专利名称：靶向人凋亡抑制蛋白家族成员存活蛋白mRNA的反义寡核苷酸，含有它们的药物组合及其 ...的制作方法 癌症由至少两种癌基因经多阶段变化而引起，传统的基于细胞毒化学治疗具有选择性差、毒副作用强等缺点，目前人们希望寻找特异性强、尤其是干扰与肿瘤行为密切相关的基因表达的药物。反义药物是以Watson-Crick碱基配对原理与靶mRNA结合，干扰其翻译的脱氧寡核苷酸类药物。它能特异性的抑制肿瘤相关基因，在癌症治疗方面有广阔的应用前景。凋亡是基因控制的细胞死亡过程，凋亡减少与肿瘤的发生、发展及抗药性密切相关。凋亡由多种因素严密控制，包括Fas/TNF受体，bcl-2家族成员，以及凋亡抑制蛋白IAP(Inhibitor of ApoptosisProtein)。现已发现了六种人类IAP成员(Deveraux QL，Reed JC.，IAP家族蛋白质-凋亡的抑制物，Genes Dev.1999；13(3)239-252)，其中大部分能够直接抑制凋亡执行过程中的中心环节天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspase)。存活蛋白是近来发现的人IAP成员，它在最终分化的成人组织中不表达，而在一系列人类肿瘤中呈高表达。有实验表明存活蛋白强烈抑制由caspase-3或-7过度表达诱发的凋亡(Tamm I，Wang Y，Sausville E，et al.IAP家族蛋白质存活蛋白抑制天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶活性以及由Fas(CD95)、Bax、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶和抗癌症药物诱导的凋亡，Cancer Res.1998；58(23)5315-20)。存活蛋白表达对于细胞存活或癌症中的化学药物抗性很重要。Kato J.等的研究表明，存活蛋白的高表达能够对抗抗癌药引起的凋亡(Kato J，Kuwabara J，Mitani M，等人，在食管癌中存活蛋白的表达与预后和对化疗的反应之相关性，Int.J.Cancer.2001；95(2)92-5)。存活蛋白在一些肿瘤细胞中的特异表达及其重要功能，使它成为一个肿瘤治疗的新的靶点。因此，需要寻找靶向存活蛋白的反义核苷酸药物是积极治疗肿瘤的手段之一。本发明者经广泛深入研究，通过固相合成法(全自动DNA合成仪)合成了一系列硫代寡核苷酸并进行了筛选。现已发现一组针对癌症中存活蛋白mRNA高表达的肿瘤的生长有抑制作用，特别是如肺腺癌A549细胞株和胃癌BGC823细胞株中的高表达有良好的抑制作用的反义硫代寡核苷酸。发明概述本发明第一方面涉及可以反向互补性结合到人凋亡抑制蛋白家族成员存活蛋白mRNA的反义脱氧寡核苷酸，其选自如下所示的SEQID NO1-10，或其功能等同物。SEQ ID NO15’-GGTCCCGCGATTCAAATCTG-3’，简称TXM001；SEQ ID NO25’-ACCCATGCCGCCGCCGCCAC-3’，简称TXM002；SEQ ID NO35’-GGGCCAGTTCTTGAATGTAG-3’，简称TXM003；SEQ ID NO45’-CAGTGGATGAAGCCAGCCTC-3’，简称TXM004；SEQ ID NO55’-CTTTTTATGTTCCTCTATGG-3’，简称TXM005；SEQ ID NO65’-GTTTCAAAAATTCACCAAGG-3’，简称TXM006；SEQ ID NO75’-AGAGGCCTCAATCCATGGCA-3’，简称TXM009；SEQ ID NO85’-CTGTGACAGCCTCAACAACA-3’，简称TXM012；SEQ ID NO95’-AACAATTCAAACAAAATAAG-3’，简称TXM014；和SEQ ID NO105’-GTATCTGCCAGACGCTTCCT-3’，简称TXM016。本发明再一方面涉及选自SEQ ID NO1-10的反义寡核苷酸序列用于制备用于治疗癌症的药物的用途。本发明再一方面涉及的是药物组合物，其中含有治疗有效量的至少一种选自SEQ ID NO1-10的反义寡核苷酸序列，或其混合物，以及药学可接受的载体，佐剂或赋型剂。本发明再一方面涉及一种利用至少一种选自SEQ ID NO1-10的反义寡核苷酸序列用于治疗癌症的方法。


图1。显示来自不同肿瘤细胞中存活蛋白mRNA表达的检测结果。高表存活蛋白mRNA的肿瘤细胞包括KCC853肾癌细胞；BGC823胃腺癌细胞；A549肺腺癌细胞；SGC7901胃腺癌细胞；GLC-82肺癌细胞；HCT结肠癌细胞；MKN-45胃腺癌细胞；HEPG-2肝癌细胞。而在KB口腔癌细胞、HELF人胚肺成纤维细胞、小鼠黑色素瘤B1 6细胞中未检测出表达的存活蛋白mRNA.
图2。显示本发明所述TXM004反义硫代脱氧寡核苷酸对肺腺癌A549细胞抑制的剂量效应关系。
图3。显示RT-PCR方法检测TXM004反义硫代脱氧寡核苷酸对肺腺癌A549细胞中存活蛋白mRNA表达的抑制。
图4。显示RT-PCR方法检测TXM004反义硫代脱氧寡核苷酸对肺腺癌A549细胞中存活蛋白mRNA表达抑制的剂量效应关系。显示TXM004在100、20、400nM下，抑制存活蛋白mRNA的表达分别为51％、84％和94％。
图5。显示TXM004反义硫代脱氧寡核苷酸对肺腺癌A549细胞中存活蛋白水平的下调作用。
图6。显示TXM004反义硫代脱氧寡核苷酸诱导肺腺癌A549细胞的凋亡。
图7。显示TXM004反义硫代脱氧寡核苷酸与常规化疗药物的协同作用。
发明详述根据已知的存活蛋白mRNA序列(SEQ ID NO21.NM 001168，人-杆状病毒IAP重复，其含有5(存活蛋白)(BIRC5)，mRNA.1619个碱基)，本发明人针对存活蛋白mRNA的下列区域靶点而设计反义硫代寡核苷酸，所述靶点包括1)存活蛋白mRNA的5’-非翻译端，例如5’-CAGAUUUGAAUCGCGGGACC-3’(SEQ ID NO11)2)翻译起始密码子区域，例如5’-GUGGCGGCGGCGGCAUGGGU-3’(SEQ ID NO12)3)蛋白编码区，例如5’-CUACAUUCAAGAACUGGCCC-3’(SEQ ID NO13)5’-GAGGCUGGCUUCAUCCACUG-3’(SEQ ID NO14)5’-CCAUAGAGGAACAUAAAAAG-3’(SEQ ID NO15)5’-CCUUGGUGAAUUUUUGAAAC-3’(SEQ ID NO16)4)终止密码子区域，例如5’-UGCCAUGGAUUGAGGCCUCU-3’(SEQ ID NO17)5)3’-非翻译端，例如5’-UGUUGUUGAGGCUGUCACAG-3’(SEQ ID NO18)5’-CUUAUUUUGUUUGAAUUGUU-3’(SEQ ID NO19)5’-AGGAAGCGUCUGGCAGAUAC-3’(SEQ ID NO20)经大量研究发现，针对上述靶序列之本发明所要求保护的反义脱氧寡核苷酸序列SEQ ID NO1-10，分别对涉及存活蛋白mRNA高表达的癌症具有良好的抑制作用。本发明中所述具有存活蛋白mRNA高表达的癌症包括但不限于肺癌、胃癌、肾癌、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、膀胱癌、口腔癌、肝癌、脑肿瘤、鼻咽癌、颈部鳞癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、食管癌、胰腺癌、前列腺癌、睾丸肿瘤、宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、绒癌、白血病、霍奇金和非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、骨肉瘤，软组织肉瘤、耳鼻喉科肿瘤、眼科肿瘤等。在本发明的一个实施方案中，本发明所述反义寡核苷酸特别是肺腺癌A549细胞株和胃癌BGC823细胞株有良好的抑制作用。
本领域技术人员知晓，所述反义寡核苷酸的设计并不仅仅局限于本发明中具体公开的上述靶序列，而可以针对包括上述靶序列的5’和3’端两侧之外1-10个碱基范围内，优选地1-5个碱基，特别优选的1-3个碱基的靶序列，设计相应的反义寡核苷酸，也能够获得具有与本发明所述具体反义寡核苷酸相似的抑制作用的反义寡核苷酸。另一方面，根据本发明所公开的内容，还可以仅针对上述靶序列的5’和3’端两侧之内1-7个碱基范围内，优选地1-5个碱基，特别优选的1-3个碱基的靶序列，设计相应的反义寡核苷酸，也能够获得具有与本发明所述具体反义寡核苷酸相似的抑制作用的反义寡核苷酸。换言之，所述对涉及存活蛋白mRNA高表达的癌症具有抑制作用的反义寡核苷酸所针对的靶序列，并不仅仅局限于本发明所公开的长度为20的靶序列，而是包括了所述靶序列之片段和/或其两侧一定数目的碱基在内的序列，其长度可以在10-30个寡核苷酸，优选为13-27个，更优选为17-23个寡核苷酸之间变化。
本发明中，所述“反义寡核苷酸”是指能够与靶序列互补性结合的、与靶序列的“正义(sense)”方向相反的“反义(antisense)”方向的寡核苷酸序列。因此，一旦将其导入表达靶序列的细胞中，其能够与所述靶序列结合形成双螺旋，进而抑制所述序列的翻译表达蛋白的活性。编码所述反义寡核苷酸的序列可以基于需要抑制其活性的靶序列的全长，或其片段，只要所述反义寡核苷酸能够有效的与靶序列的部分结合，并抑制所述靶序列的活性。所述靶序列的部位可以是非编码区，例如5’-非翻译端和3’-非翻译端，也可以是编码区，包括编码目标蛋白的全长序列。同时，本领域技术人员知晓，上述靶序列的部分或片段也可以作为反义寡核苷酸使用。
本领域技术人员知晓，所述反义寡核苷酸可以通过多种已知方法制备和使用(例如参见，反义RNA和DNA，D.A.Melton，编，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.(1988))。例如，可以采用自动DNA合成仪，或重组DNA技术制备。
另一方面，本发明所述反义寡核苷酸可以通过在所述反义寡核苷酸的例如5’端、3’端和/或内部添加硫代磷酸酯基团、酯基和/或糖基和/或其它基团加以修饰。例如，在自动DNA合成仪合成所述反义寡核苷酸的过程中，可以例如通过将磷酸基团中氧原子用硫原子取代对全部或部分碱基进行修饰，从而防止所述碱基被细胞中的核酸酶降解。为此，可以采用例如二硫化四乙基秋兰姆进行上述修饰。
在本发明的一个优选实施方案中，将所述SEQ ID NO1-10的反义寡核苷酸经过修饰，成为反义硫代寡核苷酸，或者其它反义寡核苷酸形式。所述的修饰包括但不限于将反义脱氧寡核苷酸经过硫原子对一个或两个连接碱基的磷酸基团上氧原子的取代加以修饰得到具有如下特征的结构 或者将磷酸二酯键连接的碱基侧链上的基团用本领域知晓的方法采用其它合适的化学基团进行如下修饰 或者寡核苷酸链骨架通过本领域周知的方法被用其它类型的骨架代替，优选为肽链骨架。
本发明所述反义硫化寡核苷酸可以体内(in vivo)或离体(exvivo)施用。对于离体施用，本领域技术人员知晓，首先将所述反义寡核苷酸通过已知的基因递送方式导入到分离自患者的细胞或者体外培养的肿瘤细胞系内，包括但不限于病毒介导的基因递送，其中所述载体可为市售的腺病毒载体(Quantum Biotechnologies，Inc.Laval，Quebec，加拿大)；磷酸钙介导的基因递送；电穿孔，例如按照Genetronics，Inc.(San Diego，Calif.)所述的方法，以及使用SONOPORATION仪(ImaRx Pharmaceutical Corp.，Tucson，Ariz.)；显微注射或脂质体介导，例如LIPOFECTIN，LIPOFECTAMINE(GIBCO-BRL，Inc.，Gaithersburg，Md.)、SUPERFECT(Qiagen，Inc.Hilden，德国)和TRANSFECTAM(Promega Biotec，Inc.，Madison，Wis.)，以及其它本领域已知的标准方法。然后，利用针对所述细胞类型的标准方法将所述经处理的细胞回输到患者体内。
对于体内施用，可以将本发明所述的反义寡核苷酸与药学可接受的载体一起制成相应的药物组合物，以便于施用于患者。本发明所述“药学可接受的”是指所述材料不是制药学或生物学意义上不相容的，所述材料可以与所述反义寡核苷酸一起施用于受试者，而不引起不期望的生物学作用，或以不利的方式与所述药物组合物中的其他成分相互作用。根据需要，含有本发明所述反义寡核苷酸的药物组合物可以制成口服、非胃肠道施用(如静脉施用)、肌肉内注射、腹膜内注射、透皮给药、局部给药等形式，优选为静脉内和/或局部给药。
本发明中所述组合物中含有的反义寡核苷酸的量取决于患者的个体状况(年龄、体重、一般状况)、疾病的严重程度以及所采用的具体反义寡核苷酸。本领域普通技术人员容易根据常规经验确定合适的量。
具体的，所述“治疗有效量”是指与对照相比，能够有效减缓或抑制涉及存活蛋白mRNA(Survivin mRNA)高表达的癌症进程，优选的能够最终杀死所述癌症细胞的量。所述结果，优选地能够通过临床或病理学的诊断或检测加以确定。在本发明的一个实施方案中，所述单剂组合物中可以含有约0.01-约1.0mg/公斤体重，优选0.1-0.5mg/公斤体重的至少一种本发明所述的反义寡核苷酸。
本发明所述的药物组合物可以通过例如注射给药。因此，所述药物组合物可制成适于注射给药的常规形式，例如水溶液或悬浮液的形式，或是适于现用现配的固体形式，或乳液。此外，所述组合物还可以制成缓释形式。
适于注射给药的本发明所述药物组合物中采用的药学可接受的载体包括但不限于无热原的生理盐水。
适于口服施用反义核酸的药物组合物中，合适的载体包括一种或多种的香味剂、润滑剂、悬浮剂、保护剂等。合适的固体载体包括但不限于磷酸钙、碳酸钙、硬脂酸镁、糖、淀粉、明胶、纤维素、环糊精等。合适的液体载体包括但不限于水、药学可接受的油或其混合物。所述组合物中还可以添加其他佐剂，包括但不限于缓冲剂、防腐剂、香味剂、粘度或渗透压调节剂、稳定剂或悬浮剂。
在本发明的优选实施方案中，所述药物组合物中含有作用于肺腺癌A549细胞株和胃癌BGC823细胞株的SEQ ID NO4的反义硫代寡核苷酸，以及药学可接受的载体。
在本发明另一优选的实施方案中，所述药物组合物中含有至少一种选自SEQ ID NO1-10反义寡核苷酸，以及药学可接受的载体。
本发明的药物组合物中还任选的含有可作用于涉及存活蛋白mRNA高表达的癌症的其他一种或多种已知常规药物。
下面的实施例是对本发明的进一步说明，但不意味着对本发明任何限制。
实施例一反义硫代寡聚脱氧核苷酸(PS-ODN)的设计和合成本发明所述反义寡核苷酸的采用本领域中周知的固相合成法制备。具体的，本发明所述合成方法为寡核苷酸固相合成亚磷酰胺法，通过使用美国ABI公司生产的ABI390Z核酸自动合成仪，以其25umol合成程序合成，将待合成序列提供给核酸合成仪，及提供相应的原料制备。主要原料为四乙基秋兰姆(TETD)、亚磷酰胺单体(phosphoramidite monomers)。制备时，将固相支持物连接保护的、通过固相合成的含本发明核苷酸序列的硫代寡核苷酸脱保护，从固相支持物上切离。用HPLC法进行纯化。
实施例二本发明所述反义寡核苷酸对肿瘤细胞的生长抑制1.人肿瘤细胞系(A549等)的培养及反义寡核苷酸的处理接种细胞于含10％胎牛血清的RPMI1640培养基中(补充青、链霉素各100ku·L-1)，培养器皿置于37℃含有5％CO2的细胞培养箱中。培养细胞达到培养细胞达到50％-60％融合时，用无血清无抗生素培养基冲洗2遍。按Gibcol BRL公司脂质体转染说明书的要求，将反义寡核苷酸导入到肿瘤细胞内。将脂质体/无血清无抗生素培养基＝1/5的比例配制成脂质体溶液，室温静置30-40分钟，等体积混合用无血清培养基溶解的不同浓度的反义寡核苷酸，静置10-15分钟后，加入培养器皿中，迅速补充4倍的无血清培养基。置于37℃含5％CO2的培养箱中6小时后，换正常培养基，培养48-72小时后MTT法测定细胞活度。对照组只含等浓度的脂质体。
2.细胞中存活蛋白mRNA表达的检测接种9种肿瘤细胞及一种正常细胞HELF细胞于培养瓶中，待长满后，用Gibcol公司的TRIzol试剂提取细胞总RNA。提取的RNA用DEPC水重溶，以Beckman蛋白核酸分析仪读取260nm与280nm光吸收值，以DEPC水为空白对照。进行RNA纯度鉴定以及定量。适量RNA用Promega公司的Reverse Transcription System试剂盒，以oligo(dT)15为引物合成cDNA第一链。然后再用目标引物和内标引物进行特异性的PCR扩增。引物序列为目标引物(存活蛋白，扩增片段431bp)，上游5’-GCATGG GTGCCCCGACGTTG-3’，下游5’-GCTCCGGCCAGAGGCCTCAA-3’；内标引物(GAPDH，扩增片段306bp)，上游5’-CGAAGT CAACGGATTTGGTCGTAT-3’，下游5’-AGCCTTCTCGGTGGT GAAGAC-3’。扩增条件为94℃变性30秒，67℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共30个循环。产物加10×Loading Buffer，2％琼脂糖凝胶电泳，结果在紫外灯下观察拍照。结果见图1。肿瘤细胞中基本都有存活蛋白mRNA的表达(8/9)，而HELF细胞中没有。
3.靶向存活蛋白mRNA的反义硫代寡核苷酸对肿瘤细胞的抑制作用将对数生长期的A549细胞或其它的细胞接种于96孔培养板中，4000个细胞/孔。培养18-24小时，按上述方法，加入不同浓度的反义寡核苷酸，反应终体积均为200l。换正常培养基继续培养48-72小时，弃上清。每孔加入200μl新鲜配制的含0.5mg/ml四氮唑盐(MTT)的无血清培养基，37℃培养4小时后弃上清。以200μlDMSO溶解甲月替。轻度振荡后，用酶标仪在检测波长为570nm、参比波长为450nm下测定光吸收值。
本发明反义硫代寡核苷酸(TXM001～TXM016等)对肺腺癌A549细胞系、胃癌BGC细胞系有较强的抑制作用。而对正常的HELF细胞基本没有明显的抑制作用。
表1-3显示本发明反义硫代寡核苷酸对A549肺腺癌细胞、胃癌BGC823细胞及HELF细胞体外增殖的抑制作用。(对照组为脂质体对照)
表1反义寡核苷酸序列对A549细胞生长的抑制作用

表2反义寡核苷酸序列对BGC823细胞生长的抑制作用

表3反义寡核苷酸序列对HELF细胞生长的作用

实施例三TXM004抑制癌症细胞生长的进一步研究1.TXM004反义寡核苷酸对肺腺癌A549细胞生长抑制的剂量效应关系按实施例二中方法，测TXM004反义寡核苷酸6个不同浓度(400nM、200nM、100nM、5nM、25nM、12.5nM)对A549细胞的抑制作用。结果见表4。其S形量效曲线如图2。它的最大抑制率为83％，IC50为62.86nM。
表4不同浓度的TXM004对A549细胞生长的抑制作用

2.关于TXM004反义寡核苷酸的阴性对照合成TXM004反义寡核苷酸的错配序列TXMno75’-GTCAGGATCTTCCCACGGAG-3’，用MTT法检测对A549细胞的抑制。结果见表5。
表5 TXM004与错配序列作用比较

3.靶位延长对TXM004反义寡核苷酸抑制A549细胞的影响合成TXM004反义寡核苷酸序列两端各延长1nt(长22nt)和2nt(长24nt)的反义序列，分别为TXM022 5’-GCAGTGGATGAAGCCAGCCTCG-3’，TXM024 5’-GGCAGTGGATGAAGCCAGCCTCGG-3’。用MTT法检测对抑制力的影响。结果见表6。靶位的延长并没有影响对细胞的抑制作用，这说明TXM004的靶位点可以在一定范围内加以变化，也是合适的。
表6 TXM004与延长碱基序列的作用比较

实施例四反义硫代寡核苷酸特异性抑制A549细胞存活蛋白mRNA的表达
1.用RT-PCR方法检测TXM004反义硫代寡核苷酸(200nM)对A549细胞中存活蛋白mRNA的抑制接种A549细胞于培养瓶中，培养18-24小时，细胞达50-60％融合时，按实施例二中的方法导入终浓度为200nM的TXM004反义硫代寡核苷酸，对照只含等量的脂质体。置于37℃含5％CO2的培养箱中培养6小时后取出，用Gibcol公司的TRIzol试剂提取细胞总RNA。提取的RNA用DEPC水重溶，以Beckman蛋白核酸分析仪读取260nm与280nm光吸收值，以DEPC水为空白对照。进行RNA纯度鉴定以及定量。取等量的对照及处理细胞总RNA，用Promega公司的Reverse Transcription System试剂盒，以oligo(dT)15为引物合成cDNA第一链。然后再用目标引物和内标引物进行特异性的PCR扩增。引物序列为目标引物(存活蛋白，扩增片段431bp)，上游5’-GCATGG GTGCCCCGACGTTG-3’，下游5’-GCTCCGGCCAGAGGCCTCAA-3’；内标引物(GAPDH，扩增片段306bp)，上游5’-CGAAGT CAACGGATTTGGTCGTAT-3’，下游5’-AGCCTTCTCGGTGGT GAAGAC-3’。扩增条件为94℃变性30秒，67℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共30个循环。产物加10×Loading Buffer，2％琼脂糖凝胶电泳，结果在紫外灯下观察拍照。结果见图3。
2.用RT-PCR方法检测TXM004反义硫代寡核苷酸抑制A549细胞存活蛋白mRNA表达的剂量依赖关系方法同1中所述。结果见图4。随着TXM004反义硫代寡核苷酸浓度增大(100nm、200nm及400nm)，A549细胞中存活蛋白mRNA的含量明显减少。反义寡核苷酸对靶mRNA抑制的程度与药物浓度成正比，在100nM、200nM、400nM时的抑制率分别为51％、84％、94％。
实施例五反义硫代寡核苷酸特异性抑制A549细胞存活蛋白1.用Western印迹方法检测TXM004反义硫代寡核苷酸(200nM)对A549细胞中存活蛋白蛋白的抑制接种A549细胞于培养瓶中，培养18-24小时，细胞达50-60％融合时，按实施例二中的方法导入终浓度为200nM的TXM004反义硫代寡核苷酸，对照只含等量的脂质体。置于37℃含5％CO2的培养箱中培养6小时后，换完全培养基培养20小时。取出，用含蛋白酶抑制剂的三去污剂细胞裂解液提取细胞总蛋白，用二金鸡钠酸蛋白定量试剂盒定量。取等量的对照及反义寡核苷酸处理过的细胞总蛋白，经不连续SDS聚丙烯酰胺凝胶(12％分离胶)电泳分离。然后经电转移将蛋白转印到硝酸纤维素膜上，用脱脂奶粉封闭后，膜与抗存活蛋白蛋白的非标记抗体反应，洗涤后再将膜与辣根过氧化物酶标记的二抗一同温育。用ECL试剂盒显色。结果见图5，TXM004反义硫代寡核苷酸明显下调存活蛋白蛋白水平。
实施例六TXM004反义寡核苷酸诱导A549细胞凋亡接种A549细胞于培养瓶中，培养18-24小时，细胞达50-60％融合时，按实施例二中方法导入终浓度为200nM的TXM004反义硫代寡核苷酸，对照只含等量的脂质体。置于37℃含5％CO2的培养箱中培养6小时后，换完全培养基培养24小时，收集细胞，固定，染色，用流式细胞仪检测凋亡细胞。结果见图6，对照细胞有1.12％凋亡，而处理后细胞有17.95％凋亡。
实施例七TXM004反义寡核苷酸与抗癌药协同作用接种A549细胞于培养瓶中，培养18-24小时，细胞达50-60％融合时，按实施例二中方法导入终浓度为5nM的TXM004反义硫代寡核苷酸，对照只含等量的脂质体。转染6小时后，再分别加入不同浓度的顺铂、5-氟尿嘧啶和三尖杉酯碱继续作用66-68小时，MTT法检测。结果见图7，其IC50值的改变见表7。反义寡核苷酸与抗癌药的协同应用，使三种抗癌药的S形量效曲线左移，增加了细胞对抗癌药的敏感性。从而提示在临床上将反义寡核苷酸与传统抗癌药协同应用，可以增强癌症治疗的特异性，降低抗癌药用量，减轻化疗毒性。
表7 TXM004与常规化疗药的协同作用

序列表<110>中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所<120>靶向人凋亡抑制蛋白家族成员存活蛋白mRNA的反义寡核苷酸，含有其的药物组合物及其用途<130>IDC030008<160>21<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>20<212>DNA<213>Homo sapiens<400>1ggtcccgcga ttcaaatctg 20<210>2<211>20<212>DNA<213>Homo sapiens<400>2acccatgccg ccgccgccac 20<210>3<211>20<212>DNA<213>Homo sapiens<400>3gggccagttc ttgaatgtag 20<210>4<211>20<212>DNA<213>Homo sapiens
<400>4cagtggatga agccagcctc 20<210>5<211>20<212>DNA<213>Homo sapiens<400>5ctttttatgt tcctctatgg 20<210>6<211>20<212>DNA<213>Homo sapiens<400>6gtttcaaaaa ttcaccaagg 20<210>7<211>20<212>DNA<213>Homo sapiens<400>7agaggcctca atccatggca 20<210>8<211>20<212>DNA<213>Homo sapiens<400>8ctgtgacagc ctcaacaaca 20<210>9<211>20<212>DNA<213>Homo sapiens
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本发明涉及靶向人凋亡抑制蛋白家族成员存活蛋白mRNA的反义寡核苷酸序列，含有它们的药物组合物及其用于治疗癌症的用途。