼，甲氨蝶呤，5-氟尿嘧啶，吉西他滨，奥沙利钼等细胞毒性药物，这些抗肿瘤药物都是非特异性的抑制细胞生长并引起细胞死亡，在杀死肿瘤细胞的同时，对人体正常细胞，骨髓、消化道、肝、肾等正常组织也带来损害，副作用明显，治疗效果有限。近几年来，随着分子肿瘤学、分子药理学等交叉学科的发展，使人类对肿瘤的认识逐渐深入。抗肿瘤药物的研究已从传统的细胞毒性药物，转向针对不同肿瘤以及同一肿瘤的不同亚型的发生发展过程中的某一重要靶标(往往是某种蛋白激酶)的分子靶向抗肿瘤药物。肿瘤治疗已经进入了靶向治疗及个体化治疗新阶段。肿瘤分子靶向治疗已凭其特异性、针对性强，患者耐受性较好，效果明显，毒副反应相对较低等优点，在肿瘤治疗领域取得了巨大成功，逐步成为国内外肿瘤治疗领域的新趋势。目前已上市的分子靶向抗肿瘤药物主要包括小分子蛋白激酶抑制剂和单克隆抗体两类。并且都取得了骄人战绩，为研发企业创造了巨大经济利益，其中伊马替尼，利妥昔单抗，贝伐单抗，曲妥珠单抗等已成为全球年销售额大于10亿美元的“重磅炸弹”。蛋白激酶是目前肿瘤靶向治疗中一类重要的作用靶点。从它们磷酸化的位点来区分，它们可以分为酪氨酸，丝、苏氨酸蛋白激酶两类，它们分别能使蛋白质中的酪氨酸，丝、苏氨酸上的羟基磷酸化。蛋白激酶在细胞的生长过程中扮演着非常重要的作用，特别是参与细胞信号的传递。很多疾病中蛋白激酶的活性异常升高。与蛋白激酶相对应的是蛋白磷酸酶。蛋白磷酸酶也分为酪氨酸，丝、苏氨酸蛋白磷酸酶。它们能使相应底物(蛋白激酶)的酪氨酸，丝、苏氨酸位点脱磷酸化而失活。可以说蛋白激酶/蛋白磷酸酶活性的平衡对保持细胞功能的正常至关重要。很多疾病包括癌症，炎症，神经退化性疾病，蛋白激酶活性异常升高或者蛋白磷酸酶活性异常偏低。蛋白激酶/蛋白磷酸酶可以作为疾病治疗的重要靶点。目前已上市的靶向治疗药物主要的靶点就是蛋白激酶。虽然针对蛋白激酶的药物容易因为蛋白激酶的突变而耐药，但目前仍是治疗各种恶性疾病的一线靶向药物。中国发明专利(专利号01138070.5)公开了一类2-苯氧基嘧啶衍生物，该类化合物就是一类蛋白激酶的抑制剂，可以通过抑制蛋白激酶特别是酪氨酸蛋白激酶治疗相关的各类疾病。该专利公开了十七种化合物对Abl蛋白激酶的抑制效果，半数抑制浓度(IC50)在0.025-2.0 μ M0虽然上述发明中的化合物对酪氨酸蛋白激酶有着明显的抑制作用，但在该专利文献中，这些化合物抑制肿瘤细胞的增殖活性尚未验证，实际用途未知。本专利申请发明人在此后进行的测试肿瘤细胞增殖活性实验中发现它们并没有显示出较强的抑制效果。为改进上述发明，本专利申请发明人对2-苯氧基嘧啶衍生物进行了结构改造，获得了一种苯氧基嘧啶衍生物并申请了中国发明专利(申请号200810244308.5)。发现该类化合物对不同的肿瘤细胞有较强的抑制作用，活性明显优于专利号为01138070.5的中国专利所公开的2-苯氧基嘧啶衍生物。进一步的体外激酶实验发现苯氧基嘧啶衍生物对64种不同的蛋白激酶的抑制作用很弱，反而不如2-苯氧基嘧啶衍生物。说明其抑制肿瘤细胞的作用靶点可能不是蛋白激酶而是其它靶点。为了阐明苯氧基嘧啶类化合物治疗相关疾病的作用机制，需要找到它作用的直接靶标。目前寻找药物作用靶标的方法很多，包括计算机虚拟筛选，基因芯片，蛋白质芯片，蛋白质二维电泳，噬菌体展示技术，酵母双杂交，定量蛋白组学和化学蛋白组学(亲和色谱等)等。其中亲和色谱是一种低成本且有效的方法。目前已成功运用于FK506，环孢菌素，腺华素，秋水仙碱等药物靶标的识别。常见的亲和色谱法有固相洗脱法和药物竞争法。固相洗脱法容易受到“亲和柱-靶蛋白”复合体解离速度的影响，而且还须制备无活性结构类似物的对照柱。药物竞争法存在对药物溶解性要求高等缺点。系列亲和色谱法是新发明的一种能克服以上两种亲和色谱法缺点的亲和色谱法，具有实用性强，结果可靠等优点。基于以上认识，本发明决定采用系列亲和色谱法识别苯氧基嘧啶类化合物直接作用的靶标并进行靶标确证。寻找新的药物作用靶标，为相关疾病的治疗提供新的治疗方案。
[0005]本发明具体技术方案如下: 苯氧基嘧啶类化合物作为SET蛋白抑制剂在制备与SET蛋白表达异常相关疾病药物中的应用。通过苯氧基嘧啶类化合物抑制SET蛋白与PP2A之间的相互作用，提高细胞中PP2A的活性，降低与PP2A相互作用的蛋白激酶的磷酸化水平，促进细胞凋亡，改变细胞周期而发挥相应的生物学作用。[0006]上述方案中所述的苯氧基嘧啶衍生物作用靶标为SET蛋白，又名模板活化因子-1 (emplate activating factor, TAF-1)、蛋白憐酸酶 2A 抑制剂-2 (inhibitor ofprotein phosphatase2A-2，I2PP2A)、组织相容性白细胞抗原II相关蛋白(PHAP II)、粒酶A 激活的 DNA 酶活化抑制剂(inhibitor of GzmA Activated Dnase, IGAAD)等，是由 SET基因编码的蛋白，包括两种主要剪切体:TAF-α和SET/TAF-β。SET/TAF-β亚型发挥着SET蛋白的主要生物学作用。SET蛋白是一种多功能蛋白，其功能涉及到DNA复制、核小体装配、染色体解聚、细胞凋亡、抑制细胞蛋白磷酸酶2A活性等多个生物学过程，是细胞生理活动的重要调节因子。在一些消化系统和血液系统肿瘤、生殖系统、神经系统的疾病中伴有SET表达或亚细胞定位异常。比如在子宫、胃、结肠、直肠肿瘤组织中SET/TAF-β表达是相应正常组织的2倍或更高。在慢性髓性细胞白血病、急性髓性细胞白血病、B细胞非霍奇金淋巴瘤等白血病中都存在SET复合体蛋白表达量异常升高的现象。并且其表达量与肿瘤的恶性程度高度相关。在正常神经元细胞中SET蛋白主要亚定位于细胞核，而在阿尔茨海默症病人大脑，SET蛋白在细胞浆增多，使细胞中蛋白磷酸酶2A活性偏低导致tau蛋白的过度磷酸化，造成淀粉样蛋白(APP)在脑部的沉积。SET蛋白表达异常造成肿瘤的一个重要原因与它抑制细胞中蛋白磷酸酶2A (PP2A)的活性密切相关。PP2A是细胞中一个重要的丝、苏氨酸磷酸酶，可以通过调节底物蛋白激酶的活性来调节细胞多种生物学进程，包括细胞增殖、分化、凋亡和迁移。目前普遍认为PP2A是一个重要的抑癌因子。PP2A与相应蛋白激酶活性的平衡对维持细胞内环境的稳定至关重要。PP2A活性的丧失或者抑制会造成相应蛋白激酶的活性异常升高而导致肿瘤的发生。PP2A是一个异质三联体，包括两个常见组分，一个催化亚基(PP2A-C)和一个支架亚基(PP2A-A)组成催化中心二聚体，同时连接着一个由四种不同家族基因编码的调节B亚基。SET蛋白能够和PP2A-C结合，从而抑制PP2A磷酸酶活力。许多肿瘤细胞中SET蛋白往往过量表达，造成PP2A活性偏低，致使癌症相关的蛋白激酶处于持续激活状态从而引起细胞癌变。在本专利的技术背景中已经提到，蛋白激酶抑制剂虽然具有治疗效果好，毒副作用低的优点，但也存在因蛋白激酶突变而耐药的缺点。比如慢性粒细胞白血病(CML)是一种由费城染色体bcr-abl融合基因表达的大小为210KD的蛋白激酶BCR-ABLl导致的恶性肿瘤。BCR-ABLl蛋白能自磷酸化为P-BCR-ABL1，进而激活信号通路下游的蛋白激酶，导致白细胞数量大量增加，从而造成慢性粒细胞白血病。由于BCR-ABLl是造成CML的“元凶”，为了治疗CML，各国科学家为研发出针对BCR-ABLl的蛋白激酶抑制剂进了不懈努力，2001年世界上第一个BCR-ABLl蛋白激酶抑制剂Imatinib (伊马替尼)正式上市，Imatinib为CML的治疗做出了重要贡献。但在其临床使用过程中，耐药、停药后复发等诸多问题也逐渐显现。BCR-ABLl激酶点突变是导致Imatinib耐药最常见的原因，这些激酶氨基酸点突变导致BCR-ABLl蛋白激酶域内的氨基酸替换，破坏Imatinib和BCR-ABLl蛋白的结合，直接或间接的造成Imatinib耐药。为克服Imatinib耐药，Dasatinib, Nilotinib等第二代BCR-ABLl蛋白激酶抑制剂相继上市，它们能治疗除T315I突变以外的几乎所有激酶突变导致的耐药CML。2012年，唯一能治疗T315I突变耐药CML的抑制剂Ponatinb也终于上市，但是，对于一些混合突变比如E255V/T315I双突变，Ponatinb仍无能为力。有文献报道包括CML在内的很多肿瘤细 胞中蛋白磷酸酶2A (PP2A)的活性较正常细胞明显偏低，而且其活性偏低与其内源性抑制剂SET(I2PP2A)蛋白表达量异常增高有关。抑制PP2A磷酸酶活力。CML细胞中SET蛋白往往过量表达，造成PP2A活性偏低，BCR-ABLl等蛋白激酶处于持续激活状态。采用PP2A激活剂(例如，Forskolin, FTY720, Ceramide)可以通过提高PP2A活性来使p-BCR-ABLl去磷酸化来治疗包括耐药CML在内的各种肿瘤疾病。说明影响SET/PP2A通路可以作为一个有效的克服因蛋白激酶突变导致耐药的疾病的靶点。目前已有的PP2A激活剂的作用机制都是通过直接与PP2A相互作用进而提高细胞中PP2A的活性。而针对SET的小分子抑制剂尚未见报道。本发明为了找到苯氧基嘧啶衍生物作用的靶标，构建了苯氧基嘧啶衍生物-TGI1002(N-[4-甲基-3-[4-(3-吡啶基)_2_嘧啶氧基]-苯基]-3-(4-甲基哌嗪甲基)_苯酰胺)的小分子探针，并采用系列亲和色谱法从慢性粒细胞白血病K562细胞裂解液中“垂钓”出了与TGI1002具有亲和作用的蛋白质。通过SDS-PAGE分离、切胶酶解、MALD1-T0F-肽指纹质谱鉴定为SET蛋白。并通过PP2A活性测定，免疫共沉淀，免疫荧光，RNAi等方法确证了苯氧基嘧啶衍生物-TGI1002是通过干扰SET/PP2A之间的相互作用，提高细胞中PP2A的活性，改变细胞周期，促进细胞凋亡来治疗与SET蛋白表达异常特别是因蛋白激酶突变导致的耐药的相关疾病。[0007]方案中所述的SET蛋白表达异常相关的疾病主要包括但不限于:炎症，神经退化性疾病、恶性肿瘤及自身免疫性疾病等。所述的炎症包括但不限于中枢神经系统(CNS)炎症，肠炎，关节炎等；神经退化疾病包括但不限于老年痴呆，阿尔兹海默症和其他大脑神经紊乱性疾病；恶性肿瘤包括但不限于白血病，肝癌，结肠癌，前列腺癌，乳腺癌，肺癌，骨肉瘤，绒毛膜癌，肾母细胞瘤等；自身免疫性疾病包括但不限于系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、自身免疫性溶血性贫血、慢性淋巴性甲状腺炎、甲状腺功能亢进、胰岛素依赖型糖尿病、重症肌无力、慢性溃疡性结肠炎、恶性贫血伴慢性萎缩性胃炎、肺出血肾炎综合征、原发性胆汁性肝硬变、多发性脑脊髓硬化症、急性特发性多神经炎等。[0008]上述SET蛋白表达异常相关的疾病优选慢性髓性白血病(CML)，慢性淋巴细胞性白血病急性髓细胞性白血病(CLL)，急性淋巴细胞性白血病(ALL)或者B细胞非霍奇金性淋巴瘤。[0009]上述慢性髓性白血病病包括但不限BCR-ABL阳性慢性髓性白血病。
[0010]上述BCR-ABL阳性慢性髓性白血病包括但不限于伊马替尼耐药慢性髓性白血病。
[0011]上述伊马替尼耐药慢性髓性白血病包括但不限于由BCR-ABL激酶域T315I突变导致的伊马替尼耐药慢性髓性白血病。
[0012]根据以上
【发明内容】
，只要具有如下通式苯氧基嘧啶母核的化合物均能通过本发明所述机制(即:结合SET蛋白，解离其与PP2A的相互作用，提高PP2A活性)发挥各种生物学功能，