专利名称：IL-24-Tat PTD融合蛋白及其构建方法和应用的制作方法IL-24-Tat PTD融合蛋白及其构建方法和应用本发明属于生物技术领域，具体涉及一种新的融合蛋白及其在肿瘤治疗中的应用。白细胞介 素24 (Interleukin 24，IL-24)又称为黑色素瘤分化相关基因 7 (Melanomadifferentiation associated gene 7，MDA_7)，是 Jiang等用消减杂交分析法， 从重组的纤维母细胞干扰素和蛋白激酶C活化剂密执毒素(mezerrein，MEZ)共同处理的黑色素瘤细胞株中筛选发现的一个高表达基因。后续的研究发现，将该基因导入多种肿瘤中后可引起肿瘤细胞生长阻滞和凋亡，降低肿瘤细胞克隆的形成。由此证明它是一种新的抑癌基因。随着对MDA-7研究的深入，根据该基因的结构、染色体定位、氨基酸序列同源性以及具有细胞因子样的特征，MDA-7被重新命名为IL-24，归属于IL-IO家族。IL-24表达于正常胸腺、脾和外周血液等免疫组织器官中的单核细胞、巨噬细胞、T 淋巴细胞、B淋巴细胞和NK细胞。在人的外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclear cells, PBMC)中，主要是活化的T淋巴细胞和单核细胞表达IL-24 ；增殖活跃的正常黑色素细胞、早期黑色素瘤细胞和皮肤的平滑肌细胞也能检测到IL-24表达，而在晚期黑色素瘤细胞中IL-24表达降低或缺失，转移性黑色素瘤细胞IL-24表达缺失。很多体内、外实验结果证实，IL-24可通过诱导凋亡来抑制黑素瘤、恶性胶质瘤、 骨肉瘤和乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌等多种癌细胞的生长而不损害正常细胞，且其抑制肿瘤生长作用不依赖于该类细胞中P53、pRB及p21等抑癌基因的活性状态。除能诱导肿瘤细胞凋亡外，IL-24还具有其他生物学功能如抗血管生成、免疫调节，增加放疗和化疗敏感性等。但是在慢性淋巴细胞白血病B细胞中，IL-24呈现高表达，其机理是促进p38 MAPK的磷酸化，保护和促进了肿瘤细胞的生长。IL-24的生物学功能可以通过其受体来发挥作用。与IL-IO家族的其他蛋白一样，IL-24蛋白能够与II型细胞因子受体 IL-20RA/IL-20RB 和 IL-22R/IL-20RB 受体结合，从而激活 JAK/STAT (Janus familykinase/ signal transducer and activator of transcription, JAK/STAT)通路。高表达 IL-20R 和IL-22R并不能明显提高IL-24诱导肿瘤细胞凋亡的能力，而且利用酪氨酸激酶的特异性抑制剂Genistein和AG18，或者用JAK/STAT信号通路的特异性抑制剂AG490，并不影响 IL-24对肿瘤细胞凋亡的诱导作用。因此人们推测，IL-24引起的肿瘤细胞凋亡的机制与主要通过IL-20/IL-22受体来发挥作用的炎症细胞因子的分子机制存在着差异。IL-24目前已经成为肿瘤治疗领域中的一个研究热点，通过对IL-24所进行的近十多年体内和体外研究，以及随之进行的临床I期实验，都证实了 IL-24具有广泛的抗肿瘤活性。由于IL-24能够选择性的诱导肿瘤细胞的凋亡，对正常细胞没有毒性，因此是一种理想的抗肿瘤药物。目前作为IL-24的重组蛋白可以通过靶细胞表面的受体或其它途径进入靶细胞，以发挥抗肿瘤作用。但目前IL-24对肿瘤治疗效果有待于进一步提高。Tat蛋白转帛g丰勾_ (Tat Protein transduction domain, Tat PTD) HiJIf 入 HIV Tat 胃白。Tat PTD目前已经被广泛用于与蛋白，siRNA或药物交联，以提高这些分子进入细胞内。
本发明所要解决的一个技术问题在于对肿瘤治疗效果好的IL-24-Tat PTD融合蛋白。本发明所要解决的另一个技术问题在于为IL-24-TatPTD融合蛋白提供一种构建方法。本发明所要解决的还有一个技术问题在于为IL-24-Tat PTD融合蛋白提供一种新用途。解决上述技术问题所采用的技术方案是它是由IL-24与小肽两部分所组成的融合蛋白，小肽位于IL-24的碳末端，其特征在于所说小肽是Tat PTD，由11氨基酸 (YGRKKRRQRRR)组成。上述的IL-24-Tat PTD融合蛋白的构建方法由下述步骤组成1、携带IL-M融合蛋白基因的构建采用聚合酶链式反应以人IL-M基因为模板扩增获得IL-M融合蛋白基因，将所扩增的该基因产物经质量分数为1.0%的琼脂糖电泳回片后与PGEM-T easy载体连接，将连接产物转化感受态的DH5 α细胞，涂布于含有100 μ g/ml的氨苄青霉素的LB平板中，挑取菌落接种到含有100 μ g/ml的氨苄青霉素的LB培养液中，14 16小时后，经碱性裂解法提取质粒DNA，通过酶切及测序鉴定阳性克隆，获得阳性克隆为带有IL-M融合蛋白基因的质粒载体。2、IL-M-Tat PTD融合蛋白基因的原核表达将携带IL-24融合蛋白基因的载体通过ClaI和SpeI酶切并回收片段，与经同样酶切处理的原核表达载体pGEX4-3-6His连接。连接产物转化感受态细胞，经酶切鉴定获得阳性克隆，即为携带IL-24融合蛋白基因的原核表达载体。将携带IL-24融合蛋白基因的原核表达载体转化大肠杆菌BL21，经异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷诱导表达目的蛋白，经Ni柱纯化后获得IL-M融合蛋白。检测蛋白含量，并进行SDS-PAGE检测纯化的蛋白。3、IL-24融合蛋白基因腺病毒载体的制备带有IL-24-Tat PTD 融合蛋白的 pGEMT/IL_24_Tat PTD 载体经 ClaI 与 SpeI 双酶切后回收目的片段，然后与经ClaI与SpeI双酶切的腺病毒El穿梭载体pacAd5 CMV K-N PA连接后转化获得阳性克隆，经酶切鉴定获得阳性克隆即为IL-M融合蛋白基因的腺病毒穿梭载体，所获得阳性克隆载体经》ιοΙ与NotI双酶切后获得片段，与经MlI与NotI双酶切后的pAd5-E4-PGK-miniCMV-eGFP-Fiber-RGD载体连接后转化感受态细胞，经酶切鉴定得到阳性克隆即为携带IL14融合蛋白基因用于腺病毒载体E4修饰的穿梭载体。将用于腺病毒载体E4修饰的携带IL-M融合蛋白基因的穿梭载体经BioI线性化后与经SwaI酶切线性化后的pCRAd5-baClibone在大肠杆菌BJ5183中同源重组获得阳性克隆即为携带IL-24融合蛋白基因的腺病毒载体。将I^acI线性化的携带IL-24融合蛋白基因的腺病毒载体转染HEK293细胞，7 10天收获病毒原液，经过进一步扩增及CsCl纯化获得携带IL-M融合蛋白基因的腺病毒。IL-24-Tat PTD融合蛋白在制备治疗宫颈癌药物中的用途。IL-24-Tat PTD融合蛋白在制备治疗肺癌药物中的用途。IL-24-Tat PTD融合蛋白在制备治疗恶性黑色素瘤药物中的用途。有效成分IL-24-Tat PTD融合蛋白制备治疗宫颈癌药物、制备治疗肺癌药物、制备治疗恶性黑色素瘤药物用常规药用制剂的形式来使用。所述的药用常规制剂含作为活性成分的IL-24-Tat P TD融合蛋白，该活性成分在制剂中与药学上可接受的载体如适宜于静脉注射给药的有机或无机固体或液体赋形剂混合，在制剂中，活性成分的IL-24-Tat PTD融合蛋白的质量含量为1 % 95 %，优选的质量含量为5 % 90 %。本发明采用Tat PTD与IL-24基因融合，构成IL-24-Tat PTD融合蛋白，提高IL-24 进入肿瘤细胞内，从而增强其抗肿瘤活性。本发明通过在IL-24的碳末端加上一个来源HIV Tat蛋白中一个蛋白转导结构域(Tat Protein transduction domain, Tat PTD)小肽,该 Tat PTD小肽由11氨基酸(YGRKKRRQRRR)组成。图1是IL-24-TatPTD融合蛋白原核表达纯化的结果。图2是原核表达的IL-24-Tat PTD融合蛋白对宫颈癌细胞系Hela生长抑制结果。图3是原核表达的IL-24-Tat PTD融合蛋白对肺癌肿瘤A549生长抑制结果。图4是原核表达的IL-24-Tat PTD融合蛋白对黑色素瘤细胞系B16F10-G5_luc生长抑制结果。图5是表达IL-24-Tat PTD腺病毒载体在体内抑制肿瘤生长结果。 具体实施方案下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。实施例1本实施例的IL-24融合蛋白，是由IL-24与Tat PTD小肽两部分所组成的融合蛋白，Tat PTD小肽位于IL-24的碳末端，Tat PTD小肽由11氨基酸组成，序列为YGRKKRRQRRR。IL-24-Tat PTD融合蛋白全长基因序列如下ATCGATatgaattttcaacagaggctgcaaagcctgtggactttagccagacccttctgccctcctttg ctggcgacagcctctcaaatgcagatggttgtgctcccttgcctgggttttaccctgcttctctggagccaggtatcaggggcccagggcc aagaattccactttgggccctgccaagtgaagggggttgttccccagaaactgtgggaagccttctgggctgtgaaagacactatgcaagctc aggataacatcacgagtgcccggctgctgcagcaggaggttctgcagaacgtctcggatgctgagagctgttaccttgtccacaccctgct ggagttctacttgaaaactgttttcaaaaactaccacaatagaacagttgaagtcaggactctgaagtcattctctactctggccaacaacttt gttctcatcgtgtcacaactgcaacccagtcaagaaaatgagatgttttccatcagagacagtgcacacaggcggtttctgctattccggagagc attcaaacagttggacgtagaagcagctctgaccaaagcccttggggaagtggacattcttctgacctggatgcagaaattctacaagctcGGTGGAGGTTCTTatggtcgtaagaaacgacgccaacggcgacgttgaACTAGTA其相应的氨基酸序列如下MNFQQRLQSLWTLARPFCPPLLATASQMQMVVLPCLGFTLLLWSQVSGAQGQEFHFGPCQVKGVVPQKLWEAFWAVKDTMQAQDNITSARLLQQEVLQNVSDAESCYLVHTLLEFYLKTVFKNYHNRTVEVRTLKSFSTLANNFVLIVSQLQPSQENEMFSIRDSAHRRFLLFRRAFKQLDVEAALTKALGEVDILLTWMQKFYKLGGGSYGRKKRRQRRR上述IL-24-Tat PTD融合蛋白的构建方法步骤如下1、人IL-24-Tat PTD融合基因的构建采用聚合酶链式反应以人IL-M基因为模板扩增获得IL-24-Tat PTD融合基因。弓丨物序列如下:P1 :IL-24 Clal for AATCGATatgaattttcaacagaggctgcaaag ；P2 IL-24 TatPTD SpeI Back :tactagttcaacgtcgccgttggcgtcgtttcttacgaccatAAGAACCTCCAC Cgagcttgtagaatttctgcatc。聚合酶链式反应扩增条件是94°C、30秒，98°C、10秒，55°C、15秒，72°C、15秒，28 个循环。聚合酶链式反应产物经质量分数为1. 0%的琼脂糖电泳后回片段即获得IL-24-Tat PTD融合基因片段。将聚合酶链式反应获得IL-24-Tat PTD融合基因片段与pGEM_T easy 载体连接。连接条件是2μ 1酶切纯化片段，1μ 1 10XΤ4连接酶缓冲液，0.5 μ IpGEM-T easy载体，0. 5 μ 1 Τ4连接酶，6 μ 1三蒸水，16°C连接过夜，将连接产物转化感受态的DH5 α 细胞，并涂布于含有100 μ g/ml的氨苄青霉素的LB平板中。挑取菌落接种到含有IOOyg/ ml的氨苄青霉素的LB培养液中，14 16小时后，经碱性裂解法提取质粒DNA，通过酶切及测序鉴定阳性克隆。将所获得阳性克隆分别命名为PGEMT/IL-M-Tat PTD。2、IL-M-Tat PTD融合蛋白基因的原核表达将pGEMT/IL-M Tat PTD通过ClaI和SpeI酶切并回收片段，与经同样酶切处理的原核表达载体pGEX4-3-6His载体连接。连接条件是2 μ 1酶切纯化片段，1 μ 1 10ΧΤ4 连接酶缓冲液，Iul酶切载体，0. 5 μ 1 Τ4连接酶，5. 5 μ 1三蒸水。连接产物采用与上述同样的方法转化、提取质粒DNA、酶切鉴定获得阳性克隆，命名为pGEX4-3-IL-M-Tat PTD_6His。将鉴定的阳性重组质粒pGEX4-3-IL-M-Tat PTD_6His转化大肠杆菌BL21 (DE3)， 37°C过夜。挑取阳性克隆接种于含lOOyg/mL氨苄霉素的LB培养基中，37°C培养过夜，次日，按照1 100的接种量接入含100yg/mL氨苄霉素的新鲜LB培养液中， 37 °C培养至OD6ciciIim值为0. 6时，加入异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷(Isopropyl β -D-l-Thiogalactopyranoside, IPTG)至浓度为 lmmol/L，16°C 225r/min 诱导表达 6-20 小时分别检测目的蛋白的表达，以确定蛋白诱导表达的最佳时间点。以16°C 225r/min, IPTG诱导培养16小时进行培养。7000r/min离心10分钟收集菌体，弃上清，无菌水洗涤，7000r/min离心10分钟收集菌体，弃上清，重复两次。以1 10 的比例加入破菌液(50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，IOmM咪唑，pH = 8. 0)，同时加入溶菌酶至终浓度为lmg/mL，充分吹打，置4°C裂解30分钟。用功率为100W、超声波3秒，停10秒， 每次5分钟进行超声波冰浴破菌，重复4次，至溶液清亮。超声后的菌液4°C，15，OOOg离心 1小时，弃沉淀。取上清，按镍柱与上清的体积比为1 10加入镍柱，置于旋转摇床中4°C 结合1小时，结合液用重力流法进行纯化，结合液加入重力柱中，待溶液滴尽后，加入5倍柱床体积的洗涤液(50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，20mM咪唑，pH = 8. 0)，弃流出液，然后加入2倍柱床体积的洗脱液(50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，250mM咪唑，pH = 8. 0)，收集流出液。将流出液装入透析袋，用500mL、0. IM磷酸盐内透析1小时，共透析4次，0. 22 μ m滤器过滤灭菌，NanodroplOOO检测蛋白含量，并进行SDS-PAGE检测纯化的蛋白。检测结果见图1。3、IL-24融合蛋白基因腺病毒载体的制备带有IL-24-Tat PTD 融合蛋白的 pGEMT/IL_24_Tat PTD 载体经 ClaI 与 SpeI 双酶切后回收目的片段，然后与经ClaI与SpeI双酶切的腺病毒El穿梭载体pacAd5CMV K-N pA 连接后转化获得阳性克隆，经酶切鉴定获得阳性克隆即为IL-24融合蛋白基因的腺病毒穿梭载体，所获得阳性克隆载体经》ιοΙ与NotI双酶切后获得片段，与经MlI与NotI双酶切后的PAd5-E4-PGK-miniCMV-eGFP-Fiber-RGD载体连接后转化感受态细胞，经酶切鉴定得到阳性克隆即为携带IL14融合蛋白基因用于腺病毒载体E4修饰的穿梭载体。将用于腺病毒载体E4修饰的携带IL-M融合蛋白基因的穿梭载体经BioI线性化后与经SwaI酶切线性化后的pCRAd5-baClibone在大肠杆菌BJ5183中同源重组获得阳性克隆即为携带IL-M融合蛋白基因的腺病毒载体。将I^acI线性化的携带IL-24融合蛋白基因的腺病毒载体转染HEK293细胞，7 10天收获病毒原液，经过进一步扩增及CsCl纯化获得携带IL-24-Tat PTD融合蛋白基因的腺病毒。纯化得到病毒原液命名为CRAd5-RGD. IL-24-Tat PTD，通过0拟60nm测得病毒滴度 (pt/mL)分为 5. 3 X IO12。实施例2IL-24融合蛋白，是由IL-24与RAKRRQRRR小肽两部分所组成的融合蛋白， RAKRRQRRR小肽位于IL-24的碳末端。其构建方法与实施例1相同。实施例3IL-24融合蛋白，是由IL-24与RKARRQRRR小肽两部分所组成的融合蛋白， RKARRQRRR小肽位于IL-24的碳术端。其构建方法与实施例1相同。实施例4IL-24融合蛋白，是由IL-24与RRRRRRRRR小肽两部分所组成的融合蛋白， RRRRRRRRR小肽位于IL-24的碳末端。其构建方法与实施例1相同。实施例5 IL-24融合蛋白，是由IL-M与RQIKIWFQNRRMKWKK小肽两部分所组成的融合蛋白， RQIKIffFQNRRMKffKK小肽位于IL-24的碳末端。其构建方法与实施例1相同。实施例6IL-24融合蛋白，是由IL-M与AGYLLGKINLKALAALAKKIL小肽两部分所组成的融合蛋白，AGYLLGKINLKALAALAKKIL小肽位于IL-24的碳末端。其构建方法与实施例1相同。7
实施例7IL- 24融合蛋白，是由IL-24与RVIRVWFQNKRCKDKK小肽两部分所组成的融合蛋白， RVIRVffFQNKRCKDKK小肽位于IL-24的碳末端。其构建方法与实施例1相同。实施例8有效成分IL-24-Tat PTD融合蛋白制备治疗宫颈癌药物用常规药用制剂的形式来使用。所述的药用常规制剂含作为活性成分的IL-24-Tat PTD融合蛋白，该活性成分在制剂中与药学上可接受的载体如适宜于静脉注射给药的有机或无机固体或液体赋形剂混合， 在制剂中，活性成分的IL-24-Tat PTD融合蛋白的含量为 95%。实施例9有效成分IL-24-Tat PTD融合蛋白制备治疗肺癌药物用常规药用制剂的形式来使用。所述的药用常规制剂含作为活性成分的IL-24-TatPTD融合蛋白，该活性成分在制剂中与药学上可接受的载体如适宜于静脉注射给药的有机或无机固体或液体赋形剂混合，在制剂中，活性成分的IL-24-Tat PTD融合蛋白的含量为 95%。实施例10有效成分IL-24-Tat PTD融合蛋白制备抑制恶性黑色素瘤药物用常规药用制剂的形式来使用。所述的药用常规制剂含作为活性成分的IL-24-Tat PTD融合蛋白，该活性成分在制剂中与药学上可接受的载体如适宜于静脉注射给药的有机或无机固体或液体赋形剂混合，在制剂中，活性成分的IL-24-Tat PTD融合蛋白的含量为 95%。为了验证本发明的有益效果，发明人采用本发明实施例1制备IL-24-Tat PTD融合蛋白进行了药效试验，各种试验情况如下1、IL-24Tat PTD融合蛋白体外抑制宫颈癌细胞系Hela生长采用MTT方法检测GST-IL-24和GST_IL-24_Tat蛋白对宫颈癌细胞系Hela增殖的影响，具体操作如下接种细胞取对数生长期的人宫颈癌细胞(Hela)，0. 胰酶消化后接种于96孔板，每孔细胞数为1X103。蛋白处理将2种蛋白按照0. 1、0. 2、0. 4、0. 8、1. 6mmol/L不同梯度设置处理组，每组设3个复孔。以IXPBS处理组作为对照。48小时后进行细胞下游检测。显色培养48小时后加入5g/L的MTT 20uL,继续培养4小时。读数去掉培养基，加入二甲基亚砜(DMSO) 150 μ L，置于水平摇床上，室温作用10 分钟。酶标仪570nm处测得吸光值。取各孔光吸收值，将所得结果用SPSS 13. 0软件的One Way ANOVA进行统计分析，各组间差异比较采用方差分析。实验结果见图2。由图2可见， 所表达的GST-IL-24-Tat PTD融合蛋白对宫颈癌细胞系Hela生长具有明显的抑制作用。2、IL_24Tat PTD融合蛋白体外抑制人肺癌细胞生长接种细胞取对数生长期的人肺癌细胞(A549)，0. 1 %胰酶消化后接种于96孔板， 每孔细胞数为1X103。其它实验步骤与实验1相同。实验结果见图3。由图3可见，所表达的GST-IL-24-Tat PTD融合蛋白对人肺癌细胞生长具有明显的抑制作用。3、IL_24Tat PTD融合蛋白体外抑制小鼠黑色素瘤细胞生长接种细胞取对数生长期的小鼠黑色素瘤肺转移细胞，0. 胰酶消化后接种于96孔板，每孔细胞数为IX 103。其它实验步骤与实验1相同。实验结果见图4。由图4可见，所表达的GST-IL-24-Tat PTD融合蛋白对小鼠黑色素瘤细胞生长具有明显的抑制作用。4、表达 IL-24-Tat PTD 腺病毒(CRAd5_RGD. IL-24-Tat PTD)对恶性黑色素瘤的体内治疗作用取处于对数生长期的B16F10-G5-1UC黑色素瘤细胞，用PBS洗涤后经0.2%胰酶消化，PBS吹打悬浮细胞，4°C，2000g离心10分钟，弃上清；用无血清培养液重悬细胞，并用血球计数板计数，制备成6. 6 X IOVmL的细胞悬液，并按1毫升每支分装至1. 5毫升离心管中。取健康纯种4-6周龄Balb/c雌性裸鼠49只，在本实验室适应性饲养一周后进行动物实验，动物试验根据国家试验动物的护理和使用指导说明实施。先用75%酒精在其右后肢消毒，进行乙醚吸入麻醉，细胞悬液摇勻后进行皮下注射，按150 μ L(细胞总数为 IXlO6)/只进行注射。每天观察皮下成瘤情况。皮下接种4天，裸鼠皮下出现直径为5毫米的黑色硬结，即为种植瘤生长。49只裸鼠随机分成7组，每组7只。对照病毒Ad5.eGFP、 CRAd5. eGFP、CRAd5-RGD. IL-24 和 CRAd5_RGD. IL-24-Tat PTD 重组腺病毒基因治疗抗肿瘤实验方案如下各组均使用瘤体内注射，每只裸鼠注射病毒总量均为2X109空斑形成单位 (PlaqueForming Units, PFU)，隔日注射1次，共注射4次，每次剂量为5X IO8PFU0开始治疗后，每隔一天进行移植瘤的体积测量，根据移植瘤的长径(a)、短径(b)，按公式计算瘤体体积(V = aXb2/2)，绘制肿瘤体积-时间变化曲线。以对照组裸鼠平均体积超过3，OOOmm3 时，作为实验终点，实验结果见图5。由图5可见，各组裸鼠皮下种植瘤的体积均有增加，但在同一个检测时间点比较(注射肿瘤细胞后的第16天)，CRAd5-RGD. IL-24-Tat PTD组比对照组Ad5. eGFP的肿瘤生长缓慢，说明CRAd5_RGD. IL-24-Tat PTD具有更强肿瘤抑制作用。


一种IL-24-Tat PTD融合蛋白，它是由IL-24与Tat PTD小肽两部分所组成的融合蛋白，Tat PTD小肽由11氨基酸(YGRKKRRQRRR)组成，位于IL-24的碳末端。构建方法包括携带IL-24融合蛋白基因的构建、IL-24-Tat PTD融合蛋白基因的原核表达、IL-24融合蛋白基因腺病毒载体的制备步骤。IL-24-Tat PTD融合蛋白用于制备治疗宫颈癌药物、制备治疗肺癌药物、制备治疗恶性黑色素瘤药物。