专利名称：Il－8受体拮抗剂的制作方法白介素-8(IL-8)有许多不同的名称，例如嗜中性粒细胞引诱剂/活化蛋白-1(NAP-1)、单核细胞衍生的嗜中性粒细胞趋化因子(MDNCF)、嗜中性粒细胞活化因子(NAF)和T-细胞淋巴细胞趋化因子。白介素-8是嗜中性粒细胞、嗜碱细胞和T-细胞亚类的化学引诱剂。它由多种有核细胞(包括与TNF、IL-1α、IL-1β或LPS接触的巨噬细胞、成纤维细胞、内皮和上皮细胞)产生，并可由接触LPS或趋化因子例如FMLP的嗜中性粒细胞本身产生，参见M.Baggiolini等，J.Clin.Invest.84，1045(1989)；J.Schroder等，J.Immunol.139，3474(1987)和J.Immunol.144，2223(1990)；Strieter等，Science 243，1467(1989)和J.Biol.Chem.264，10621(1989)；Cassatella等，J.Immunol.148，3216(1992)。GROα、GROβ、GROγ和NAP-2也属于趋化因子α家族。与IL-8一样，这些趋化因子也有不同的名称。例如GROα、β、γ分别被称为MGSAα、β和γ(黑色素瘤生长刺激活性)，参见Richmond等，J.Cell Physiology 129，375(1986)和Chang等，J.Immunol 148，451(1992)。在CXC基序之前直接具有ELR基序的α家族所有趋化因子均可与IL-8B受体结合。IL-8、GROα、GROβ、GROγ、NAP-2和ENA-78可在体外刺激多种功能。它们对嗜中性粒细胞均显示出化学引诱剂特性，而IL-8和GROα已被证实具有T-淋巴细胞和嗜碱细胞趋化活性。此外，IL-8还可诱导正常和特应性个体的嗜碱细胞释放组胺。GRO-α和IL-8还可诱导嗜中性粒细胞释放溶菌酶和呼吸爆发。IL-8还可增加Mac-1(CD11b/CD18)在嗜中性粒细胞上的表面表达，而无需全程蛋白质合成。这可归因于嗜中性粒细胞对血管内皮细胞的粘附力增加。许多已知的疾病均具有广泛性嗜中性粒细胞浸润的特征。由于IL-8、GROα、GROβ、GROγ和NAP-2可促进嗜中性粒细胞的积蓄和激活，这些趋化因子与多种急性和慢性炎性病症有关，这些病症包括牛皮癣和类风湿性关节炎，参见Baggiolini等，FEBS Lett.307，97(1992)；Miller等，Crit.Rev.Immunol.12，17(1992)；Oppenheim等，Annu.Rev.Immunol.9，617(1991)；Seitz等，J.Clin.Invest.87，463(1991)；Miller等，Am.Rev.Respir.Dis.146，427(1992)；Donnely等，Lancet 341，643(1993)。此外，ELR趋化因子(在CXC基序之前直接具有氨基酸ELR基序的趋化因子)还与出血素质(angiostasis)有关，Strieter等，Science 258，1798(1992)。在体外，IL-8、GROα、GROβ、GROγ和NAP-2通过结合和激活七跨膜受体、G-蛋白结合家族，特别是通过与IL-8受体、尤其B-受体结合，可诱导嗜中性粒细胞形状的改变、趋化性、颗粒释放和呼吸爆发。参见Thomas等，J.Biol.Chem.266，14839(1991)；和Holmes等，Science 253，1278(1991)。已开发出了该受体家族中的非肽类小分子拮抗剂。有关综述参见R.Freidinge Rin药物研究进展，40卷，33-98页，Birkhauser Verlag出版社，巴塞尔，1993年。因此，IL-8受体是新型抗炎剂开发的有前途的目标。已经表征了两种高亲和性的人IL-8受体(77％同源性)IL-8Rα，它仅对IL-8有高亲和性；和IL-8RB，它对IL-8以及GROα、GROβ、GROγ和NAP-2均有高亲和性。参见Holmes等，supra；Murphy等，Science 253，1280(1991)；Lee等，J.Biol.Chem.267，16283(1992)；LaRosa等，J.Biol.Chem.267，25402(1992)；和Gayle等，J.Biol.Chem.268，7283(1993)。本领域仍需要可与IL-8α或β受体结合的治疗性化合物。因此，与IL-8生成增加有关的病症(它与嗜中性粒细胞和T-细胞亚类趋化进入炎性部位有关)，将会因IL-8受体结合抑制剂化合物而受益。发明概述本发明提供治疗趋化因子介导的疾病的方法，其中趋化因子是可与IL-8α或β受体结合的趋化因子，所述方法包括给药有效量的式(I)化合物或及其可药用盐。具体地说，趋化因子为IL-8。本发明还涉及在有此需要的哺乳动物中抑制IL-8与其受体结合的方法，该方法包括将有效量的式(I)化合物给药所哺乳动物。
本发明所用的式(I)化合物具有如下结构 其中R选自OH，SH，和NHSO2Rd；Rd选自NR6R7，烷基，芳基C1-4烷基，芳基C2-4链烯基，杂芳基，杂芳基-C1-4烷基，杂芳基C2-4链烯基，杂环基，和杂环基C1-4烷基，其中芳基，杂芳基和杂环基均是任选取代的；R6和R7独立地为氢，或C1-4烷基，或R6和R7与其所连接的氮一起形成5-7元环，所述环任选包含另一个选自氧、氮或硫的杂原子，和所述环可以是任选取代的；R1独立地选自氢，卤素，硝基，氰基，卤素取代的C1-10烷基，C1-10烷基，C2-10链烯基，C1-10烷氧基，卤素取代的C1-10烷氧基，叠氮基，(CR8R8)qS(O)tR4，羟基，羟基C1-4烷基，芳基，芳基C1-4烷基，芳氧基，芳基C1-4烷氧基，杂芳基，杂芳烷基，杂环基，杂环基C1-4烷基，杂芳基C1-4烷氧基，芳基C2-10链烯基，杂芳基C2-10链烯基，杂环基C2-10链烯基，(CR8R8)qNR4R5，C2-10链烯基C(O)NR4R5，(CR8R8)qC(O)NR4R5，(CR8R8)qC(O)NR4R10，S(O)3H，S(O)3R8，(CR8R8)qC(O)R11，C2-10链烯基C(O)R11，C2-10链烯基C(O)OR11(CR8R8)qC(O)OR12，(CR8R8)qOC(O)R11，(CR8R8)qNR4C(O)R11，(CR8R8)qNHS(O)2R17，(CR8R8)qS(O)2NR4R5；或两个R1基团一起形成O-(CH2)sO-或5-6元不饱和环；q为0，或1-10的整数；t为0，或1或2的整数；s为1-3的整数；R4和R5独立地选自氢，任选取代的C1-4烷基，任选取代的芳基，任选取代的芳基C1-4烷基，任选取代的杂芳基，任选取代的杂芳基C1-4烷基，杂环基，和杂环基C1-4烷基，或R4和R5与其所连接的氮一起形成5-7元环，所述环任选包含另一个选自氧、氮或硫的杂原子；Y独立地选自氢，卤素，硝基，氰基，卤素取代的C1-10烷基，C1-10烷基，C2-10链烯基，C1-10烷氧基，卤素取代的C1-10烷氧基，叠氮基，(CR8R8)qS(O)tR4，羟基，羟基C1-4烷基，芳基，芳基C1-4烷基，芳氧基，芳基C1-4烷氧基，杂芳基，杂芳烷基，杂芳基C1-4烷氧基，杂环基，杂环基C1-4烷基；芳基C2-10链烯基，杂芳基C2-10链烯基，杂环基C2-10链烯基，(CR8R8)qNR4R5，C2-10链烯基C(O)NR4R5，(CR8R8)qC(O)NR4R5，(CR8R8)qC(O)NR4R10，S(O)3H，S(O)3R8，(CR8R8)qC(O)R11，C2-10链烯基C(O)R11，C2-10链烯基C(O)OR11，C(O)R11，(CR8R8)qC(O)OR12，(CR8R8)qOC(O)R11，(CR8R8)qNR4C(O)R11，(CR8R8)qNHS(O)2Rd，和(CR8R8)qS(O)2NR4R5；或两个Y基团一起形成O-(CH2)sO-或5-6元不饱和环；n为1-5的整数；m为1-4的整数；R8为氢或C1-4烷基；R10为C1-10烷基C(O)2R8；R11选自氢，C1-4烷基，任选取代的芳基，任选取代的芳基C1-4烷基，任选取代的杂芳基，任选取代的杂芳基C1-4烷基，任选取代的杂环基，和任选取代的杂环C1-4烷基；R12选自氢，C1-10烷基，任选取代的芳基和任选取代的芳烷基；和R17选自C1-4烷基，芳基，芳烷基，杂芳基，杂芳基C1-4烷基，杂环基，和杂环基C1-4烷基，其中芳基、杂芳基和杂环基是任选取代的。
发明详述式(I)化合物也可用于兽医治疗非人的哺乳动物，抑制IL-8或可与IL-8RA和RB受体结合的其他趋化因子。治疗性或预防性治疗动物趋化因子介导的疾病，包括下面“治疗方法”部分提及的那些疾病状态。
在此所用的下列术语涉及●“卤素”-所有卤素即氯、氟、溴和碘。
●“C2-5烷基”或“烷基”-如果对链长没有其他限制，是指具有2-5个碳原子的直链或支链基团，包括但不限于甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基，仲丁基，异丁基，叔丁基，正戊基等。
●“链烯基”-如果对链长没有限制，是指具有2-10个碳原子的直链或支链基团，包括但不限于乙烯基，1-丙烯基，2-丙烯基，2-甲基-1-丙烯基，1-丁烯基，2-丁烯基等。
●“芳基”-苯基和萘基；●“杂芳基”(指该基团本身或任一组合形式，例如“杂芳氧基”、或“杂芳烷基”)-5-10元芳香环系，其中的一个或多个环含有一个或多个选自N、O或S的杂原子，例如但不限于吡咯、吡唑、呋喃、噻吩、喹啉、异喹啉、喹唑啉、吡啶、嘧啶、噁唑、噻唑、噻二唑、三唑、咪唑或苯并咪唑。
●“杂环基”(指该基团本身或任一组合形式，例如“杂环烷基”)-饱和或部分不饱和4-10元环系，其中的一个或多个环含有一个或多个选自N、O或S的杂原子，例如但不限于吡咯烷、哌啶、哌嗪、吗啉、四氢吡喃或咪唑烷。
●“芳烷基”或“杂芳烷基”或“杂环烷基”-除非另有说明，是指连接有上述定义的芳基、杂芳基或杂环基的如上述定义的C1-10烷基。
本发明优选的化合物选自1)3-(4-氰基-2-羟基苯胺基)-4-(2-溴苯胺基)-环丁-3-烯-1，2-二酮；2)3-(4-氰基-2-羟基苯胺基)-4-(2-氯苯胺基)-环丁-3-烯-1，2-二酮；3)3-(4-氰基-2-羟基苯胺基)-4-(2，3-二氯苯胺基)-环丁-3-烯-1，2-二酮；4)3-(4-硝基-2-羟基苯胺基)-4-(2-溴苯胺基)-环丁-3-烯-1，2-二酮；和5)3-(4-氯-2-羟基苯胺基)-4-(2-溴苯胺基)-环丁-3-烯-1，2-二酮。
制备方法采用下面反应图解所示的合成方法，可制得(I)化合物。这些反应图解提供的合成方法，可用来制备具有不同R、R1和芳基的式(I)化合物，它采用经适宜保护的任选取代基进行反应，使在此所列的反应具有一定的兼容性。在这些情况下，随后进行脱保护即可得到具有一般所公开性质的化合物。一旦建立了胍母核，即可采用本领域熟知标准的官能团互换技术来制备这些结构式的其他化合物。尽管反应图解中列出了多种式(I)化合物，但它仅以说明为目的。
反应图解1 a)Br2，NaOAc，HOAc；b)CuCN，DMF，回流；C)(BOC)2O，DMAP，TEA；d)K2CO3，MeOH；e)TFA可由市售的苯并噁唑啉酮1-图解-1制备所需的苯胺6-图解-1。采用标准溴化条件(例如，溴和醋酸钠在醋酸中)，可由苯并噁唑啉酮1-图解-1制得溴化物2-图解-1。采用标准方法，例如氰化铜(I)在DMF中回流，可将溴化物2-图解-1转化成氰化物3-图解-1。采用标准条件，例如在二氯甲烷或其他适宜的有机溶剂中的BOC酸酐和三乙胺与催化量的二甲基氨基吡啶，可将酰胺3-图解-1转化成BOC保护的化合物4-图解-1。在标准条件例如乙醇中的碳酸钾下，将噁唑啉酮4-图解-1水解成苯酚5反应图解-1，然后在标准条件下例如在二氯甲烷或其他适宜有机溶剂中的三氟乙酸下，脱去BOC保护基，即可得到所需的苯胺6-图解-1。
反应流程2 a.)PivCl，TEA；b.)i.BuLi(2eq)，THF，-40℃；ii.HCI；C.)H2SO4，H2O。
另外，也可采用反应图解2所示方法可制备所需的取代的羟基苯胺4。在本领域已知的标准条件下，例如在适宜有机溶剂例如二氯甲烷中的新戊酰氯(pivavolyl Chloride)和三乙胺中，可将市售取代的3-氯苯胺1转化成酰胺2。在反应温度-20～-40℃下，采用过量的强碱例如适宜的有机溶剂例如THF中的丁基锂处理，然后进行质子化(protic workup)，可将酰胺2转化成苯并噁唑3。采用本领域已知的标准水解条件例如在水中的硫酸和在85℃加热，可由苯并噁唑4得到所需的羟基苯胺5。
反应流程3
可由反应图解3所示的市售二羟基环丁烯二酮(squarate)二甲醚1制得结构5化合物。在回流乙醇或其他适宜有机溶剂中，二羟基环丁烯二酮二甲醚1与所需的苯胺2反应，可获得中间体3。在回流乙醇或其他适宜有机溶剂中，环丁烯二酮3与另一苯胺4反应，可获得所需的环丁烯二酮化合物5。
合成实施例参考下列实施例描述本发明，这些实施例只说明而不是限制本发明的范围。除非另有说明，所有温度以摄氏度表示，所有溶剂具有最高纯度，并且所有反应均在氩气氛中的无水条件下进行。
在实施例中，所有温度以摄氏度(℃)表示。除非另有说明，采用快速原子轰击在VG Zab质谱仪上进行质谱分析。采用Bruker AM 250或Am 400光谱仪，记录250MHz的1H-NMR(以下称″NMR″)光谱数据。
所示的多重性是s＝单峰、d＝双重峰、t＝三重峰、q＝四重峰、m＝多重峰，br＝宽峰信号，Sat.表示饱和溶液，eq表示试剂与主要反应物的摩尔当量比。
实施例1合成3-(4-氰基-2-羟基苯胺基)-4-(2-溴苯胺基)-环丁-3-烯-1，2-二酮3-甲氧基-4-(2-溴苯胺基)-环丁-2-烯-1，2-二酮向在乙醇(1mL)中的3，4-二甲氧基环丁-2-烯-1，2-二酮(1mmol)溶液中加入2-溴苯胺(1mmol)。反应完全后，反应混合物浓缩和经重结晶或色谱法纯化，得到3-甲氧基-4-(2-溴苯胺基)-环丁-2-烯-1，2-二酮。3-(4-氰基-2-羟基苯胺基)-4-(2-溴苯胺基)-环丁-3-烯-1，2-二酮向在乙醇(1mL)中3-甲氧基-4-(2-溴苯胺基)-环丁-2-烯-1，2-二酮(1mmol)的溶液中加入4-氰基-2-羟基苯胺基(1mmol)。反应完全后，反应混合物浓缩和经重结晶或色谱法纯化，得到3-(4-氰基-2-羟基苯胺基)-4-(2-溴苯胺基)-环丁-3-烯-1，2-二酮治疗方法式(I)化合物或其可药用盐可用于生产预防性或治疗性治疗人或其他哺乳动物的任何疾病状态的药物，所述疾病可因所述哺乳动物细胞产生了过量或无规(unregulated)IL-8细胞因子或者与IL-8α或β受体(也称I型或II型受体)结合的其他趋化因子而加据或引起，其中哺乳动物细胞例如但不限于单核细胞和/或巨噬细胞。
因此，本发明还提供治疗趋化因子介导的疾病的方法，其中趋化因子是与IL-8α或β受体结合，该方法包括给药有效量的式(I)化合物或其可药用盐。具体地说，趋化因子为IL-8、GROα、GROβ、GROγ、NAP-2或ENA-78。
当用于这一目的时，由于式(I)化合物可以互换，式(I)和(II)化合物的剂量和制剂相同。
式(I)化合物以足以抑制细胞因子(尤其IL-8、GROα、GROβ、GROγ、NAP-2或ENA-78)功能的量给药，以至将所述细胞因子生物学下调节至正常生理功能水平，或者在某些情况下降至亚正常水平，以便改善疾病状态。在本发明中，IL-8、GROα、GROβ、GROγ、NAP-2或ENA-78的异常水平例如是指(i)游离IL-8的水平大于或等于1pg/mL；(ii)与IL-8、GROα、GROβ、GROγ、NAP-2或ENA-78有关的任何细胞高于正常生理水平；或(iii)IL-8、GROα、GROβ、GROγ、NAP-2或ENA-78的水平分别高于细胞或组织中的IL-8、GROα、GROβ、GROγ、NAP-2或ENA-78的基础水平。
许多疾病状态可因过量或无规IL-8的产生而引起和/或加剧。趋化因子介导的疾病包括牛皮癣，特应性皮炎，骨关节炎，类风湿性关节炎，哮喘，慢性梗阻性肺病，成人呼吸窘迫综合征，炎性肠病，Crohn氏病，溃疡性结肠炎，卒中，脓毒性的休克，多发性硬化症，内毒素休克，革兰氏阴性脓毒症，中毒性休克综合征，心脏和肾脏再灌注损伤，肾小球性肾炎，血栓形成，移植物对抗宿主反应，Alzheimer病，同种移植物排斥，疟疾，再狭窄，血管生成，动脉粥样硬化，骨质疏松症，齿龈炎和由呼吸性病毒、疱疹病毒和肝炎病毒引起的不希望的造血干细胞释放和疾病，脑膜炎，囊性纤维化，不足月分娩，咳嗽，瘙痒症，多器官功能障碍，创伤，劳损，挫伤，挫伤，银屑病关节炎，疱疹，脑炎，CNS脉管炎，创伤性脑损伤，CNS瘤，蜘蛛膜下腔出血，手术后创伤，间质性肺炎，高敏性，结晶诱导的关节炎，急性和慢性胰腺炎，急性酒精性肝炎，坏死性小肠结肠炎，慢性窦炎，葡萄膜炎，多肌炎，脉管炎，痤疮，胃和十二指肠溃疡，乳糜泻，食管炎，舌炎，气流梗阻，气道高反应性，闭塞性细支气管炎伴机化性肺炎，支气管扩张，细支气管炎，闭塞性细支气管炎，慢性支气管炎，肺源性心脏病，呼吸困难，肺气肿，高碳酸血症，充气过度，低氧血症，氧过多诱发的炎症，低氧症，肺容量削减手术，肺纤维症，肺性高血压，右心室肥大，肉状瘤病，小气道(small airway)疾病，通气与血流灌注比值失调，喘鸣，感冒和狼疮。
这些疾病的主要特征是存在大量的嗜中性粒细胞浸润、T-细胞浸润或新血管生长，并与IL-8、GROα、GROβ、GROγ、NAP-2或ENA-78的生成增加(可引起嗜中性粒细胞趋化至炎性部位或内皮细胞定向生长)有关。与其他炎性细胞因子(IL-1、TNF和IL-6)相反，IL-8、GROα、GROβ、GROγ、NAP-2或ENA-78具有促进嗜中性粒细胞趋化性、酶释放(包括但不限于弹性蛋白酶释放)以及超氧化物生成和激活的独特性质。α-起化因子，特别是通过IL-8I或II型受体起作用的GROα、GROβ、GROγ，NM-2或ENA-78，可通过促进内皮细胞的定向生长而促进肿瘤的新血管形成。因此，对IL-8诱导的趋化性或激活的抑制，可直接减少嗜中性粒细胞浸润。
最近的证据也表明了趋化因子在治疗HIV感染中的作用，Littleman等，Nature 381，661页(1996)和Koup等，Nature 381，667页(1996)。
现有证据也表明了IL-8抑制剂在治疗动脉粥样硬化中的用途。第一个参考是Boisvert等，J.Clin.Invest，1998，101353-363，该论文表明通过骨髓移植，干细胞上不存在IL-8受体(在单核细胞/巨噬细胞上也如此)，可导致LDL受体缺陷小鼠中动脉粥样硬化斑块的发展减少。其他支持性的参考文献包括Apostolopoulos，等，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.1996，161007-1012；Liu，等，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol，1997，17317323；Rus，等，Atherosclerosis.1996，127263-271.；Wang等，J.Biol.Chem.1996，2718837-8842；Yue，等，Eur.J.Pharmacol.1993，24081-84；Koch，等，Am.J.Pathos.1993，1421423-1431.；Lee，等，Immunol.Lett.，1996，53，109113.；和Terkeltaub等，Arterioscler.Thromb.，1994，1447-53。
本发明也提供通过式(I)趋化因子受体拮抗剂化合物用于治疗和预防那些易患CNS损伤的个体急性发作的方法。
在此定义的CNS损伤包括例如因外科手术引起的开放性或贯通性头部创伤，或例如因头部区域损伤所致的闭合性头部创伤损伤。该定义也包括局部缺血性卒中，尤其是脑部卒中。
局部缺血性卒中可定义为因向特定脑区供血不足所致的灶性神经病学病症，通常是栓塞物、血栓或血管局部动脉粥硬化闭合的结果。炎性细胞因子已经显示出在该区域中的作用，而本发明提供了能治疗这些损伤的有效方法。对这些急性损伤进行相对短暂的治疗是有效的。
TNF-α是具有致炎作用的细胞因子，包括内皮白细胞粘着分子表达。白细胞浸润到局部缺血性脑损伤中，因此抑制或降低TNF水平的化合物可用来治疗局部缺血性脑损伤。参见Liu等，Stroke，25卷，7期，1481-88页(1994)，其公开内容在这里引用作为参考。
Shohami等在J.of Vaisc & Clinical Physiology and Pharmacology，3卷，2期，99-107页(1992)中论述了闭合性头部损伤模型以及用混合的5-LO/CO剂治疗，其公开内容引用作为参考。业已发现，用来减少水肿形成的治疗可改善受治疗动物的功能性结果。
式(I)化合物的给药量，应足以抑制IL-8与IL-8α或β受体结合，这种抑制作用由嗜中性粒细胞趋化性和激活的降低来证明。式(I)化合物可用作IL-8结合抑制剂的发现，是基于式(I)化合物在本文所述体外受体结合试验中的作用而确定的。试验表明式(I)化合物是II型IL-8受体的抑制剂。
在此所用的术语“IL-8介导的疾病或疾病状态”是指IL-8、GROα、GROβ、GROγ、NAP-2或ENA-78通过本身产生IL-8、GROα、GROβ、GROγ、NAP-2或ENA-78，或者通过IL-8、GROα、GROβ、GROγ、NAP-2或ENA-78引起另一单核因子(例如但不限于IL-1、IL-6或TNF)释放而起作用的任何及所有疾病。例如，以IL-1为主要构成以及其生成或作用可因IL-8而加重或分泌(secreted)的疾病状态，可认为是由IL-8介导的疾病状态。
在此所用的术语“趋化因子介导的疾病或疾病状态”是指其中结合IL-8α或β受体的趋化因子(例如但不限于IL-8、GROα、GROβ、GROγ、NAP-2或ENA-78)起作用的任何及所有疾病状态。这包括其中IL-8通过本身产生IL-8或者通过IL-8引起另一单核因子(例如但不限于IL-1、IL-6或TNF)释放而起作用的任何及所有疾病。例如，以IL-1为主要构成以及其生成或作用可因IL-8而加重或分泌的疾病状态，可认为是由IL-8介导的疾病状态。
在此所用的术语“细胞因子”是指影响细胞功能的任何分泌的多肽分子，它可调节免疫、炎症或造血反应中的细胞间相互作用。细胞因子包括但不限于单核因子和淋巴因子(无论是什么细胞生成的)。例如，单核因子通常是指由单核细胞例如巨噬细胞和/或单核细胞生成和分泌的。但是，许多其他细胞例如天然杀伤细胞、成纤维细胞、嗜碱细胞、嗜中性粒细胞、内皮细胞、脑星形细胞、骨髓间质细胞、上皮角质细胞和B-淋巴细胞，也可生成单核因子。淋巴因子通常是指由淋巴细胞生成的。示例性细胞因子包括但不限于白介素-1(IL-1)，白介素-6(IL-6)，白介素8(IL-8)，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和肿瘤坏死因子β(TNF-β)。
在此所用的术语“趋化因子”是指影响细胞功能的任何分泌的多肽分子，与上述“细胞因子”一样，它可调节免疫、炎症或造血反应中的细胞间相互作用。趋化因子主要是通过细胞跨膜分泌的，它可引起特异性白细胞和白细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、T-细胞、B-细胞、内皮细胞和平滑肌细胞的趋化性和激活。示例性趋化因子包括但不限于IL-8、GROα、GROβ、GROγ、NAP-2、ENA-78、IP-10、MIP-1α、MIP-β、PF4以及MCP1、2和3。
本发明化合物也可用于使白细胞计数正常化，也可以使循环的趋化因子水平正常化。
为了将式(I)化合物或其可药用盐用于治疗，通常采用标准的制药技术将其配制成药物组合物。因此，本发明还涉及药物组合物，其中包括有效且非毒性量的式(I)化合物和可药用载体或稀释剂。
可经任何适于给药的途径方便地给药式(I)化合物、其可药用盐以及药物组合物，例如，可经口服、局部、非肠道或吸入给药。采用常规剂型可给药式(I)化合物，其中将式(I)化合物与标准药用载体以常规方法混合，即可制得常规剂型。还可将常规剂型中的式(I)化合物与另一已知的治疗活性化合物共同给药。这些方法包括混和、制粒和压制或适当溶解各成分，即可得到所需制剂。可以理解，可药用载体或稀释剂的形式和特性取决于与其混合的活性成分的量、给药途径和其他已知因素。从与制剂中其他成分的配伍性以及对接受者无毒的角度来说，载体必须是“可接受的”。
可采用固体或液体药用载体。示例性固体载体为乳糖、石膏粉、蔗糖、滑石粉、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯胶、硬脂酸镁、硬脂酸等。示例液体载体为糖浆、花生油、橄榄油、水等。同样地，载体或稀释剂包括本领域中已知的延时材料，例如单用甘油单硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯或与蜡联用。
可采用多种制剂形式。因此，如果采用固体载体，制剂可包括片剂、装入硬明胶胶囊中的粉剂或小丸、或者是锭剂或糖锭。固体载体的用量可以很大变化，但是优选约为25mg-1g。如果采用液体载体，制剂可以呈糖浆剂、乳剂、软明胶胶囊、无菌注射用液体例如安瓿或非水性液体混悬剂等形式。
式(I)化合物可以局部给药，即非全身给药。这包括将式(I)化合物由体外给药到表皮或口腔中，或者将所述化合物滴入耳、眼和鼻中，这样化合物就不会显著地进入血流。相反地，全身给药是指经口服、静脉内、腹膜内和肌内给药。
适于局部给药的制剂包括适于穿透皮肤达到炎症部位的液体或半液体制剂，例如搽剂、洗剂、乳膏、软膏或糊剂，和适于耳、眼和鼻内给药的滴剂。对于局部给药，活性成分占制剂重量的0.001％-10％w/w，例如1％-2％。也可包括多达10％w/w的活性成分，但是优选不超过5％w/w，更优选占制剂重量的0.1％-1％w/w。
本发明洗剂包括那些适于皮肤或眼部给药的洗剂。洗眼剂包括任选包含杀菌剂的无菌水溶液，可按类似于制备滴剂的方法制得。皮肤用的洗剂或搽剂可包括促干剂和皮肤凉爽剂，例如酒精或丙酮，和/或保湿剂例如甘油或油类例如蓖麻油或花生油。
本发明乳膏、软膏或糊剂是含有活性成分的外用半固体制剂。将细碎或粉状活性成分，单独或以水或非水液体中的溶液或混悬液与油脂性或非油脂性基质混合(可采用适宜的机械)，即可制得上述制剂。所述基质包括烃类例如硬、软或液体石蜡，甘油，蜂蜡、金属皂；胶浆；天然来源的油类例如杏仁油、玉米油、花生油、蓖麻油或橄榄油；羊毛脂及其衍生物，或脂肪酸例如硬脂酸或油酸与醇例如丙二醇或聚乙二醇(macrogel)。制剂中可掺入任何适宜的表面活性物质，例如阴离子、阳离子或非离子型表面活性剂，例如脱水山梨酯或聚氧乙烯及其衍生物。还可以包括助悬剂例如天然树胶、纤维素衍生物，或无机材料例如二氧化硅(silicaceous silicas)，和其他成分例如羊毛脂。
本发明滴剂包括无菌水性或油性溶液或混悬液，将活性成分溶于含有杀菌剂和/或杀真菌剂和/或任何其他适宜的防腐剂的适宜水溶液中即可制得，其中优选包括表面活性剂。然后可将所得溶液经过滤澄清，再移至适宜的容器中并密封，然后用高压灭菌法或保持98-100℃半小时进行灭菌。另外，也可采用无菌操作，将溶液经过滤灭菌并移至容器中。适于包含在滴剂中的示例性杀菌剂和/或杀真菌剂是硝酸苯汞或醋酸苯汞(0.002％)、苯扎氯铵(0.01％)和醋酸洗必太(0.01％)。适于制备油性溶液的溶剂包括甘油、稀酒精和丙二醇。
式(I)化合物也可经非肠道给药，即经静脉内、肌内、皮下、鼻内、直肠内、阴道内或腹膜内给药。非肠道给药优选采用皮下和肌内途径。采用常规技术即可制得适于非肠道给药的剂型。式(I)化合物也可经吸入给药，即经鼻内和口腔吸入给药。采用常规技术，即可制得适于这种给药方法的适宜剂型例如气雾剂制剂或计量吸入剂。
对于本发明式(I)化合物这里所公开的所有使用方法，每日口服剂量方案优选约为0.01-80mg/kg总体重。每日非肠道剂量方案约为0.001-80mg/kg总体重。每日局部给药剂量方案优选为0.1mg-150mg，每日给药1-4次，优选每日2或3次。每日吸入剂量方案优选约为0.01-1mg/kg/日。本领域普通技术人员可以理解，式(I)化合物及其可药用盐的最佳用量和单个剂量间隔取决于所治疗病症的性质和严重程度、给药的形式、途径以及部位、和所治疗的具体患者，通过常规技术即可确定所述的最佳量。本领域普通技术人员还可以理解的是，本领域普通技术人员根据常规疗程测定实验即可确定最佳疗程，即式(I)化合物或其可药用盐在指定天数内每日给药的次数。
下面将参考生物学实施例描述本发明，这些实施例只是说明而不是限制本发明的范围。
生物学实施例通过下列体外试验，确定本发明化合物对IL-8和Gro-α趋化因子的抑制作用受体结合试验[125I]IL-8(人重组体，来自Amersham公司，Arlington Heights，IL)，比活性为2000Ci/mmol。Gro-α来自NEN-New England Nuclear。所有其他化学制品均为分析纯。按已有方法(Holmes，等，Science，1991，253，1278)，用中国仓鼠卵巢细胞分别表达高水平的人重组体IL-8型α和β受体。按已有方法(Haour，等，J Biol Chem.，249，2195-2205页(1974))，将中国仓鼠卵巢细胞膜匀化。与其不同的是，将匀化缓冲液换成10mM Tris-HCL、1mMMgSO4、0.5mM EDTA(乙二胺四乙酸)、1m MPMSF(α-甲苯磺酰氟)、0.5mg/L亮肽素，pH7.5。以牛血清白蛋白为标准，采用Pierce Co.的微型试验试剂盒，测定膜蛋白质浓度。所有试验均在96-孔微量反应板中进行。每一反应混合物均含有在20mM Bis-Trispropane和0.4mM Tris HCl缓冲液中的125IIL-8(0.25nM)或125I Gro-α和0.5μg/mLIL-8Rα或1.0μg/mL IL-8Rβ膜，所述缓冲液的pH为8.0，其中含有1.2mM MgSO4、0.1mM EDTA、25mM NaCl和0.03％CHAPS。另外，加入待试药物或化合物(预溶解于DMSO中)，使其终浓度达到0.01nM-100nM。加入125I-IL-8开始试验。室温反应1小时后，用Tomtec 96-孔收集器将平板收集到用1％聚乙烯亚胺/0.5％BSA封闭的玻璃纤维滤垫上，然后用25mM NaCl、10mM TrisHCl、1mM MgSO4、0.5mMEDTA、0.03％CHAPS(pH7.4)洗涤3次。干燥滤器，用Beta plate液体闪烁计数器计数。本文将重组体IL-8Rα或I型受体称为非允许受体，将重组体IL-8Rβ或II型受体称为允许受体。
试验表明，在IL-8受体抑制的允许模型中，合成化学部分实施例1-15所列的所有示例性式(I)化合物的IC50约为45μg/mL至小于1μg/mL。当然也发现实施例1-12中的试验化合物也是同样水平的Gro-α结合抑制剂。趋化性试验按免疫学通用方法(Current Protocols in Immunology)第I卷，增刊1，6.12.3.单元中所述方法(其公开内容全部引入作为参考)，用嗜中性粒细胞趋化性试验测定这些化合物的体外抑制特性。按免疫学通用方法第I卷，增刊1，7.23.1.单元中所述方法(其公开内容全部引入作为参考)，从人血液中分离出嗜中性粒细胞。将化学引诱剂IL-8、GROα、GROβ、GROγ和NAP-2置于48孔的多孔室(Neuro Probe，Cabin John，MD)的底部室中，浓度为0.1-100nM。两个室间用5μm聚碳酸酯过滤器隔开。当检测本发明化合物时，将细胞加入上部室之前，将化合物与细胞(0.001-1000nM)混合。在含有5％CO2的加湿恒温箱中，于37℃约保温45-90分钟。在保温结束时，除去聚碳酸酯膜并洗涤顶侧后，用Diff快速染色法(Baxter Products，McGawPark，IL，美国)对膜进行染色。通过显微镜用内服计数已经趋化成趋化因子的细胞。通常，每个样品计数4个区，将这些数字平均得到已迁移细胞的平均数。每个样品试验三次，每个化合物重复至少4次。某些细胞(阳性对照细胞)中未加入化合物，这些细胞代表细胞的最大趋化反应。在需要阴性对照(未刺激的)的情况下，不向底部室中加入趋化因子。阳性对照与和阴性对照间的差异代表细胞的趋化活性。弹性蛋白酶释放试验该实验检测了本发明化合物抑制从人嗜中性粒细胞中释放弹性蛋白酶的能力。按免疫学通用方法第I卷，增刊1，7.23.1.单元中所述方法(其公开内容全部引入作为参考)，从人血液中分离出嗜中性粒细胞。将悬浮在林格溶液(NaCl 118，KCl 4.56，NaHCO325，KH2PO41.03，葡萄糖11.1，HEPES5mM，pH7.4)中的PMNs 0.88×106细胞置于体积为50μl的96孔平板的每个孔中。向该平板中加入体积为50μl的待试化合物(0.001-1000nM)、50μl细胞松弛素B(20μg/ml)和50μl林格缓冲液。将这些细胞加热5分钟(37℃，5％CO2，95％相对湿度)，然后加入终浓度为0.01-1000nM的IL-8、GROα、GROβ、GROγ、NAP-2。反应进行45分钟，然后将96孔平板离心(800xg 5分钟)，取出100μl上清液。将上清液加至另一96孔平板中，然后加入溶于磷酸缓冲盐水中的终浓度为6μg/ml的人工弹性蛋白酶底物(MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Val-AMC，Nova Biochem，La Jolla，CA)。按照Nakajima等在J.Biol Chem254，4027(1979)中描述的方法，立即将平板置于荧光的96孔平板阅读器(Cytofluor 2350，Millipore，Bedford，MA)上，并以3分钟的间隔收集数据。通过测定MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Val-AMC的降解率，可计算出从PMNs中释放的弹性蛋白酶量。创伤性脑损伤中TNF-α试验该实验用来检测大鼠实验性诱导的旁侧液体撞击外伤性脑损伤(TBI)后，在大鼠的特定脑区域中肿瘤坏死因子mRNA的表达。成年Sprague-Dawley大鼠(n＝42)用戊巴比妥钠麻醉(60mg/kg，i.p.)，并集中在左颞顶叶皮层(n＝18)进行中等程度(2.4atm.)的外侧液体撞击(lateral fluid-percussion)脑损伤，或者进行“假”治疗处理(麻醉和无损伤的手术，n＝18)。在损伤后的1、6和24小时，将动物断头处死，取出脑，并制备左壁(受损)顶叶皮层(LC)、对侧右壁皮质(RC)对应的区域、受损顶叶皮层(LA)邻近的皮质、右壁皮质(RA)对应的区域、左海马(LH)和右海马(RH)的组织样品。分离总RNA，进行RNA印迹杂交，并相对于TNF-α阳性对照RNA(巨噬细胞＝100％)进行定量分析。在损伤1小时后，在受损伤半球的LH(阳性对照的104±17％，与假处理组比较，p＜0.05)、LC(105±21％，p＜0.05)和LA(69±8％，p＜0.01)中，均观察到TNF-αmRNA表达明显增加。在损伤6小时后，在受损伤半球的LH(46±8％，p＜0.05)、LC(30±3％，p＜0.01)和LA(32±3％，p＜0.01)也观察到TNF-αmRNA表达增加，但是在受损24小时，这种增加出现消退。在损伤1小时后，在对侧半球的RH(46±2％，p＜0.01)、RC(4±3％)和RA(22±8％)均观察到TNF-αmRNA表达增加，在损伤6小时后，在RH(28±11％)、RC(7±5％)和RA(26±6％，p＜0.05)也观察到TNF-αmRNA表达增加，但是在受损24小时后未观察到这种增加。在任何时候，在假(无损伤手术)或幼年动物的两个半球的6个脑部区域任一中均未观察到TNF-αmRNA表达出现变化。这些结果表明，在侧矢状(parasagittal)旁侧液体撞击脑损伤后，TNF-αmRNA的短暂表达在特定的脑区域出现了变化，包括在非创伤半球中的表达。由于TNF-α能诱导神经生长因子(NGF)并能刺激激活的星形细胞释放其他细胞因子，所以TNF-α基因表达的这种创伤后改变在对CNS创伤的急性和再生性反应中均有着重要的作用。IL-6mRNA的CNS损伤模型该试验表征了实验性诱导的旁侧液体撞击外伤性脑损伤(TBI)后，在大鼠的特定脑区域中白介素-1β(IL-1β)mRNA的局部表达。成年Sprague-Dawley大鼠(n＝42)用戊巴比妥钠麻醉(60mg/kg，i.p.)，并集中在左颞顶叶皮层(n＝18)进行中等程度(2.4atm.)的旁侧液体撞击脑损伤，或者进行“假”治疗处理(麻醉和无损伤的手术)。在损伤后的1、6和24小时，将动物处死并取出脑，然后制备左壁(受损)顶叶皮层(LC)、对侧右壁皮质(RC)对应的区域、受损顶叶皮层(LA)邻近的皮质、右壁皮质(RA)对应的区域、左海马(LH)和右海马(RH)的组织样品。分离总RNA，进行RNA印迹杂交，并用IL-1β阳性巨噬细胞RNA(负载于相同的凝胶上)的相对放射活性(％)表示脑组织IL-1βmRNA的量。在损伤1小时后，在受损伤半球的LC(阳性对照为20.0±0.7％，n＝6，与假处理组比较p＜0.05)、LH(24.5±0.9％，p＜0.05)和LA(21.59±3.1％，p＜0.05)中，均观察到IL-1βmRNA表达显著增加，这在损伤6小时后仍保持增加(LC4.0±0.4％，n＝6，p＜0.05；LH5.0±1.3％，p＜0.05)。在假处理或幼年动物中的任一相应脑部区域中均未观察到IL-1βmRNA表达。这些结果表明，在TBI后，局部刺激了IL-1βmRNA在特定脑区域的短暂表达。细胞因子例如IL-1β的这些局部变化在创伤后起到一定作用。
本说明书中引用的所有出版物，包括但不限于专利和专利申请，均引入作为参考文献，如同每一出版物具体地、单独地如上所述引入一样。
上面说明全部公开了本发明及其优选实施方案。针对本文具体公开的实施方案所作的修改和改进均在下述权利要求范围内。无需进一步说明，应当理解本领域技术人员可以利用上文的描述全部实现本发明。因此，上述实施例只在说明本发明，但并不对本发明的范围作任何限制。要求保护专有特权的本发明的实施方案限定如下。


本发明涉及二苯胺基环丁烯二酮在治疗趋化因子白介素－8(IL－8)介导的疾病中的新用途。