专利名称：一种人工抗原递呈细胞及其在nk细胞扩增中的应用的制作方法NK细胞(natural killer cell，自然杀伤细胞)是一类大颗粒淋巴细胞，是机体初始(innate)免疫和后继(adaptive)免疫的重要桥梁，在机体抗感染性疾病和恶性肿瘤免疫监视过程中发挥重要的作用。继发性NK细胞移植能产生良好的抗肿瘤效应，而其自身很少被受体排斥，且不会引起任何GVHD(Graft Versus Host Disease)，因此，继发性NK细胞治疗(Adoptive NK cell therapy)已成为目前最热门和最有前途的恶性肿瘤治疗方法之ο尽管继发性NK细胞免疫治疗具有良好的抗肿瘤效应和巨大的应用前景，但NK细胞免疫治疗仍然难以进行常规临床应用，其中最主要障碍在于，在外周血淋巴细胞(PBMC) 中，NK细胞只是一个很小的群体，仅占人外周血淋巴细胞的10 15%，难以满足巨大的临床需要。为解决这一难题，首先要在数量上保证NK细胞的有效供给，因此，探索各种有效的NK 细胞体外扩增(Ex vivo expansion)方法已成为NK细胞免疫治疗的重要发展趋势。应用人工抗原递呈细胞(artificialantigen presenting cell, aAPC)作为饲养细胞(feeder cell)进行NK细胞体外扩增已成为NK细胞扩增的一种重要方法。在以往的研究中有研究者应用遗传修饰的K562细胞作为人工抗原递呈细胞，如应用4-1BBL (CD137L) 和膜固定IL15 (membrane-bound IL-15, mIL_15)转化的K562细胞进行NK细胞扩增，这种方法可以获得较高细胞毒性的NK细胞，但NK细胞增殖受到限制，5-6周后细胞不再扩增。
本发明的目的是，提供一种人工抗原递呈细胞。本发明的第二个目的是，提供一种人工抗原递呈细胞的制备方法。本发明的第三个目的是，提供一种人工抗原递呈细胞在NK细胞扩增中的应用。本发明的第四个目的是，提供一种NK细胞扩增方法。为了解决本发明第一个目的，本发明提供了一种人工抗原递呈细胞，所述人工抗原递呈细胞为4-lBBL-mIL-21-aAPC，其细胞膜表面稳定表达4-1BB配体和膜固定白介素21 (mIL-21)。作为一个优选，所述人工抗原递呈细胞为4-lBBL-mIL-21-K562细胞。为了解决本发明第二个目的，本发明提供了人工抗原递呈细胞的制备方法，包括以下步骤(1)构建4-1BBL表达的转座子；(2)4-lBBL转座子与转座酶SBll共转染相应细胞，流式细胞分选，获得4-1BBL稳定表达细胞 4-lBBL-aAPC ；(3)在步骤(2)获得的4-lBBL-aAPC基础上导入在细胞膜表面稳定表达的IL-21 (membrane-bound IL-21, mIL-21 )，建立 4-lBBL_mIL-21 -aAPC。作为一个优选，所述人工抗原递呈细胞为4-lBBL-mIL-21-K562细胞。为了解决本发明第三个目的，本发明提供了人工抗原递呈细胞在NK细胞扩增中的应用。为了解决本发明第四个目的，本发明提供了一种NK细胞扩增方法，利用上述人工抗原递呈细胞进行扩增，包括以下步骤(1)构建4-1BBL表达的转座子；(2)4-lBBL转座子与转座酶SBll共转染相应细胞，流式细胞分选，获得4-1BBL稳定表达细胞 4-lBBL-aAPC ；
(3)在步骤(2)获得的4-lBBL-aAPC基础上导入在细胞膜表面稳定表达的IL-21 (membrane-bound IL-21, mIL-21 )，建立 4-lBBL_mIL-21 -aAPC ；
(4)致死性照射或丝裂霉素处理步骤(3)获得的人工抗原递呈细胞，按2:1与外周血淋巴细胞混合，在NK细胞扩增培养液中共培育；
(5)1周后，重复刺激1次，连续数周，以获得足够量的NK细胞。作为一个优选，所述人工抗原递呈细胞为4-lBBL-mIL-21-K562细胞。本发明的优点在于，为建立一种高效和高细胞毒性的NK细胞体外扩增方法，我们通过在细胞膜表面稳定表达4-1BB配体(4-1BBL)和膜固定白介素21 (mIL_21 )，构建新型人工抗原递呈细胞4-lBBL-mIL-21 -aAPC,如4-lBBL-mIL-21_K562细胞，以此作为扩增的饲养细胞，从外周血淋巴细胞中直接扩增NK细胞。流式细胞分析、细胞毒性试验等表明所扩增的NK细胞纯度高和细胞毒性强，具有明显的肿瘤细胞杀伤效应。本发明提供的NK细胞扩增方法简单、易于操作；扩增效率好、纯度高；扩增持续时间长、肿瘤细胞杀伤效应明显。


图1为4-1BBL和mIL_21在4-lBBL-mIL_21- K562人工抗原递呈细胞中的表达。图2为4-lBBL-mIL-21-K562人工抗原递呈细胞所扩增NK细胞的纯度(W代表扩增周数)。图3 为 4-lBBL-mIL-21-K562 人工抗原递呈细胞与 4-lBBL-mIL-15- K562 人工抗原递呈细胞所扩增NK细胞的增殖比较。图4为NK细胞扩增前后的受体表达(W代表扩增周数，0 W代表扩增前细胞)。图5为4-lBBL-mIL-21-K562人工抗原递呈细胞与4-lBBL-mIL-15_K562人工抗原递呈细胞所扩增NK细胞的肿瘤细胞杀伤效率(扩增第21天，不同捐献者)。

做详细说明。实施例1、人工抗原递呈细胞4-lBBL-mIL-21_K562的制备方法
1.从 Open Biosysems (Thermo Fisher Scientific, CO, USA)购买 4-1BBL/PCR4 T0P0质粒，PCR扩增，然后插入GlySer-EGFP (CoOp)-pSBSO睡美人表达载体的Nhe I-XhoI位点，构建4-lBBL/pSBSO转座子。2.将4-lBBL/pSBSO转座子与转座酶SBll共转染K562细胞，流式细胞分选，获得 4-1BBL 稳定表达的 K562 细胞(4-1BBL-K562)。3.将 IL-21-Fc (CoOp)-pSBSO 与转座酶 SBll 共转染 4-1BBL-K562 细胞，流式细胞分选，建立4-lBBL-mIL-21-K562人工抗原递呈细胞。实施例2、NK细胞扩增方法
1.从 Open Biosysems (Thermo Fisher Scientific, CO, USA)购买 4-1BBL/PCR4 TOPO质粒，PCR扩增，然后插入GlySer-EGFP (CoOp)-pSBSO睡美人表达载体的Nhe I-XhoI 位点，构建4-lBBL/pSBSO转座子。2.将4-lBBL/pSBSO转座子与转座酶SBll共转染K562细胞，流式细胞分选，获得 4-1BBL 稳定表达的 K562 细胞(4-1BBL-K562)。3.将 IL-21-Fc (CoOp)-pSBSO 与转座酶 SBll 共转染 4-1BBL-K562 细胞，流式细胞分选，建立4-lBBL-mIL-21- K562人工抗原递呈细胞。4.将 IL-15-Fc (CoOp)-pSBSO 与转座酶 SBll 共转染 4-1BBL-K562 细胞，流式细胞分选，建立4-lBBL-mIL-15 -K562人工抗原递呈细胞。5.用淋巴细胞分离液分离人外周血淋巴细胞。6. IOOGy放射线照射构建的人工抗原递呈细胞。7.照射过的人工抗原递呈细胞与淋巴细胞按2:1混合，在含有10%FBS、1% P/S、2 mM L-谷氨酰胺、50U/ml IL-2的RPMI1640培养液中于5% CO2培养箱中共培育，每2天更
换新鲜培养基一次。8.每周按步骤6和7程序重复刺激扩增后细胞1次。9.在不同时间点，检测NK细胞纯度(见图2)、细胞数目(见图3)、表面受体表达(见图4)和对肿瘤细胞的杀伤效力(见图5)。通过构建新型人工抗原递呈细胞，以此作为扩增的饲养细胞，从外周血淋巴细胞中直接扩增NK细胞。流式细胞分析、细胞毒性试验等表明所扩增的细胞NK纯度高和细胞毒性强，具有明显的肿瘤细胞杀伤效应。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，如用其它类型的细胞 721. 221细胞等替代K562细胞，用其它方式实现4-1BBL和mIL_21在细胞膜表面的表达，对扩增条件和程序进行改进等等，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。


本发明提供了一种高效和高细胞毒性的自然杀伤(NK)细胞体外扩增方法，通过在细胞膜表面稳定表达4-1BB配体(4-1BBL)和膜固定白介素21(mIL-21)，构建新型人工抗原递呈细胞4-1BBL-mIL-21-aAPC，如4-1BBL-mIL-21-K562细胞等，以此作为扩增的饲养细胞，从外周血淋巴细胞中直接扩增NK细胞。流式细胞分析、细胞毒性试验等表明所扩增的细胞NK纯度高和细胞毒性强，具有明显的肿瘤细胞杀伤效应。