专利名称：癌症转移变前期WWP2的mRNA水平原位杂交检测试剂盒及检测方法和应用的制作方法根据国内外权威机构提供的资料，我国每年癌症的新增人数260万，死亡人数近210万，患者700多万，全球每年新增癌症患者800万，死亡人数接近800万，患者约有8400多万人，到2020年以上人数将翻一番，这是一组可怕的数字。癌症诊治成本越来越高，按癌症患者的年治疗费用20万(贫穷地区可能偏高，发达地区可能远远高出20万)，700多万患者，每年的花费是I. 4万亿人民币，扣除成本35%约4千亿，每年约有I万亿人民币白白消耗了。而且，癌症患者大部分会在治疗后不久死亡。因此，现有的临床癌症诊治模式一定要改变，本发明的创新点是提前做到预防性筛查，然后及时介入预防性调控和预防性治疗，做到基因水平癌症的治未病。2005年美国卫生研究院、癌症研究院、疾控中心等八家单位做了一个年度报告，对1972年发起的抗癌大战进行回顾，报告认为人类在抗癌大战中是失败，结论是癌症死亡率没有降低，其列举出造成抗癌大战失败的几个因素是1.肿瘤细胞异质性(多态性);2.肿瘤细胞耐药性；3.抗癌药物设计思路不完善(动物模型设计不科学)等。同时，该报告中亦提出应重新审视现有诊治癌症的措施。本发明人在长期研究中发现，导致癌症死亡率不降的重要原因是不能做到真正的早期诊断。依照现有的临床医学影像(B超、CT、核磁共振成像等)及和其它生化(癌抗原、癌胚抗原、糖类激素、细胞膜因子、细胞核因子、细胞流式技术)指标来诊断癌症，都是肿瘤形成后诊断，前者要有组织学变化或已有占位性病变，后者大部分是肿瘤形成后所分泌、释放、或肿瘤的标记物。传统临床观念认为占位性癌块在2公分下是属于早期癌症的诊断，这一概念值得认真讨论，2公分以下癌块属早期这一界定科学性是不够严谨的，从细胞学角度来分析，I公分的肿块约有一亿个肿瘤细胞，2公分的肿块其三维空间的细胞叠加数远不止2亿个肿瘤细胞，从癌变前期到单克隆癌细胞产生及形成2公分的癌块，其病理演变过程相当长，可能是5年或10年、甚至是10年以上(特殊病例除外)，很难证实的是在这个病理演变过程中，肿块是癌症唯一的发生地和单独的病灶，可能癌细胞早已迁移到其它组织或器官生长。临床研究早已证实，一旦形成肿块的同时，其它癌细胞通过不同途径迁移到其它部位克隆生长，一旦切除原发灶后，其它器官复发灶或多发癌块灶先后形成。因此，在临床上以2公分以下的癌肿块大小来界定早期与否，不够严谨(有些病例，在发现原发病灶时，同时发现转移病灶，不在我们表述的内容中)，其实这时已经是晚期诊断和晚期治疗，这是导致癌症死亡率不降的真正原因。随着分子生物技术日益完善，功能基因组学，癌症基因组学等研究的深入展开，为了寻求更早期的诊断癌症、治疗癌症、以及预防癌症，已取得长足进步。至今，我们已有可能在基因的一级转录功能产物(mRNA水平)上做更精确的早期筛查和诊断，在癌变前期或癌细胞形成(单克隆)前，就可以做到早期预测和筛查。本发明采用核酸原位杂交技术，选择多组临床标本(癌症病人、高危人群、正常对照)，对WWP2基因与癌症转移的早期预警进行检测分析。英国科学家表示，他们已经在肿瘤是如何在体内扩散的问题上取得新突破。他们发现一种流氓基因，只要利用对症药物减弱该基因的活性，就能有效阻止肿瘤扩散。这种基因被称作WWP2，它主要攻击和分解体内的一种可阻止肿瘤细胞扩散的天然抑制剂。研究发现，阻止WWP2基因起作用，可有效提高这种天然抑制剂的水平，肿瘤细胞会在这种抑制剂的作用下进入休眠状态。如果能研发出可使WWP2失去作用的药物，治疗肿瘤将不再需要常规疗法和手术，这会大大降低肿瘤患者的风险。研究者表示，这一发现将促使科学家在未来10年研发出新一代药物，可以有效阻止大部分类型的肿瘤扩散，其中有乳腺癌、脑癌、结肠癌和皮肤癌。他说“肿瘤晚期涉及到癌细胞转移，这是肿瘤发展的重要阶段，目前还无法治疗或阻止该过程。现在面临的一大挑战是确定一种可进入肿瘤细胞，摧毁流氓基因的活性 的有效药物。研究人员报告说，一般情况下，人体某处组织发生癌变后，人体内会产生一种抑制蛋白，阻止癌细胞扩散。研究人员发现，癌细胞中存在一种名为WWP2的基因。这种基因会攻击并破坏这种抑制蛋白，使癌细胞能够扩散到人体其他部位。研究人员设法限制WWP2基因活动，随后发现抑制蛋白水平大幅上升，而癌细胞没有出现扩散。研究人员称他们证实一个过去较少研究的蛋白WWP2可通过与肿瘤抑制蛋白PTEN结合，使其连接上泛素标记，从而促进蛋白酶体降解PTEN蛋白。PTEN基因(磷酸酶基因)是继p53基因后另一个较为广泛地与肿瘤发生关系密切的抑癌基因。PTEN在细胞周期调控及细胞快速生长抑制中起着重要的作用。大量的研究表明在多种类型的癌症中存在PTEN基因突变或缺失。PTEN蛋白的异常表达与癌细胞的生长、凋亡、粘附、迁移、浸润等过程密切相关。科学家们一直在致力寻找PTEN的调控因子。当发现WWP2蛋白与NEDD4-1蛋白(一直被科学家视为PTEN功能的重要调控因子)非常相似时，这引起了研究人员的高度注意。WWP2是NEDD4样蛋白家族中的一种E3泛素连接酶。它可将泛素连接到靶蛋白上，促使蛋白酶体降解靶蛋白。NEDD4样蛋白在调控基因转录、胚胎干细胞、细胞转运及T细胞活化中起着重要的调控作用。在小鼠中敲除NEDD4-1基因时，并没有观察到PTEN蛋白水平发生明显的改变。这些结果表明有可能还存在其它的PTEN的调控因子，由于WWP2是NEDD4样蛋白家族成员，有可能是PTEN的真正调控因子，在进一步的研究中，研究人员尝试在癌细胞中敲除了 WWP2，发现PTEN蛋白的水平相应显著增高。而当WWP2过表达时PTEN水平则显著降低。这些结果表明WWP2有可能参与了对PTEN稳定性的调控。” 此外，获得的研究数据还表明WWP2可能是一个潜在的致癌基因，参与推动了肿瘤的形成和生长。在一项实验中，研究人员发现在注入前列腺癌细胞9周后，正常表达WWP2的小鼠生成的肿瘤大小比WWP2沉默小鼠的肿瘤体积要大出三倍多。本发明利用WWP2基因在癌症发生、转移病理演变过程中表达变化，将它作于临床早期癌症转移的筛查指标，并采用核酸原位杂交和组化免疫方法，开发出用于癌症早期筛查的试剂盒。目前对WWP2基因的研究都采用高通量基因芯片技术，而这些方法多用于科研方面，不适应临床应用，特别是个性化的应用在我国现阶段条件尚不成熟。根据现有的文献资料WWP2基因mRNA水平的检测技术及试剂盒未见报道。本发明人在针对创新性发明的要求，设计了不同数据例组(癌症转移患者、高危人群、正常对照人)例组，用原位杂交技术进行检测，结果表明以上癌症转移症病人WWP2基因高表达，高危人群有不同程度表达15-25%，正常人都是低表达。表明WWP2基因癌症转移变前期筛查的重要标志物。原位杂交技术(in situ hybridization)是将分子生物学与细胞化学技术结合起来，以标记的核酸分子为探针，在组织细胞原位检测特异性核酸分子的技术。其原理是使含有特异序列、经过标记的核酸单链(即探针)，在适宜条件下与组织细胞中的互补核酸单链即靶核酸发生杂交，再以放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行探测，从而在细胞原位显示特异的DNA或RNA分子。 原位杂交的探针是已知序列的分子或序列未知但分子已知的核酸分子(虽不明确该分子全部序列，但已知其针对何靶分子)，探针的种类按核酸性质不同又可分为DNA探针、cDNA探针、cRNA探针和合成寡核苷酸探针。为了便于示踪，探针必须用一定的手段加以标记，以利于以后的检测。常用的标记物包括放射性核素和非放射性标记物两大类。常用的同位素标记物有3H、35S、125I和32P。同位素标记物虽然有灵敏性高、背底较为清晰等优点，但是由于放射性同位素对人和环境均会造成伤害，近来有被非同位素取代的趋势。非同位素标记物中目前最常用的有生物素、地高辛和荧光素三种。检测这些标记物的方法都是极其灵敏的。根据所用探针及所要检测核酸的不同又可分为DNA-DNA，RNA-DNA, RNA-RNA杂交。但不论哪一种形式的杂交，都必须经过五大过程，即组织细胞的固定，预杂交、杂交、冲洗和显示。本发明采用RNA-RNA的杂交方式，合成的探针(mRNA)和检测的靶mRNA是采用碱基互补(杂交互补)的原理，同时经过长时间研究和观察，启动和中止处得残基对检测的结果没有影响(因为，发明人采用的mRNA序列都超过600bp以上)。鉴于目前临床上癌症的诊断(影像医学和生化指标物都是肿瘤形成后的诊断)是晚期诊断，治疗也是晚期治疗，导致死亡率不降的医治模式。本发明的初衷是想改变目前临床上重大疾病的诊治模式，从治已病变成预防性治未病，达到预防性诊治，将目前影像医学手段和众多生化标记物无法检测到癌前变mRNA水平量化改变技术，做了创新性的技术突破，提供癌前变mRNA水平筛查技术。使临床上有了一项新的癌前变mRNA水平真正早期筛查的技术，为临床癌症的诊治争取时间和空间。
本发明的目的首先是提供一种原位杂交检测试剂盒，其包含原位杂交检测探针和标记物。其次，本发明还要提供上述试剂盒用于与癌症转移病变前期筛查及术复发、转移早期预警相关的原位杂交检测方法。 为实现本发明的目的，本发明的技术方案如下 本发明首先提供一种原位杂交检测试剂盒，其包括杂交探针和标记物，其中，所述的杂交探针如SEQ ID NO. I所示序列，是WWP2基因序列中间一段碱基序列，从500到1300bp,WWP2基因序列号NM-007014. 3，序列如SEQ ID NO. 2所示，核苷酸序列长度是4527bp，⑶S :90……2702bp，位于染色体16q22. 1〃上。(在探针标记过程中如果基因序列太长，超过IOOObp以上，我们会用⑶S的序列来设计探针，如果⑶S的序列也超过IOOObp以上，会采用基因的 中间一段碱基序列来合成探针，碱基序列不少于500bp，探针合成后要做序列检测，并对功能进行临床意义的分析)。本发明试剂盒的一个优选方案是，所述的标记物选自放射性物质、化学发光或显色物质、生物素、金属鲎、荧光素、酶及纳米材料。本发明试剂盒的一个优选方案是还包括杂交液。本发明试剂盒的一个优选方案是还包括增强剂。本发明试剂盒的一个优选方案是还包括显色剂。 本发明的癌变前期WWP2基因筛查试剂盒应用价值在于，能在mRNA水平，对癌症转移病变前期筛查，及癌变后或术后复发、转移、扩散发生的预警，进一步配合临床治疗。本发明还提供一种WWP2基因原位杂交的检测方法，包括以下步骤 (1)在上面所述的杂交探针与靶序列可形成稳定杂交复合体的条件下，将底物中待测RNA与杂交探针接触，形成杂交复合体；和 (2)检测所述杂交复合体。本发明所述的检测方法，其中优选地是，所述的可形成稳定杂交复合体的条件为核酸杂交的温度为42°C ;核酸杂交的时间为16 - 24小时。本发明所述的检测方法，其中优选地是，所述的底物选用人的血液白细胞标本或其它器官组织细胞标本。更优选地是，所述的血液标本或其它器官组织细胞标本来自癌症转移患者、癌症转移高危人群、健康人。本发明所述的检测方法，其中优选地是，所述的癌症高危人群、癌症好发家族、癌症转移患者。本发明的检测试剂盒是采用核酸杂交技术和组化免疫方法相结合，以WWP2基因的一级转录功能产物mRNA为检测对象，合成探针是WWP2基因的RNA序列，检测的底物是人体血液标本白细胞或组织细胞的RNA的表达量。原位杂交技术的显示方法能提供WWP2基因的半定量或定量表达程度判定。根据杂交后免疫组化显色判定以上基因的表达量，正常人WWP2基因低表达或I表达，即小量显色或不显色，WWP2基因在癌症病人和正常人有显着差异，该基因的表达量比正常人表达量都高。本发明的诊断试剂盒的组份是由杂交探针，杂交液，显色剂，增效剂等组成。本试剂盒的核酸杂交原理是分子生物学业内人士均熟知，具体操作步骤是标本处理、预杂交、杂交、免疫组化染色、镜下进行定量分析、结果报告，其中杂交的具体步骤包括
1).将待测标本放入反应槽中；
2).仪器自动弃去液体，自动加消化液；
3).仪器自动弃去液体，自动后固定；
4).仪器自动弃去液体，自动预杂交(42°C);
5).仪器自动弃去液体，自动清洗；
6).仪器自动弃去液体，自动杂交(42°C);
7).仪器自动弃去液体，自动清洗；
8).仪器自动弃去液体，自动与DIG抗体培养(室温)；9).仪器自动弃去液体，自动清洗,显色；
10).取出封片镜检。本发明的一个优选实施例的方案是以WWP2基因为目的基因合成的核酸探针用地高辛标记(地高辛标记的cDNA、RNA和寡核苷酸探针，不但探针的具有生物素标记优点，还克服了生物素标记的探针在原位杂交过程中受组织内源性生物素干忧等缺点)，将该杂交探针与人体血液白细胞的待测RNA核酸进行杂交，再用免疫组化的方法显色，在光镜下观察mRNA的存在和定位，根据染色的细胞数，判断目的基因的表达量。本发明方法是目前常用的核酸原位杂交技术，该方法通过检测底物细胞中的WWP2基因表达量，用来确定癌变前期的mRNA变化量，预警癌症转移变化是否发生及癌症转移患者术后是否复发、转移。因为WWP2基因在正常人中低表达，如果WWP2基因表达量高，说明有患癌的风险，说明癌症转移已发生，或癌症病人术后已经复发、转移，从而获得癌症转移早期信息。一个试剂盒可以多人份使用或一人份使用。
如上所述，当检测到WWP2基因的表达量高于正常对照时，则可预测受试者为癌症转移病理过程已发生。本发明具有如下有益效果
本发明的临床意义是更早期跟踪检测癌症转移变发生和病理演变过程中WWP2基因mRNA表达量的变化，预警癌症转移发生、发展趋势。本发明的诊断试剂盒与临床上其它检测与癌症标志物，以及影像医学检查有显着不同。本发明可以在基因转录的一级功能产物mRNA水平检测WWP2基因异常表达，在影像医学检查未发现占位性癌病灶复发之前，癌症生化指标未产生异常之前，亦未形成肿瘤之前，能及早做到以上基因表达异常的信息采集，给临床癌症病患一个真正的早期诊断以及治疗后转移复发及早预测。这样才有可能实施癌症的早期筛查、早期预防、早期治疗，有可能从源头上彻底根治癌症转移恶疾。此外，本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点，同时，本发明的检测方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推广。


图I是本发明WWP2基因原位杂交技术流程图。图2是本发明实施例中癌症转移症病人WWP2表达降低图片。图3是高位人群图片。图4是本发明实施例中正常人WWP2表达图片。

按照常规方法制备本实施例的原位杂交试剂盒，该试剂盒包括以WWP2基因的mRNA为检测目的基因设计的杂交探针、标记物、说明书，其中
本实施例的探针标记物选用地高辛。试剂盒杂交液组成


本发明公开一种原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针和标记物。还公开使用本试剂盒原位杂交检测与癌症转移早期病理演变有密切相关的E3泛素连接酶(WWP2)基因与的mRNA方法，包括以下步骤(1)在杂交探针与靶序列可形成稳定杂交复合体的条件下，将底物中待测RNA与杂交探针接触，形成杂交复合体；和(2)检测所述杂交复合体。本发明的试剂盒和检测方法可在mRNA水平上检测WWP2基因的表达量，比影像医学和现有的临床生化检测指标更早期，能实现真正的癌变前期mRNA水平筛查，同时，本发明的检测方法简单方便，成本低,便于县区级医院推广应用。