专利名称：紧密枝顶孢霉菌株及其特异性脂肪酶的制作方法脂肪酶(E.C.3.1.1.3)亦称酰基甘油水解酶，是一类具有多种催化能力的酶，可催化三酰甘油酯及其它一些水不溶性酯类的水解，还可以催化酯交换反应、醇解反应、转酯化及酯类的逆向合成反应，以及生物表面活性剂的合成、旋光异构体的拆分和手性药物的合成等。脂肪酶被广泛应用于粮油生产、食品工业、日用化学工业、油脂化学工业、农业化学工业、造纸工业、洗涤剂工业、以及药物合成等许多领域，是重要的工业酶制剂之一。脂肪酶催化反应位置特异性是指反应底物甘油三酯中的Sn-1 (或Sn-3)和Sn_2位酯键的识别和水解的反应性。微生 物脂肪酶作用于底物三脂酰甘油的方式因酶的类型而异，具有1，3位置特异性的脂肪酶包括例如米黑根毛霉(Mucor miehei)和戴尔根霉(R.deIemar)等产生的脂肪酶。具有1，3-位置特异性的脂肪酶可用于结构油脂生产，特殊脂肪酸、单甘酯的合成以及立体选择性化学合成和拆分，在工业生产中具有巨大的应用潜力。因此，选育1，3-特异性脂肪酶的菌种及开发相应脂肪酶，具有重要的工业价值和意义。
本发明提供一种紧密枝顶孢霉(Acremonium s trie turn)菌株,其于2010年12月09日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏登记号为CGMCC 4420。本发明提供一种脂肪酶，其具有1，3_特异性。在一个实施方式中，本发明提供一种脂肪酶，其具有下述一种或多种特征:a.最适作用温度为30_50°C ；b.最适作用pH为6-10 ；c.在 pH 7.Ο-pH 11.0 稳定；d.在40°C以下稳定；和/或e.1，3-特异性。在一个优选实施方式中，所述最适作用温度为30°C、35°C、40°C、45°C、50°C或其间任何范围。在另一个优选实施方式中，所述最适作用PH为6、7、8、9、10或其间任何范围。在另一个优选实施方式中，本发明脂肪酶在pH 7.0,7.5,8.0,8.5,9.0,9.5,10.0,10.5,11.0或其间任何范围下稳定。在另一个优选实施方式中，本发明脂肪酶在40°C、35°C、30°C、25 °C、20°C、15 °C、10°C、5 °C、(TC 或更低温度下稳定。在一个实施方式中，本发明提供一种脂肪酶，其是本发明紧密枝顶孢霉菌株2823产生的。另一方面，本发明提供一种产生脂肪酶的方法，所述方法包括发酵本发明紧密枝顶孢霉菌株和收集发酵上清液。在一个优选实施方式中，本发明所述方法还包括纯化步骤。在一个优选实施方式中，发酵步骤在20-50 V，例如，20°C、25°C、30°C、35°C、40 V、45°C、50°C或其间任何温度范围下进行。在另一个优选实施方式中，发酵步骤在摇床中进行。在另一个优选实施方式中，发酵步骤进行10-100小时，例如10小时、20小时、30小时、40小时、50小时、60小时、70小时、80小时、90小时、100小时或其间任何范围。在一个优选实施方式中，收集上清液的步骤通过离心或移液器吸取进行。在一个优选实施方式中，纯化步骤通过柱层析进行。在一个优选实施方式中，利用本发明方法得到的脂肪酶具有如上所述的任何本发明脂肪酶的特征。图1是紧密枝顶孢霉2823的菌种显微形态。图2是紧密枝顶孢霉2823产生的脂肪酶的酶活与温度的关系曲线。图3是紧密枝顶孢霉2823产生的脂肪酶的酶活与pH的关系曲线。图4是紧密枝顶孢霉2823产生的脂肪酶的稳定性与温度的关系曲线。图5是紧密枝顶孢霉2823产生的脂肪酶的稳定性与pH的关系曲线。图6是紧密枝顶孢霉2823产生的脂肪酶水解三油酸甘油酯的产物的TLC结果，其中I是油酸；2是0.5h反应产物；3是3h反应产物；4是9h反应产物；5是24h反应产物；6是无脂肪酶对照(孵育0.5h) ;7是脂肪酶对照(24h)(无活性脂肪酶，将该菌株产生的粗酶液煮沸10-15分钟，采用pNPP法检测确认酶失去活性，以无活性的酶液作为对照)；8是2-MAG(2-油酸单苷酯)；9是DAG(1，2(2，3)油酸苷二酯)。菌种保藏本发明提供的紧密枝顶孢霉菌株2823于2010年12月19日保藏在中国微生物所菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC 4420。定义紧密枝顶孢霉(Acremonium s trie turn)在分类学上,隶属于真菌界、子囊菌门、粪壳菌纲、肉座菌亚纲、肉座菌目、枝顶孢霉属的菌种(参考《真菌词典》第九版)。菌落(MEA2%)生长迅速，微湿到粘滑，粉红色到橙色；反面持久无色或粉红色到橙色。显微形态为分生孢子梗结构简单，偶尔有分支，瓶梗细长，生长于基质或稍微呈簇着生于气生菌丝，20-65x1.4-2.5 μ m0生于基质的孢子常常形成于简化的瓶梗。分生孢子粘滑的头部聚集在一起，圆柱形或椭圆形，3.3-5.5x0.9-1.8 μ m，透明(参考Hoog，G.S.de 2000，《临床真菌图册》(Atlas of clinical fungi),第2版:418)。本发明获得的紧密枝顶孢霉菌株,来源于中国青岛海岸长有海蛎子岩石上，经中科院微生物所鉴定，该菌株生长和形态与上述文献记载的特征略有区别，其特征还在于该菌株能够分泌产生1，3_特异性脂肪酶。脂肪酶(E.C.3.1.1.3)亦称酰基甘油水解酶，是一类具有多种催化能力的酶，可催化三酰甘油酯水解生成脂肪酸、甘油、单甘脂和苷二脂等产物，还可以催化酯交换反应、醇解反应、转酯化及酯类的逆向合成等反应。脂肪酶被广泛应用于油脂生产、食品加工、日用化学工业、造纸工业、洗涤剂工业、以及药物合成等许多领域，是重要的工业酶制剂之一。本发明脂肪酶，由青岛海岸长有海蛎子的岩石生境中筛选获得的菌株产生，和以前报道的该属菌产生的脂肪酶相比，属于碱性脂肪酶，此外，还具有酶促反应在40°C以下较稳定，在pH 7.0-pHll.0范围内较稳定等特征。实施例下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。以下实施例中所有试剂都可来源于市售，例如，本发明所用的培养基成分均可购自国药集团化学试剂有限公司。实施例1菌株选育1.采样:分别在烟台和青岛海岸采集83个样品，包括沙滩土样、沙滩沙、朽木、海洋动物尸体、海边腐朽的海草、海带、海菜、海岸岩石表层、海岸边的沟泥以及饭店前的沟泥等。2.培养基配制:平板分离培养基(％，以重量百分数计算):豆粉0.5、蛋白胨0.5、KH2PO40.1、Na2HPO40.1、MgSO40.01，pH 6.5，蒸馏水配制)121 °C灭菌30分钟后，在上述成分中再加
0.4%的甘油丁酸三酯，制备成平板分离培养基。脂肪酶筛选发酵培养基(％，以重量百分数计算):豆粉2.0、鱼油2.(KKH2PO40.2、Na2HPO40.2,MgSO40.0UCaCl20.2，蒸馏水配制)。每IOOmL三角瓶中加发酵培养基20mL(pH
6.0)，121。。灭菌 30 分钟。
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营养肉汁琼脂培养基(％，以重量百分数计算):蛋白胨1.0、牛肉浸取物0.3、NaCl
0.5、琼脂1.5、pH7.0，蒸馏水配制。PDA培养基(％，以重量百分数计算):葡萄糖2.0、琼脂1.5、余量为马铃薯浸出液，自然pH。其中马铃薯浸出液配制:取去皮马铃薯200克，切成小块，加水1.0升煮沸30分钟，滤去马铃薯块，将滤液用水补足至1.0升。3.菌种平板初筛:在IOmL试管中，加入2mL液体分离培养基，0.2g采集的样品，28°C摇床震荡培养24-48小时。取发酵液少许，划线接种在平板分离培养基)上，28°C培养，随时观察，生长2-3天后，挑选产透明圈的菌落。接种到营养肉汁琼脂培养基或PDA培养基中，其中细菌接到营养肉汁琼脂培养基斜面，霉菌接到PDA培养基斜面。菌种再进行平板划线分离，挑选菌落小透明圈大的菌落，接种到斜面培养基。4.菌种摇瓶发酵复筛:对于细菌，从营养肉汁琼脂培养基斜面取半耳环菌体，对于霉菌，从PDA培养基斜面切3毫米左右大小的菌块，分别接种于250ml摇瓶中，摇瓶中含有20ml发酵培养基，28°C培养，在接种后24小时、48小时、72小时取样，常规氢氧化钠碱滴定法(QB/T1803-1993脂肪酶测定方法)测定脂肪酶活力，获得初筛活力达10-50U/mL菌种，并将菌种保存在试管斜面。5.菌种初步编号:依据上述方法，在青岛海岸曾长有海蛎子的岩石上的第28号样品中，分离出第23个菌落，经检测在平板上具有明显的水解透明圈，摇瓶发酵复筛检测，具有较强的脂肪酶水解活力，故编号2823，命名为紧密枝顶孢霉2823。
实施例2紧密枝顶孢霉2823的菌种鉴定本发明人委托中国科学院微生物研究所菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区大屯路)对编号为2823菌种进行鉴定，鉴定结果，详述如下。菌种生长特性鉴定:麦芽汁琼脂培养基(MEA)上菌落生长局限，25°C避光条件下培养7天菌落直径为25-28_，初期菌落白色，后期变为浅橙色，平铺，湿润，中部形成大量皱褶，气生菌丝稀少，产生由基部向顶变细的菌丝绳；背面无色素。MEA培养基，即麦芽提取物琼脂培养基(％，重量百分数):麦芽浸出粉2.0、蛋白胨
1.0、葡萄糖2.0、琼脂1.5，蒸馏水配制。显微形态鉴定:在光学显微镜(蔡司(Zeiss) Axioplan2型成像显微镜)下观察分生孢子梗特化不明显，细长，不分枝，宽1.5-2.5 μ m，长20-70 μ m。分生孢子多数柱状，无色透明，聚集成团，孢子长度变异幅度大，2.3-7.0X 1.5-2.0 μ m。无厚垣孢子。菌种显微图片如图1所示。rRNA基因序列鉴定:测序方法:提取紧密枝顶孢霉基因组DNA，利用鉴定引物进行PCR扩增，将扩增产物测序。具体如下:紧密枝顶孢霉DNA提取方法:(I)用解剖刀(挑针)从培养皿(试管斜面)中刮取少量菌丝(约0.2-0.5mg)，放入1.5ml离心管中；(2)加少量灭菌石英砂(与菌丝体积基本相同)和200 μ I 65°C水浴预热的CTAB抽提液(2% CTAB, 1.4M NaCl, 20mM EDTA, IOOmM Tris *HClpH8.0)，用研磨玻璃棒研磨至匀浆；(3)加入400 μ I预热CTAB抽提液，颠倒混匀后于65°C水浴0.5_lh ；(4)水浴完成后，将离心管在12000rpm室温条件下离心lOmin，取上清液至新离心
管中；(5)加入等体积的抽提溶液(Tris饱和酹:氯仿:异戍醇=25: 24:1),颠倒混匀50次；(6) 12000rpm室温条件下离心IOmin,取上清液至新离心管中；(7)可重复5、6步1-2次，视两相界面处杂质的多少而定；(8)加入等体积氯仿:异戊醇(24: I)，轻轻颠倒混匀50次；(9) 12000rpm室温条件下离心IOmin,取上清液至新离心管中；(10)向上清液中加入等体积异丙醇，轻轻颠倒混合均匀后于4°C或-20°C沉淀20min ；(11) 12000rpm室温条件下离心lOmin，弃去上清液，加500 μ I 70%乙醇溶液洗涤
两次；(12)倒出乙醇溶液后，短暂离心使管壁上的溶液汇集至管底，用移液器吸净，离心管敞口在室温干燥5min ；(13)加 50-10 0 μ I 无菌水或 TE 缓冲液(IOmM Tris.HCl，IM EDTA，pH8.0)溶解沉淀，-20°C条件下贮存备用。PCR 方法:
以紧密枝顶孢霉基因组DNA为模板，以ITS5和ITS4为上下游引物进行扩增，引物序列为:上游引物:1TS5，5，-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G_3，(SEQ ID NO:2);下游引物:ITS4，5，-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3，(SEQ ID NO:3)。PCR 条件为:95°C变性 3min，94°C解链 lmin，54°C复性 40s，72°C延伸 lmin，扩增 35个循环后72 C延伸IOmin,完成后广物在4 C下保存。测序:委托北京诺赛基因组研究中心有限公司进行测序，测序采用ABI3730xl测序仪及配套的BigDye终止者(Terminator)试剂盒进行。测序结果如下表I和SEQ ID NO:1所示，其包括18S rRNA片段，ITS1、5.8S rRNA、ITS2的全序列及28S区序列片段，测序引物是ITS4。


本发明涉及一种新的脂肪酶及其生产菌株，具体说，本发明脂肪酶是一种新的1，3-特异性脂肪酶，本发明生产菌株是紧密枝顶孢霉菌株2823。