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专利名称
含有编码山梨酮脱氢酶基因载体的氧化葡糖杆菌的用途制作方法
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发明者
元英进, 杜瑾
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公开日
2012年6月13日
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申请日期
2011年12月9日
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优先权日
2011年12月9日
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申请人
天津大学
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文档编号
C12P7/60GK102492762SQ201110407078
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关键字
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权利要求
1.含有编码山梨酮脱氢酶基因载体的氧化葡糖杆菌的用途，其特征是将含有编码山梨酮脱氢酶基因载体的氧化葡糖杆菌和巨大芽孢杆菌接种到发酵培养基中，培养，获得2-酮基-L-古龙酸2.根据权利要求1所述的用途，其特征是所述含有编码山梨酮脱氢酶基因载体的氧化葡糖杆菌的构建为(1)山梨酮脱氢酶基因的体外扩增采用细菌基因组提取试剂盒提取氧化葡糖杆菌基因组为模板；以SEQ ID No. 1所示序列为上游引物，以SEQ ID No. 2所示序列为下游引物，进行PCR扩增，回收如SEQ ID No. 3 所示的PCR扩增产物；(2)编码山梨酮脱氢酶基因载体的构建取步骤(1)获得的PCR扩增产物用HindIII酶和BamHI酶双酶切；取载体pBBRl用KpnI 酶和HindIII酶双酶切；连接，转化入大肠杆菌DH5 α中，获得编码山梨酮脱氢酶基因载体； (3)氧化葡糖杆菌的转化取步骤( 所得编码山梨酮脱氢酶基因载体在1800V条件下电击转化入氧化葡糖杆菌，获得含有编码山梨酮脱氢酶基因载体的氧化葡糖杆菌3.根据权利要求1所述的用途，其特征是将含有编码山梨酮脱氢酶基因载体的氧化葡糖杆菌和巨大芽孢杆菌接种到发酵培养基中，使含有编码山梨酮脱氢酶基因载体的氧化葡糖杆菌的密度为4X108cfu/ml，使巨大芽孢杆菌的密度为4X 108CfU/ml，培养条件为在 300C，250rpm条件下培养120h，获得2-酮基-L-古龙酸；所述发酵培养基为按比例称取L-山梨糖80g，玉米浆20g，尿素12g，KH2PO4Ig, MgSO4O. 5g, CaCO3Ig,加水至 1L，调 pH 为 7. 0，121°C灭菌 20min
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技术领域
本发明属于工业微生物领域，涉及含有编码山梨酮脱氢酶基因载体的氧化葡糖杆菌在提高2-酮基-L-古龙酸混菌发酵性能中的应用
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背景技术
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具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明下面的内容及实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但并不用于限制本发明本发明所使用的氧化葡糖杆菌(GluconcAacter oxydans)保藏编号为CGMCC No. 1. 110，巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)保藏编号为CGMCC No 1. 459，从中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)购得实施例1含有编码山梨酮脱氢酶基因载体的氧化葡糖杆菌的构建(1)山梨酮脱氢酶基因的体外扩增采用细菌基因组提取试剂盒提取氧化葡糖杆菌(GluconcAacter oxydans)保藏编号为CGMCC No. 1. 110基因组为模板，取该基因组溶液1 μ 1,5XFastPfu buffer 4 μ l,20mM 的dNTP2 μ 1，20nM的以SEQ ID No. 1所示序列为上游引物0. 4 μ 1，20ηΜ的以SEQ ID No. 2 所示序列为下游引物0.4 μ 1，无菌水11. 8 μ 1，FastPfu酶0.4 μ 1，在PCR管中混合均勻； 将PCR管放入PCR仪中进行扩增循环，扩增程序为95°C 2min ；95°C 20s, 55°C 35s，72°C 2min，共25个循环；72°C 5min ；4°C 30min将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，将PCR产物条带切下，经琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化PCR扩增产物如SEQ ID No. 3所示；(2)编码山梨酮脱氢酶基因载体的构建取步骤(1)获得的PCR 扩增产物溶液 8 μ 1，与 1μ 1 IOXdigest buffer,0. 5μ 1 HindIII酶，0. 5 μ 1 BamHI酶混合均勻，在37°C条件下进行酶切反应2小时；反应后产物进行琼脂糖凝胶电泳，将酶切产物条带切下，经琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化酶切PCR产物取载体 pBBRlMCS溶液 8μ 1，与 1 μ IlOXdigest buffer, 0. 5 μ 1 KpnI 酶，0. 5μ1 HindIII 酶混合均勻，在37°C条件下进行酶切反应2小时；反应后产物进行琼脂糖凝胶电泳，将酶切产物条带切下，经琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化酶切载体产物取酶切PCR产物5. 5 μ 1，酶切载体产物 3 μ 1，IOXligase buffer 1 μ 1, DNA ligase 0· 5 μ 1，混合均勻，在 22°C条件下进行连接反应30min将连接产物用化学转化法转化入大肠杆菌DH5 α中，涂布于含抗生素的 LB固体培养基上，在37°C条件下培养12h培养后获得的单菌落在LB液体培养基中37°C培养12h，用质粒小量提取试剂盒提取质粒，获得编码山梨酮脱氢酶基因载体；(3)编码山梨酮脱氢酶基因载体转化入氧化葡糖杆菌将氧化葡糖杆菌涂布在固体培养基上，在30°C条件下培养48小时；用2ml无菌水将菌体洗下，冰浴lOmin，4°C，4000rpm离心5min后收集细胞，用预冷的无菌水洗一次，10% 甘油洗两次后，100 μ 1 10%甘油重悬细胞；与步骤( 所得编码山梨酮脱氢酶基因载体的水溶液10 μ 1混合均勻置于电转杯中，冰浴5min，将电转杯置于电转仪中1800V电击；电击产物与900 μ 1种子培养基混合均勻，在30°C，140rpm条件下培养2小时，将培养物涂布于固体培养基上，在30°C条件下培养4天，获得的单菌落转入种子培养基中，在30°C，250rpm 条件下培养，获得含有编码山梨酮脱氢酶基因载体的氧化葡糖杆菌；所述固体培养基为L_山梨糖20g，玉米浆3g，牛肉膏3g，酵母浸粉3g，尿素lg，蛋白胨 IOg,琼脂 20g, KH2PO4Ig,MgSO4O. 2g，CaCO3Ig,加水至 1L，调 pH 为 6. 8，121°C灭菌 20min所述种子培养基为L_山梨糖20g，玉米浆3g，牛肉膏3g，酵母浸粉3g，尿素lg，蛋白胨 IOg, KH2PO4Ig, MgSO4O. 2g，CaCO3Ig,加水至 1L，调 pH 为 6. 8，121°C灭菌 20min实施例2混菌发酵将实施例1获得的含有编码山梨酮脱氢酶基因载体的氧化葡糖杆菌和巨大芽孢杆菌接种到发酵培养基中，使含有编码山梨酮脱氢酶基因载体的氧化葡糖杆菌的密度为 4X 108cfu/ml，使巨大芽孢杆菌的密度为4X 108cfu/ml，发酵条件为在30°C，250rpm下培养120h，获得2-酮基-L-古龙酸所述发酵培养基为按比例称取L-山梨糖80g，玉米浆20g，尿素12g，KH2PO4Ig, MgSO4O. 5g, CaCO3Ig,加水至 1L，调 pH 为 7. 0，121°C灭菌 20min实施例32-酮基-L-古龙酸和L-山梨糖含量测定采用高效液相色谱法(HPLC)样品制备取发酵培养不同时间的发酵液ImL于1. 5mL离心管中，lOOOOr/min转速离心3min，取上清100 μ L于1. 5mL离心管中，并加入900 μ L流动相(5mM H2SO4)得到稀释十倍的样品振荡混勻后，用0. 22μπι的纤维素微孔滤膜过滤样品，得到待测样品高效液相色谱条件色谱柱bio-rad HPX-87H，流动相5mM H2SO4,流速0. 6mL/ min,柱温65°C，示差检测器检测结果见图1图例O 原始氧化葡糖杆菌和巨大芽孢杆菌混菌发酵；Δ 含有编码山梨酮脱氢酶基因载体的氧化葡糖杆菌和巨大芽孢杆菌混菌发酵原始氧化葡糖杆菌与巨大芽孢杆菌利用实施例2的发酵条件进行搭配混菌发酵的2-酮基-L-古龙酸产率达到87%;用实施例1的方法获得的含有编码山梨酮脱氢酶基因载体的氧化葡糖杆菌和巨大芽孢杆菌混菌发酵的2-酮基-L-古龙酸产率达到98% ；2-酮基-L-古龙酸产率提高了 12.6%实验证明含有编码山梨酮脱氢酶基因载体的氧化葡糖杆菌和巨大芽孢杆菌接种到发酵培养基中，培养发酵，可以使L-山梨糖生产2-酮基-L-古龙酸的糖酸转化率提高
专利名称：含有编码山梨酮脱氢酶基因载体的氧化葡糖杆菌的用途的制作方法氧化葡糖杆菌和巨大芽孢杆菌混菌发酵体系广泛用于维生素C的工业生产中，用于将L-山梨糖转化为维生素C的前体2-酮基-L-古龙酸。但该两菌体系中，只有氧化葡糖杆菌能够完成糖酸转化，但其单独培养时生长及其缓慢，产酸效率很低；而巨大芽孢杆菌作为促进氧化葡糖杆菌生长的伴生菌可以提高氧化葡糖杆菌的生长速率和产酸效率。因此提高氧化葡糖杆菌自身的糖酸转化能力是提高混菌发酵生产效率的关键。分子生物学操作和代谢工程手段加快了菌株人工进化、能够快速提高菌株特性， 可以基于基因信息有目的地高效改造菌株。专利CN1621518和专利CN1515669获得了氧化葡糖杆菌进行糖酸转化的关键酶——山梨酮脱氢酶的核酸序列。基于该信息可以对氧化葡糖杆菌进行分子水平改造，进而提高其与巨大芽孢杆菌混合发酵时的2-酮基-L-古龙酸混菌发酵性能。
本发明的目的是通过代谢工程的手段来改造氧化葡糖杆菌，增加其山梨酮脱氢酶基因的拷贝数，提高氧化葡糖杆菌与巨大芽孢杆菌混菌发酵转化L-山梨糖为2-酮基-L-古龙酸的性能，提供一种含有编码山梨酮脱氢酶基因载体的氧化葡糖杆菌的用途。本发明的技术方案概述如下含有编码山梨酮脱氢酶基因载体的氧化葡糖杆菌的用途，是将含有编码山梨酮脱氢酶基因载体的氧化葡糖杆菌和巨大芽孢杆菌接种到发酵培养基中，培养，获得2-酮基-L-古龙酸。所述含有编码山梨酮脱氢酶基因载体的氧化葡糖杆菌的构建为(1)山梨酮脱氢酶基因的体外扩增采用细菌基因组提取试剂盒提取氧化葡糖杆菌基因组为模板；以SEQ ID No. 1所示序列为上游引物，以SEQ ID No. 2所示序列为下游引物，进行PCR扩增，回收如SEQ ID No. 3所示的PCR扩增产物；(2)编码山梨酮脱氢酶基因载体的构建取步骤(1)获得的PCR扩增产物用HindIII酶和BamHI酶双酶切；取载体pBBRl 用KpnI酶和HindIII酶双酶切；连接，转化入大肠杆菌DH5 α中，获得编码山梨酮脱氢酶基因载体；(3)氧化葡糖杆菌的转化取步骤( 所得编码山梨酮脱氢酶基因载体在1800V条件下电击转化入氧化葡糖杆菌，获得含有编码山梨酮脱氢酶基因载体的氧化葡糖杆菌。将含有编码山梨酮脱氢酶基因载体的氧化葡糖杆菌和巨大芽孢杆菌接种到发酵培养基中，使含有编码山梨酮脱氢酶基因载体的氧化葡糖杆菌的密度为4X108cfu/ml，使巨大芽孢杆菌的密度为4X 108Cfu/ml，培养条件为在30°C，250rpm条件下培养120h，获得 2-酮基-L-古龙酸；所述发酵培养基为按比例称取L-山梨糖80g，玉米浆20g，尿素12g，KH2PO4Ig, MgSO4O. 5g, CaCO3Ig,加水至 1L，调 pH 为 7. 0，121°C灭菌 20min。实验证明含有编码山梨酮脱氢酶基因载体的氧化葡糖杆菌和巨大芽孢杆菌接种到发酵培养基中，培养发酵，可以使L-山梨糖生产2-酮基-L-古龙酸的糖酸转化率提高。图1为含有编码山梨酮脱氢酶基因载体的氧化葡糖杆菌和巨大芽孢杆菌混菌发酵结果。
本发明公开了一种含有编码山梨酮脱氢酶基因载体的氧化葡糖杆菌的用途，是将含有编码山梨酮脱氢酶基因载体的氧化葡糖杆菌和巨大芽孢杆菌接种到发酵培养基中，培养，获得2-酮基-L-古龙酸。实验证明含有编码山梨酮脱氢酶基因载体的氧化葡糖杆菌和巨大芽孢杆菌接种到发酵培养基中，培养发酵，可以使L-山梨糖生产2-酮基-L-古龙酸的糖酸转化率提高。
