专利名称：一类抗凝血多肽及其应用的制作方法血栓性疾病尤其是心脑血管栓塞性疾病是严重危害人们身体健康的常见病，其致死率及致残率也高。虽然目前有较多药物如肝素(包括低分子量肝素LMWH如伊诺肝素)、 华法林、血小板聚集抑制剂(如阿司匹林)、水蛭素等药物应用于临床，但他们同时也还存在一定的副作用，其中，出血是目前临床抗凝抗栓治疗最常见、最严重的并发症之一，因此， 发明出血副作用小的抗凝抗栓药物具有非常重要的现实意义。临床数据及近年来一系列的动物实验研究表明，凝血因子Xla(fXIa)是一个出血副作用小的抗凝抗栓治疗新靶点，发明针对该靶点的药物或许是解决目前困扰临床抗凝抗栓治疗引起的出血并发症问题的有效途径之一。在临床上，fXI升高能促进静脉血栓形成(Meijers JCM et al. N Engl J Med. 2000 ；342 :696-701)，而fXI先天缺乏严重患者的深静脉血栓、缺血性脑卒中发生率少(Salomon 0 et al. Blood. 2008，111 :4113-4117.)，这些现象提示 fXI 能促进血栓形成。 另一方面，fXI先天性缺乏患者通常只引起温和出血，很少有自发性出血(Seligsohn U. J Thromb Haemost. 2009，7 (suppl) :84-87)，这也意味着当fXIa缺乏或被抑制时，对止血功能影响不明显，即出血副作用小。在动物实验中，fXI基因敲除小鼠在进行外科手术时不会引起过量出血。fXI缺陷小鼠能显著减少用不同机械及化学方法引起的静脉及动脉血栓形成，而且止血功能正常。 针对fXI抗体能有效减少大鼠、兔及狒狒的血栓形成，并且对出血时间无影响(Rerm6T et al. J Thromb Haemost. 2009，Suppl 1 :79-83)。抗 fXI 单抗 aXIMab 能减少狒狒体内人造血管血栓的形成及凝血酶的产生，而对出血时间、血小板聚集活性无影响，因此作者认为“阻断fXI比其它抗栓剂具有出血副作用小” (Tucker et al. Blood. 2009，113 :936-944)。在最近的试验中，针对fXI的反义核酸(antisense oligonucleotides, ASOs)能够有效抗各种静脉血栓及动脉血栓形成，与伊诺肝素(enoxaparin)及华法林(warfarin)比较，还不引起出血；联合用药时，ASOs能增加伊诺肝素及氯吡格雷(clopidogrel)的抗栓活性，也不增加出血(Zhang H et al. Blood. 2010，116 (22) :4684-4692)，因此被认为是安全的抗凝。利用基因敲除手段还证实，敲除凝血因子包括组织因子(TF)、fVII、fV、fX及凝血酶原基因鼠不能存活(Mackman N. Arterioscler Thromb Vasc Biol2005 ；25 :2273-2281), fVIII+及fIX+缺陷鼠虽然能够生存，但常会引起严重出血，类似于人类fVIII或fIX缺乏引起的血友病；与上述凝血因子缺乏或不能生存，或引起严重出血相比较的是，fXI基因敲除鼠，即fXIV_鼠能够生存，并且止血功能正常，还能抗血栓形成(feilani D，RenneT. J Thromb Haemost2007 ；5 :1106-1112)。上述结果提示fXIa(或fXI)被抑制或缺乏时出血副作用小，即意味着针对凝血因子XIa的药物具有出血副作用小的优点，而且可能优于目前针对凝血酶、fX、fVII等靶点的应用的抗凝抗栓治疗药物或正研发中新药。但目前针对fXIa靶点的候选药物分子还寥寥无几，除前述提到的抗fXI抗体、fXI反义核酸外，目前还有类肽物(ρ印tidomimetics)、 一些化学小分子及一种分离自海绵的分子对fXIa具有抑制作用(Schumacher WA et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2010,30(3) :388-392)，尚缺少针对凝血因子 XIa 的选择性肽类抑制剂。钩虫是一类寄生在哺乳动物及人体的吸血寄生虫，其寄生在肠道，以摄取宿主血液为食。钩虫能分泌抗凝成份，使咬附的宿主伤口不易凝血，造成流血不止，该特点类似于水蛭吸血后宿主伤口不易凝血。本发明人课题组发现的源自犬钩虫的抗凝肽AcaNAPlO 具有很强的抗凝活性，对凝血途径中组织因子与活化的凝血因子VII复合物(TF/fVIIa) 及凝血因子Xla(fXIa)的均具有较好抑制作用(Li D et al. Biochem Biophys Res Commun. 2010，392 155-159)，是国际上首个，也是目前唯一对TF/fVIIa及fXIa均有抑制作用的抗凝物质。为获得针对凝血因子XIa的选择性抑制剂，我们对AcaNAPlO进行了结构改造，结果在AcaNAPlO的基础上发明了对凝血因子XIa具选择性抑制作用的系列抗凝血多肽，这些选择性抑制凝血因子XIa的抗凝血多肽可望应用于制备预防和治疗血栓性疾病药物，而且副作用小。
本发明的目的在于提供一类抗凝血多肽及其应用，该类抗凝血多肽是凝血因子 Xla(fXIa)的选择性抑制剂，具有较强抗凝活性，能明显延长血浆活化部分凝血活酶时间 (aPTT)，而对凝血酶原时间(PT)基本无影响。该抗凝血多肽可应用于制备药物以预防和治疗血栓性疾病，并且具有出血副作用小的特点。本发明提供了一类抗凝血多肽，该类抗凝血多肽为由SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列组成的多肽，或将SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列组成的多肽经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的能选择性抑制凝血因子XIa的衍生多肽。本发明提供了一类抗凝血多肽，该类抗凝血多肽含有由SEQ ID NO. 2，或SEQ ID N0. 3，或 SEQ ID N0. 4，或 SEQ ID N0. 5，或 SEQ ID N0. 6，或 SEQ IDN0. 7，或 SEQ ID N0. 8，或 SEQ ID N0. 9，或SEQ ID NO. 10所示氨基酸序列组成的多肽。与犬钩虫抗凝肽10 (AcaNAPlO)对TF/fVIIa及fXIa均有抑制作用相比较，本发明提供的抗凝血多肽是凝血因子Xla(fXIa)的选择性抑制剂，对凝血因子Xla(fXIa)具有较强的抑制活性，而对组织因子与凝血因子VIIa复合物(TF/fVIIa)基本无抑制活性；本发明提供的抗凝血多肽能明显延长血浆活化部分凝血活酶时间(aPTT)，而对凝血酶原时间 (PT)基本无影响。本发明的一个应用在于应用发明的抗凝血多肽制备预防和治疗血栓性疾病药物。 包含本发明的多肽具有明显抗血栓形成作用，而且对止血功能、血小板聚集活性无明显影响，可用于作为或发展成为出血副作用小的抗血栓药物。本发明的其它方面由于本文技术内容的公开，对本领域技术人员是易于理解并实施的。例如，包含本发明的抗凝血多肽与其它抗凝血、抗栓药物联合用药可减少副作用，利用基因工程方法或化学合成方法生产本发明中的抗凝血多肽，包含本发明抗凝血多肽药物组合物在临床中的应用，包含本发明的抗凝血多肽在作为抗凝制剂中的应用。本发明抗凝血多肽的优点是本发明提供的抗凝血多肽是凝血因子XIa的选择性多肽抑制剂，该类抗凝血多肽不但能够制备作为有效预防和治疗血栓性疾病药物应用，而且又不影响人体和动物的正常止血功能，出血副作用小，对于解决目前临床抗凝抗栓治疗出现的出血副并发症具有重大意义。图INAPTin-I对凝血因子XIa、Xa及fVIIa/TF的抑制作用各抗凝血多肽延长aPTT及PT见表1，结果表明在IOOnM及500nM浓度下， NAPTin-I、NAPTin-2、NAPTin-3、NAPTin-4、NAPTin-5、NAPTin-6、NAPTin-7、NAPTin-8 及 NAPTin-9 均能显著延长 aPTT，但 NAPTin-1、NAPTin-2, NAPTin-3, NAPTin-4, NAPTin-5, NAPTin-6 及 NAPTin-7 无延长 PT 活性，NAPTin-8 及 NAPTin-9 在 IOOnM 下基本不延长 PT， 在500ηΜ下能部分延长不到1. 6倍ΡΤ。表1本发明提供的抗凝血多肽对aPTT及PT的影响
抗凝血肽浓度aPTT及延长aPTT倍数PT ( sec)nMaPTT (sec)延长aPTT倍数生理盐水40.1 士 4.212.5 士 0.8NAPTin-I10079.2±3.5*1.9812.4 土 0.9500228.3士 7.4*5.6912.1 士 0.4NAPTin-210080.2 士 5. Γ2.011.7 士 1.1500221.8 士 6.3*5.5312.6 士 0.5NAPTin-310083.0 土 1.2*2.0713.5±0.4500219.3 士 6.2*5.4712.3±0.8NAPTin-4100 50078.7±3.7* 233.3土 4.5*1.96 5.8212.4±0.9 11.6 士 0.3NAPTin-510077.9 士 2.9*1.9412.2 士 0.6500226.8士 6.6*5.6612.6 士 0.4NAPTin-610079.5 士 3.1*1.9812.4 士 0.9500215.4 士 5.6*5.3712.6 土 0,4NAPTin-710078.7 士 8.1*1.9611.7±0.5500218.3 土 5.9*5.4412.7 土 0.4NAPTin-810079.7±2.9*1.9912.8 土 0.7500238.6士 8.1*5.9517.6 士 0.6#NAPTin-910080.8 士 3.2*2.0113.0±0.7500235.3土 5.4*5.8719.6±0.9#与生理盐水对照组比较，*p < 0. 01 ；与生理盐水对照组比较，#p < 0. 01实施例3本发明提供的抗凝血多肽对凝血因子的抑制作用本实施例中的抗凝血多肽由本发明人实验室通过在大肠杆菌中重组表达、分离纯化制备。用发色底物法检测各抗凝血肽对凝血因子的作用。人凝血因子IIa(即凝血酶)、Xa、XIa、Xlla、EGR-fXa 购自美国 Haematologic TechnologiesInc.，重组 fVIIa 为 Novo-Nordisk(Denmark)产品，重组可溶性组织因子rsTF购自北京Protgen公司。凝血因子)(a的发色底物用S2765，凝血因子VIIa及IIa的发色底物用S2^8，凝血因子Xia及XIIa 的发色底物用S2366。在96孔酶标板上，每孔100 μ 1反应体系中进行。50 μ L凝血因子Ila、Xa、XIa、 XIIa(终浓度为InM)分别与10 μ L相应不同浓度抗凝血肽(或PBS对照组)混合观测对 fVIIa 的作用时，使用 50 μ L fVIIa+TF(lμM)+EGR-fXa(终浓度为 500nM)。在 25°C孵育
615分钟后，加入40 μ L发色底物(终浓度为400 μ Μ)；。用Elx808酶标仪(BioTek, United States)监测0D405nm波长光吸收值变化情况，计算反应速度，根据加入抗凝血多肽时的反应速度与未加抗凝血多肽时的反应速度比推算各抗凝血多肽对凝血因子的抑制情况。结果表明，抗凝血多肽在IOOnM 浓度下，NAPTin-1、NAPTin-2、NAPTin_3、 NAPTin-4、NAPTin-5、NAPTin-6、NAPTin-7、NAPTin-8 及 NAPTin-9 均能抑制超过 90% 以上的凝血因子XIa活性，但对Ila、Xa, XIIa及fVIIa/TF均无抑制作用；在200nM浓度下，均能完全抑制凝血因子XIa的活性，对IIa Ja、XIIa也无抑制活性。200nM浓度的NAPTin-1、 NAPTin-2、NAPTin-3、NAPTin-4, NAPTin-5, NAPTin-6 及 NAPTin-7 对 fVIIa/TF 无明显抑制作用，但NAPTin-8及NAPTin-9能抑制15%的fVIIa/TF活性。上述结果表明，我们发明的抗凝血肽是凝血因子XIa的选择性抑制剂。检测不同浓度的NAPTin-I对凝血因子XIaJa及fVIIa/TF的抑制作用，作图见附图1，图中VO为加入NAPTin-I前酶反应速度，V为加入不同浓度NAPTin-I后酶反应速度， V/V0为速率比，反映NAPTin对凝血因子的抑制活性。随NAPTin-I浓度的增加，fXIa的活性逐渐被抑制，抑制fXIa的IC50约为18. 7nM，而IOOnM的NAPTin-I对fVIIa/TF及fXa均无明显抑制作用。实施例4抗凝血多肽对小鼠尾出血时间的影响取SPF级BALb/c小鼠(由广东医学院实验动物中心提供)130只，雌雄各半，体重19-23g，随机分为生理盐水对照组，重组抗凝血多肽NAPTin-1、NAPTin-3、NAPTin-5、 NAPTin-7低、中高剂量组，静脉给药后10分钟后，在距尾尖1. 5mm处剪断，待血液自行溢出开始计时，每隔30s用滤纸吸去血滴1次，直至用滤纸吸时无血为止，记录断尾尖开始至吸不出血为止的时间，即是尾出血时间，以均数士标准差表示。结果见表2.表2NAPTin-l、NAPTin-3、NAPTin-5 及 NAPTin-7 对小鼠尾出血时间的影响


一类抗凝血多肽及其应用，属于生物医药领域。由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列组成的多肽；将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且能选择性抑制凝血因子XIa的衍生多肽。该类抗凝血多肽是凝血因子XIa的选择性抑制剂，具有较强抗凝活性，能明显延长血浆活化部分凝血活酶时间，而对凝血酶原时间基本无影响。该类抗凝血多肽具较强抗血栓形成作用，可作为制备预防和治疗血栓性疾病药物应用，而且副作用小。