专利名称：一种谷氨酰胺转胺酶真空干燥的制备方法谷氨酰胺转胺酶是一种催化酰基转移反应的微生物酶，催化存在于肽链内的谷氨酸Gln残基Y-羧基酰胺基与赖氨酸Lys残基ε-氨基发生交联作用；在分子内或分子间产生(Y- Glu)- Lys的架桥粘结作用，形成交联的蛋白质结构，从而改善蛋白质功能性质，其安全而超强的交联特性，受到国内外食品科技工作者广泛关注，有“二十一世纪超级粘合剂”的美称，经常作为改良剂用于粘结肉，鱼糜，面包中。谷氨酰胺转胺酶是以半胱氨酸为活性中心残基的一种硫醇酶，抗氧化性差，高温条件下易失活，不易保存。目前生产谷氨酰胺转氨酶的方法主要是冷冻干燥，成本高，花费大，不利于大规模工业化生产。本发明提出一种提高谷氨酰胺转胺酶稳定性的方法，通过加入糖醇类保护剂提高谷氨酰胺转胺酶的热稳定性，通过加入活性肽提高谷氨酰胺转胺酶的抗氧化稳定性。这样可以利用真空干燥过程来干燥微生物发酵液，解决了工业生产中只能用冷冻干燥生产谷氨酰胺转胺酶的问题，提高了谷氨酰胺转胺酶的稳定性，节约了生产成本。
本发明提出了一种谷氨酰胺转胺酶真空干燥的制备方法，向谷氨酰胺转胺酶发酵液中添加热保护剂，室温静置，经高速冷冻离心得到上清液，用95%乙醇对所述上清液进行沉淀，经高速冷冻离心得到沉淀物，加入抗氧化保护剂，经混合均勻、真空干燥，得到谷氨酰胺转胺酶酶制剂；其中，所述热保护剂为糖醇类物质，包括山梨糖醇和麦牙糖醇，所述抗氧化保护剂包括活性肽。所述的发酵液中谷氨酰胺转胺酶的酶活为l(T50u/ml。所述山梨糖醇的添加量为0. 59T5%w/v，优选添加量为0. 5%^2%w/v ；所述麦牙糖醇的添加量为l°/TlO%w/v，优选添加量为29T4%w/v。所述室温静置时间为0. 5h-lh0所述乙醇的添加量与上清液的体积比为0. 5:Γ . 5:1，优选比例为0. 5:1。所述抗氧化保护剂优选为小麦蛋白肽。所述抗氧化保护剂的添加量与沉淀物的质量比为0.5:广1:1. 5，优选比例为 0.75:1。于35°C _40°C下进行真空干燥，优选时间为3h_5h。本发明中，采用两次高速冷冻离心，第一次向发酵液加入热保护剂后经过高速冷冻离心取上清液得到发酵液上清液，经过加入乙醇进行沉淀后通过第二次高速冷冻离心获得沉淀物，并加入抗氧化剂。本发明中，采用两次高速冷冻离心达到了高度纯化谷氨酰胺转胺酶的技术效果。谷氨酰胺转胺酶通过催化蛋白质多肽分子内和分子间发生共价交联，从而改善蛋白质的结构和功能。但谷氨酰胺转胺酶自身的稳定性差，不宜长期储存，从而影响谷氨酰胺转胺酶在食品领域的应用。因而本发明涉及一种应用真空干燥法生产谷氨酰胺转胺酶的工艺，向谷氨酰胺转胺酶发酵液中添加热保护剂，室温放置一段时间，选用95%乙醇对所述发酵液进行沉淀，高速冷冻离心，弃上清，向得到的沉淀物中添加抗氧化保护剂，混合均勻，真空干燥，得到谷氨酰胺转胺酶酶制剂。本发明中，利用真空干燥代替冷冻干燥生产谷氨酰胺转氨酶，解决了高温对谷氨酰胺转胺酶稳定性的影响。本发明中的热保护剂糖醇类物质是单糖分子的醛基或酮基被还原成醇基的化合物，使糖转变为多元醇，在热环境下有较高的稳定性，这是因为糖醇中含有大量羟基，能够改变溶液中蛋白质的水合结构，促进蛋白质分子间的疏水相互作用，从而提高了蛋白质受热时的稳定性。本发明中适用的糖醇类包括山梨糖醇、甘露糖醇、赤鲜糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇等。不同的糖醇对蛋白质的保护作用是有差异的，这可能是由于羟基基团的数量和位置不同造成的。本发明提出糖醇中山梨糖醇和麦芽糖醇对蛋白质的热保护效果最为理想，其次是乳糖醇和木糖醇。本发明中采用活性肽作为抗氧化保护剂。活性肽是蛋白质中20个天然氨基酸以不同的组成和排列方式构成的从二肽到复杂的线性、环状结果不同肽的总称，按照原料的类别划分，本发明方法适用的活性肽包括小麦肽、大豆肽、玉米肽、卵白肽、丝蛋白肽和复合肽等。活性肽具有一定的营养作用和生理功能。谷氨酸残基在蛋白质中的存在形式是其酰胺形式的谷氨酰胺，谷氨酰胺是合成体内极其重要的抗氧化剂一还原型谷胱甘肽的前体物质，因而本发明采用活性肽作为抗氧化保护剂。本发明采用的小麦蛋白肽中谷氨酸含量是所有植物蛋白中含量最高的，约占蛋白总量的35%，因此，添加小麦蛋白肽能够显著提高谷氨酰胺转胺酶抗氧化能力。除小麦蛋白肽外，大部分蛋白肽也可提高谷氨酰胺转胺酶的抗氧化能力，但效果不如小麦蛋白肽。与其他保护剂(如氨基酸类、单价盐类等)对谷氨酰胺转胺酶的作用相比，活性肽主要发挥的抗氧化作用最显著，得到的谷氨酰胺转胺酶的质量最多，在长期保存中，总酶活下降最少，且活性肽类成本较低，适合于广泛应用于工业化生产。本发明的创新点在于，在一般的生产谷氨酰胺转胺酶过程中，主要添加热保护剂来稳定谷氨酰胺转胺酶，本发明中，向发酵液同时添加热保护剂和抗氧化保护剂，抗氧化作用效果明显，可显著提高酶活，且以此法生产的酶稳定性更好。本发明选用二次高速冷冻离心，得到的酶制剂较一次冷冻离心得到得酶制剂，纯度更高。本发明的有益效果在于热保护剂可以提高受热时谷氨酰胺转胺酶的热稳定性；抗氧化保护剂如小麦蛋白肽中含有多种氨基酸，可以提高长期放置过程中酶的抗氧化性。本发明有效解决了谷氨酰胺转胺酶稳定性差的问题，并极大降低了生产成本。将本发明制备的谷氨酰胺转氨酶常温放置，每隔一月进行酶活测定。检测结果显示，依照本发明制备方法得到的谷氨酰胺转氨酶具有良好酶稳定性。图1所示为实施例1所制备的谷氨酰胺转胺酶酶制剂的稳定性随时间变化的示意图。图2所示为实施例2所制备的谷氨酰胺转胺酶酶制剂的稳定性随时间变化的示意图。图3所示为实施例3所制备的谷氨酰胺转胺酶酶制剂的稳定性随时间变化的示意图。图4所示为实施例4所制备的谷氨酰胺转胺酶酶制剂的稳定性随时间变化的示意图。图5所示为实施例5所制备的谷氨酰胺转胺酶酶制剂的稳定性随时间变化的示意图。图6所示为实施例6所制备的谷氨酰胺转胺酶酶制剂的稳定性随时间变化的示意图。图7所示为实施例7所制备的谷氨酰胺转胺酶酶制剂的稳定性随时间变化的示意图。向茂原轮链丝菌(份腫mobaraense)所产生的谷氨酰胺转胺酶发酵液IOOml中以0. 5:1的乙醇发酵液体积比添加乙醇对酶进行沉淀，高速冷冻离心机设定 6000r/min、4°C、离心20min得到沉淀物，将沉淀物放入真空干燥箱中，40°C干燥池，得到谷
5氨酰胺转胺酶酶制剂。用自封袋封口，并定期测定酶活性。实施例2
向茂原轮链丝菌(份腫mobaraense)所产生的谷氨酰胺转胺酶发酵液IOOml中加入l%(w/v)山梨糖醇，搅拌后室温放置30min，以0. 5:1的乙醇发酵液的体积比添加乙醇对酶进行沉淀，高速冷冻离心机设定6000r/min、4°C、离心20min得到沉淀物， 将沉淀物放入真空干燥箱中，40°C干燥池，得到谷氨酰胺转胺酶酶制剂。用自封袋封口，定期测定酶活性。实施例3
向茂原轮链丝菌(份腫mobaraense^所产生的谷氨酰胺转胺酶发酵液IOOml中加入3%(w/v)麦芽糖醇，搅拌后室温放置30min，以0. 5:1的乙醇发酵液的体积比添加乙醇对酶进行沉淀，高速冷冻离心机设定6000r/min、4°C、离心20min得到沉淀物， 将沉淀物放入真空干燥箱中，40°C干燥池，得到谷氨酰胺转胺酶酶制剂。用自封袋封口，定期测定酶活性。实施例4
向茂原轮链丝菌(份腫mobaraense^所产生的谷氨酰胺转胺酶发酵液IOOml中加入3%(w/v)麦芽糖醇、1%山梨糖醇，搅拌后室温放置30min，以0. 5:1的乙醇发酵液的体积比添加乙醇对酶进行沉淀，高速冷冻离心机设定6000r/min、4°C、离心 20min得到沉淀物，将沉淀物放入真空干燥箱中，40°C干燥池，得到谷氨酰胺转胺酶酶制剂。用自封袋封口，定期测定酶活性。实施例5
向茂原轮链丝菌(份腫mobaraense^所产生的谷氨酰胺转胺酶发酵液IOOml中以0. 5:1的乙醇发酵液体积比添加乙醇对酶进行沉淀，高速冷冻离心机设定 6000r/min、4°C、离心20min得到沉淀物，以小麦蛋白肽沉淀物为0. 75 1的质量比添加小麦蛋白肽，混合均勻后放入真空干燥箱内，干燥池，得到谷氨酰胺转胺酶酶制剂。用自封袋封口，定期测定酶活性。实施例6
向茂原轮链丝菌(份腫mobaraense^所产生的谷氨酰胺转胺酶发酵液IOOml中加入1% (w/v)山梨糖醇，搅拌后室温放置30min，以0. 5:1的乙醇发酵液的体积比添加乙醇对酶进行沉淀，高速冷冻离心机设定6000r/min、4°C、离心20min，向得到的沉淀物中加入小麦蛋白肽，添加量与沉淀物的质量比为0. 75 :1，放入真空干燥箱内，干燥 3h，得到谷氨酰胺转胺酶酶制剂。用自封袋封口，定期测定酶活性。实施例7
向茂原轮链丝菌(份腫mobaraense^所产生的谷氨酰胺转胺酶发酵液IOOml中加入1% (w/v)山梨糖醇和3% (w/v)麦芽糖醇，搅拌后室温放置30min,以0. 5:1 的乙醇发酵液的体积比添加乙醇对酶进行沉淀，高速冷冻离心机设定6000r/min、4°C、 离心20min，向得到的沉淀物中加入小麦蛋白肽，添加量与沉淀物的质量比为0. 75 :1，放入真空干燥箱内，干燥池，得到谷氨酰胺转胺酶酶制剂。用自封袋封口，定期测定酶活性。实施例8
通过标准氧肟酸盐测定法对实施例1-7制备得到的谷氨酰胺转胺酶酶制剂进行酶活检测，其步骤为分别取2ml试剂A液和试剂B液加入磨口试管中，37°C保温15分钟，加入 0. 2ml酶液，反应10分钟，加A液的试管加aiilB液终止反应，加入B液的试管加入^iil A 液，过滤，以第二支试管反应液作为空白对照，525nm处测定OD值。用L-谷氨酸1 -单氧肟酸做标准曲线。试剂A (反应液)含0. 2 M Tris-HCl、0. IM盐酸羟胺、0.01 M还原型谷胱甘肽、 0. 03 M Na-CBZ- Gln- Gly，pH 6.0。试剂B (终止液):以下三种成分按体积比1:1:1的比例混合。3 mol/L HCl、12 % 三氯乙酸(W/V)、5 %三氯化铁(W/V)。实施例1制备的谷氨酰胺转胺酶酶制剂酶活检测结果如图1所示，未添加任何保护剂的谷氨酰胺转胺酶，总酶活低，仅2098 (U)，且随着时间的推移，总酶活下降较多，从 2098U降到1132U，下降幅度达50%以上，可见长期保存过程中，稳定性较差。实施例2制备的谷氨酰胺转胺酶酶制剂酶活检测结果如图2所示，与图1比较，加入山梨糖醇后，得到的谷氨酰胺转胺酶的总酶活显著高于未添加保护剂得到的谷氨酰胺转胺酶的总酶活。总酶活为2743U，提高700U，且随着时间的推移，酶活下降很少，从2743U降到 2400U。实施例3制备的谷氨酰胺转胺酶酶制剂酶活检测结果如图3所示，与图1比较，加入麦芽糖醇后，得到的谷氨酰胺转胺酶的总酶活显著高于未添加保护剂得到的谷氨酰胺转胺酶的总酶活，总酶活为2631U，且随着时间的推移，酶活下降很少，从降到2389U。实施例4制备的谷氨酰胺转胺酶酶制剂酶活检测结果如图4所示，与图1比较，加入山梨糖醇和麦芽糖醇后，得到的谷氨酰胺转胺酶总酶活显著高于未添加保护剂得到的谷氨酰胺转胺酶的总酶活，也高于单独添加山梨糖醇和麦芽糖醇(实施例2-3)得到的总酶活， 总酶活为3023U，随着时间的推移，酶活下降少，从3023U降到^32U。实施例5制备的谷氨酰胺转胺酶酶制剂酶活检测结果如图5所示，与图1比较，加入小麦蛋白肽后，得到的谷氨酰胺转胺酶的总酶活显著高于未添加保护剂得到的谷氨酰胺转胺酶的总酶活，总酶活达27MU，且随着时间的推移，酶活下降很少，从2754U降到M71U。实施例6制备的谷氨酰胺转胺酶酶制剂酶活检测结果如图6所示，与图1比较，加入山梨糖醇和小麦蛋白肽后，得到的谷氨酰胺转胺酶的总酶活显著高于未添加保护剂得到的谷氨酰胺转胺酶的总酶活，也高于通过实施例2-4得到的谷氨酰胺转胺酶的总酶活，总酶活为^80U，且随着时间的推移，酶活下降很少，从降到^87U。实施例7制备的谷氨酰胺转胺酶酶制剂酶活检测结果如图7所示，与实施例1-6 对照，依照本发明谷氨酰胺转胺酶的制备方法，加入山梨糖醇、麦芽糖醇和小麦蛋白肽后， 得到的谷氨酰胺转胺酶的总酶活最高，总酶活为3543U，且随时间推移酶活的下降幅度最小，从3543U降到3331U。可见，添加0. 5%_2% (w/v)的山梨糖醇、2%_4% (w/v)的麦芽糖醇及一定质量的小麦蛋白肽可以提高谷氨酰胺转胺酶的热稳定性和抗氧化性，在长期保存中发挥了作用。实施例9
本实施例中将乳糖醇和木糖醇作为热保护剂，其余操作方法与实施例4基本相同。经检测，得到的谷氨酰胺转胺酶总酶活高于未添加任何保护剂的谷氨酰胺转胺酶的总酶活， 但不如添加山梨糖醇和麦芽糖醇得到的谷氨酰胺转胺酶得到的总酶活。因此，本发明提出将山梨糖醇和麦芽糖醇作为热保护剂，其对蛋白质热保护的效果最为理想。
实施例10
本实施例中将大豆蛋白肽作为抗氧化保护剂，其余操作方法与实施例5基本相同。经检测，得到的谷氨酰胺转胺酶高于未添加任何保护剂的谷氨酰胺转胺酶的总酶活，但不如添加小麦蛋白肽得到的谷氨酰胺转胺酶得到的总酶活。因此，本发明提出将麦蛋白肽作为抗氧化保护剂，其对蛋白质抗氧化保护的效果最为理想。


本发明公开了一种谷氨酰胺转胺酶真空干燥的制备方法,包括向谷氨酰胺转胺酶发酵液中添加热保护剂，室温静置，经高速冷冻离心得到上清液，用95%乙醇对所述发酵液进行沉淀，经高速冷冻离心得到沉淀物，加入抗氧化保护剂，经混合均匀、真空干燥，得到谷氨酰胺转胺酶酶制剂。本发明制备方法得到的谷氨酰胺转胺酶稳定性大幅提高。