专利名称：猪胰脂肪酶作为Michael加成反应催化剂的应用的制作方法由于酶催化具有高选择性、条件温和及潜在的可再生性，因此是一类高效、绿色的有机合成工具。此外，酶催化还具有多功能性，主要表现为一种天然酶分子可以催化除天然反应之外的其它化学反应，而这种反应可以与天然反应毫无关联。近年来，酶的这种特性受到了很大关注，因为通过研究其非天然活性，不仅可以优化已知酶催化的方法，还可以提供一种新的有机合成途径。由活泼亚甲基化合物形成的碳负离子对α，β -不饱和羰基化合物的碳碳双键的亲核加成反应称为Michael加成反应，是一种有效、实用、经济的形成碳碳键和碳杂键的方法。Michael加成反应通常是由碱催化或者是由胺与羧酸或路易斯酸联合进行的均相催化， 但这些催化剂的使用造成了一些环境问题。近年来，越来越多的注意力转移到环境友好的催化剂上。生物催化剂作为一种绿色、有效的催化剂在有机合成的应用中正逐步增多，酶催化的Michael加成反应也陆续被报道。外消旋体的苄丙酮香豆素(Warfarin)作为最有效的抗凝血剂在医学上已使用半个多世纪。虽然目前已有多种不同的化学方法可以合成苄丙酮香豆素，但采用生物转化的方法合成苄丙酮香豆素尚未见国内外报道。生物转化方法由于使用可再生的资源，通常被认为比化学方法更加经济、环保和更具有持续性。因此，寻找生物催化剂合成苄丙酮香豆素及其衍生物仍具有比较重要的意义。
有鉴于此，本发明的目的之一在于研究哪种酶可以作为4-羟基香豆素和 α, β-不饱和酮的Michael加成反应的催化剂应用，且催化活性好。为达到此目的，本发明提供如下技术方案猪胰脂肪酶作为4-羟基香豆素和α，β -不饱和酮的Michael加成反应催化剂的应用。进一步，所述α，β -不饱和酮为α，β -不饱和芳香酮、α，β -不饱和杂环芳香酮或α，β-不饱和环酮。再进一步，所述α，β -不饱和酮为4-芳基-3- 丁烯_2_酮、4_取代芳基_3_ 丁烯-2-酮、4-杂芳基-3- 丁烯-2-酮、4-取代杂芳基-3- 丁烯-2-酮、2-环戊烯-1-酮、4 和/或5位被取代的2-环戊烯-1-酮、2-环己烯-1-酮或3、4和5位中任一位或多位被取代的2-环己烯-1-酮。再进一步，所述4-取代芳基-3- 丁烯-2-酮、4-取代杂芳基-3- 丁烯-2-酮、4和/ 或5位被取代的2-环戊烯-1-酮和3、4和5位中任一位或多位被取代的2-环己烯-1-酮中的取代基独立地选自氟、氯、溴、三氟甲基、硝基、氰基、羟基、0Γ04烷氧基和Cf C4烷基中的一种或多种。更进一步，所述α，β-不饱和酮为4-苯基-3-丁烯-2-酮、4-(4-甲氧基苯基)-3- 丁烯-2-酮、4- (3-甲氧基苯基)-3- 丁烯-2-酮、4- (2-甲氧基苯基)-3- 丁烯-2-酮、4- (4-氟苯基)-3- 丁烯-2-酮、4- (3-氟苯基)-3- 丁烯-2-酮、4- (2-氟苯基)-3- 丁烯-2-酮、4- (4-氯苯基)-3- 丁烯-2-酮、4- (3-氯苯基)-3- 丁烯-2-酮、4- (2-氯苯基)-3- 丁烯-2-酮、4-(4-溴苯基)-3- 丁烯-2-酮、4-(3-溴苯基)-3_ 丁烯-2-酮、 4- (2-溴苯基)-3- 丁烯-2-酮、4- (2-呋喃基)-3- 丁烯-2-酮、4- (2-噻吩基)_3_ 丁烯-2-酮、2-环戊烯-1-酮或2-环己烯-1-酮。本发明的目的之二在于提供应用猪胰脂肪酶催化4-羟基香豆素和α，β-不饱和酮的Michael加成反应的方法，产率高。为达到上述目的，本发明提供如下技术方案应用猪胰脂肪酶催化4-羟基香豆素和α，β -不饱和酮的Michael加成反应的方法 将4-羟基香豆素和α，β-不饱和酮在猪胰脂肪酶催化下、含水有机溶剂中反应，即生成 Michael加成反应产物；所述4-羟基香豆素和α，β -不饱和酮的投料摩尔比为1 广7 ；所述有机溶剂为二甲亚砜(DMS0)、N, N-二甲基甲酰胺(DMF)、四氢呋喃(THF)、甲醇、乙醇或 1，4- 二氧六环；所述含水有机溶剂中水的体积百分比为(Γ25%。优选的，所述4-羟基香豆素和α，β-不饱和酮的投料摩尔比为1:4. 5 7;所述有机溶剂为二甲亚砜、N, N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃或甲醇；所述含水有机溶剂中水的体积百分比为纩12%。更优选的，所述4-羟基香豆素和α，β-不饱和酮的投料摩尔比为1:5;所述有机溶剂为二甲亚砜；所述含水有机溶剂中水的体积百分比为10%。本发明的有益效果在于本发明首次发现猪胰脂肪酶能够作为4-羟基香豆素和 α, 不饱和酮的Michael加成反应的催化剂应用，催化活性好，还提供了应用猪胰脂肪酶催化该Michael加成反应合成抗凝血剂苄丙酮香豆素及其衍生物的方法，产率高，不仅拓宽了猪胰脂肪酶的应用范围，为Michael加成反应提供了一种潜在的优良催化剂，还为苄丙酮香豆素及其衍生物的合成提供了一种高效、环保、经济的方法，在有机合成领域中具有广阔的应用前景。
图1示出了溶剂对猪胰脂肪酶催化4-羟基香豆素和α，β -不饱和酮的Michael 加成反应的影响。图2示出了溶剂含水量对猪胰脂肪酶催化4-羟基香豆素和α，β-不饱和酮的 Michael加成反应的影响。图3示出了底物投料比对猪胰脂肪催化4-羟基香豆素和α，β-不饱和酮的 Michael加成反应的影响。

本实施例以4-羟基香豆素和苄叉丙酮(即4-苯基-3- 丁烯-2-酮)的反应作为模板反应，对猪胰脂肪酶催化4-羟基香豆素和α，β-不饱和酮的Michael加成反应的活性进行确认。实验方法为在反应瓶中加入4-羟基香豆素(0. 5mmol)和苄叉丙酮(0.6mmol)，不加入催化剂或加入催化剂(50mg)，再加入0. Iml水和0. 9ml DMS0，控温25°C搅拌反应144 小时；反应完毕后，过滤除去酶，滤液加水25ml稀释后用乙酸乙酯萃取，合并二氯甲烷萃取液，用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压蒸馏除去溶剂，再用快速柱色谱法纯化，即得目标产物。结果如表1所示。表1 4-羟基香豆素和苄叉丙酮在不同催化剂催化下的反应结


本发明公开了猪胰脂肪酶作为4-羟基香豆素和α,β-不饱和酮的Michael加成反应催化剂的应用，催化活性好；还提供了应用猪胰脂肪酶催化该Michael加成反应合成抗凝血剂苄丙酮香豆素及其衍生物的方法，产率高，不仅拓宽了猪胰脂肪酶的应用范围，为Michael加成反应提供了一种潜在的优良催化剂，还为苄丙酮香豆素及其衍生物的合成提供了一种高效、环保、经济的方法，在有机合成领域中具有广阔的应用前景。