专利名称：抗ev71的黄酮类化合物，及其在制药中的应用的制作方法手足口病是肠道病毒引起的常见传染病之一，患者以婴幼儿为主，大多数病例症状轻微，主要表现为发热和手、足、口腔等部位的皮疹或疱疹等特征，多数患者可以自愈。少数病例可发生脑膜炎、脑炎、心肌炎和肺炎等重症，个别重症患儿病情恶化快，易发生死亡， 少年儿童和成人感染后大多不发病，但能够传播病毒。手足口病疫情由EV71感染引起，传染性强，潜伏期为2 7天，病程一般为7 10天。 病毒可通过咳嗽、喷嚏、谈话等日常接触传播给健康人群，特别是婴幼儿。人类感染EV71病毒后可获得免疫力，但目前尚无疫苗预防，可以复发或再感染。EV71感染引起重症的比例高于其他类型肠道病毒，重症患儿病死率较高，目前尚无特效治疗药物。肠道病毒71型(EV71)属于小RNA病毒科(Picornaradae)肠道病毒属(Enterovirus) 的成员，归属于人类肠道病毒Α。1974年khmidt等人首次报道从美国加利福尼亚暴发的表现为神经系统症状疾病(1969 1973年)的患者中分离到EV71，随后，世界上许多国家相继报道了 EV71病毒在不同地区的流行情况，EV71病毒已在世界范围内引起多次暴发与流行， 人们逐渐认识到EV71病毒是手足口病的主要病原。目前已知EV71的感染可以导致手足口病、疱疹性咽峡炎、瘫痪性疾病、神经源性肺水肿、无菌性脑膜炎(as印ic meningitis)、脑炎(encephalitis)和脊髓灰质炎样的麻痹性疾病(poliomyelitis-like paralysis)等多种与神经系统相关的疾病。EV71可导致大范围的暴发流行，可伴有严重的CNS并发症或致死性肺水肿。近年来，EV71病毒的流行在亚太地区呈上升趋势，1975年保加利亚大流行， 共有705名患儿感染，死亡44例；1997年马来西亚大流行感染沈观人，死亡30多人；1998 年，台湾地区暴发EV71的大流行，约有12万以上的人被感染，死亡78人。因此，有关EV71 的病毒生物学特性、致病机理、诊断和预防等的研究日益受到人们的重视。EV71病毒主要是通过口腔进入消化道。病毒首先在咽和肠道淋巴组织进行繁殖扩增，然后通过形成病毒血症进行扩散，进一步在网状内皮细胞中扩增，最终侵犯脑膜、脊髓和皮肤等靶器官。EV71在致病性方面具有肠道病毒所共有的特点，即相同血清型的毒株在同一地区流行会引起临床症状相同疾病的暴发，但是有时也会出现相同血清型毒株分别引起散在的或流行性的临床症状不同(甚至无明显临床症状)的病例。此外，不同的肠道病毒感染可以产生相同的临床症状。两种以上的肠道病毒能够同时在消化道进行繁殖，但是有些情况下， 不同肠道病毒在生长繁殖过程中会出现一种病毒的繁殖对另外一种病毒的生长产生抑制的现象。有文章报道，同一血清型EV71毒株感染能够引起临床症状明显不同的疾病暴发， 提示不同EV71毒株的致病机制可能有所不同。此种肠道传染病的感染渠道相当普遍，可以感染的人群也非常广泛，但儿童是主要发病人群。很多成人因为自身免疫力强，感染病毒后并不发病或发病无症状，成为隐性的病毒传播源。对潜在未发病的病毒感染者的发现和有效的感染源控制，是目前防止疫情扩大所面临的最大挑战。当前国内手足口病治疗用药主要有抗病毒药物(病毒唑、病毒灵等)、 B族维生素(VB2等)及部分清热解毒的中药等。因此，发现高效、低毒的EV71抑制剂对手足口病治疗新药开发具有显著意义。
本发明提供式(I)化合物在制备预防或治疗与肠道病毒尤其是EV71病毒感染相关的疾病的药物中的应用，优选地可用于手足口病、疱疹性咽峡炎、瘫痪性疾病、神经源性肺水肿、无菌性脑膜炎、脑炎和脊髓灰质炎样的麻痹性疾病等多种与神经系统相关的疾病其中虚线部分代表单键或双键，优选代表双键；
R1-R10分别独立地选自氢、羟基、烷基、C2_8烯基、CV8烷氧基、烷基羰氧基、烷氧羰氧基、c3_8环烷氧基羰氧基、氨基、Ci_8烷基氨基、N，N- 二 CV8烷基氨基、N-Cp8烷基羰基氨基，并且R1-R4中至少有一个是羟基，并且R5-Rw不能全是氢。在其中一个优选实施例中，R5选自羟基、甲氧基、乙氧基、乙酰氧基。在另一个优选实施例中，R2和/或R4是羟基。在又一个优选实施例中，R5是甲氧基且R4是羟基。在又一个优选实施例中，R2、R5是甲氧基且R4是羟基，具有式(Ia)所示的结构
在最优选的实施例中，式(I)化合物选自4’，5- 二羟基-3，3’，6，7-四甲氧基-黄酮、 4’，5- 二羟基-3，6，7-三甲氧基黄酮、5，4’ - 二羟基-3，3’，7-三甲氧基黄酮、3’，5- 二羟基-3，4’，6，7-四甲氧基黄酮。 本发明的另一方面，提供一种用于预防或治疗与EV71病毒感染相关的疾病的药物组合物，其包含式(I)化合物或其药学上可接受的盐和至少一种药学上可接受的载体和 /或稀释剂，其中式(I)化合物或其药学上可接受的盐抑制EV71病毒的IC5tl低于100 μ g， 优选低于10yg。其可以作为适宜口服或非肠道给药(例如经静脉内、皮下或肌肉内给药) 的制剂形式。所述的口服给药的制剂形式为片剂、缓释片、控释片、锭剂、硬或软胶囊、水性或油混悬剂、乳剂、可分散的散剂或颗粒剂、糖浆剂或酏剂、滴丸、微丸或口服溶液，所述的非肠道给药的制剂形式为灭菌的水性或油性溶液、无菌粉末、脂质体、乳剂、微乳剂、纳米乳剂或微囊。本发明的药物组合物可以通过常规方法，利用本领域熟知的常规药物赋形剂来获得。所以，用于口服使用的组合物可以含有例如一种或多种着色剂、甜味剂、矫味剂和/或防腐剂。用于片剂制剂的适宜的可药用赋形剂包括例如，惰性稀释剂例如乳糖、碳酸钠、磷酸钙或碳酸钙；制粒和崩解剂例如玉米淀粉和藻酸；粘合剂例如淀粉；润滑剂例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉；防腐剂例如对羟基苯甲酸乙酯或丙酯，和抗氧剂，例如抗坏血酸。片剂制剂可以是未包衣的，也可以采用包衣以改变其崩解作用以及活性成分在胃肠道内的后续吸收作用，或改进其稳定性和/或外观，在任意情况中，均可使用该领域熟知的常规包衣剂和方法。口服使用的组合物可以是硬明胶胶囊的形式，其中活性成分与惰性固体稀释剂例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土混合，或是软明胶胶囊形式，其中活性成分与水或油例如花生油、液体石蜡或橄榄油混合。水性混悬剂一般含有微粉形式的活性成分和一种或多种助悬剂，所述助悬剂例如为羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯-吡咯烷酮、西黄蓍胶和阿拉伯胶；分散或湿润剂，例如卵磷脂或烯基氧化物与脂肪酸的缩合物(例如聚氧乙烯硬脂酸酯)，或环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物，例如十七氧化亚乙基鲸蜡醇，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸与己糖醇的偏酯的缩合产物，例如聚氧化乙烯山梨糖醇一油酸酯，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物，例如聚乙烯脱水山梨糖醇一油酸酯。 水性混悬剂还可含有一种或多种防腐剂(例如对羟基苯甲酸乙酯或丙酯)、抗氧剂(例如抗坏血酸)、着色剂、矫味剂、和/或甜味剂(例如蔗糖，糖精和天冬酰苯丙氨酸甲酯)。可通过将活性成分悬浮在植物油(例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)或矿物油(例如液体石蜡)中来配制油性混悬剂。油性混悬剂也可含有增稠剂例如蜂蜡、固体石蜡或鲸蜡醇。可以加入如上所述的甜味剂和矫味剂以提供可口的口服制剂。这些组合物可以通过加入抗氧剂例如抗坏血酸来防腐。适合通过加入水制成水性混悬剂的可分散的散剂和颗粒剂一般含有活性成分和分散剂或湿润剂、助悬剂和一种或多种防腐剂。适当的分散或湿润剂和助悬剂如上所述。也存在另外的赋形剂例如甜味剂、矫味剂和着色剂。本发明药物组合物也可以采用水包油的乳剂的形式。油相可以是植物油，例如橄榄油或花生油，或者矿物油，例如液体石蜡或者它们的混合物。适当的乳化剂可以是例如， 天然树胶例如阿拉伯胶或西黄芪胶，天然磷脂例如大豆卵磷脂，和衍生自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯(例如脱水山梨糖醇一油酸酯)，以及所述偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧化乙烯脱水山梨糖醇一油酸酯。乳剂也可含有甜味剂、矫味剂和防腐剂。
糖浆剂和酏剂可与甜味剂(例如甘油、丙二醇、山梨糖醇、阿司帕坦或蔗糖)配制， 并且也可含有缓和剂、防腐剂、矫味剂和/或着色剂。所述药物组合物还可以是注射用无菌水性或油性混悬剂的形式，其可以按照已知方法利用一种或多种适宜的分散或湿润剂和助悬剂来配制，这些试剂如上所述。无菌注射制剂也可以是在无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的注射用无菌水性或油性混悬剂，例如在1，3-丁二醇中的溶液。有关制剂的其他信息可参考Comprehensive Medicinal Chemistry的第5卷， 25.2 章(Corwin Hanschl ；Chairman of Editorial Board), PergamonPress1990。可以根据被治疗宿主和具体给药途径的不同，来确定与一种或多种赋形剂混合以制备单一剂量形式活性成分的量。例如，用于对人口服给药的制剂一般含有例如 0. 5mg-2g的活性剂以及适当的和常规量的赋形剂(约占组合物总重的5-98%)。单位制剂中一般约含有lmg-500mg的活性成分。有关给药途径和给药方案的进一步信息可参考 ComprehensiveMedicinal Chemistry 的第 5 卷，25. 3 章(Corwin Hanschl ；Chairman ofEditorial Board), Pergamon Pressl990o供治疗或预防目的的式(I)化合物的给药量，应根据病症的性质和严重性、动物或患者的年龄和性别和给药途径，按照药物的已知原理来改变。在基于治疗或预防目的使用式(I)化合物时，一般是以日剂量在例如 0. 001mg-100mg/kg体重的范围内给药，如有需要可以分剂量给药。通常，以肠胃外途径给药时采用较低剂量，例如经静脉内给药时，一般采用例如0. OOlmg-lOmg/kg体重范围内的剂量。本发明所述EV71活性的升高，可应用于单独治疗中，或者与一种或多种其他物质和/或适应症治疗联合。这样的联合治疗是可以通过各个治疗组分的同时、顺序或分开施用的方式达到的。同时治疗可以采用单一片剂或采用分开的片剂形式。例如，在手足口病的治疗中，可以包括下列主要种类的治疗(1)抗病毒剂，(2)免疫增强剂。本发明的式(I)化合物或其盐可通过用于制备此类化合物或结构上相关化合物的任何已知方法来制备，包括从植物中提取分离和化学合成。可以利用常规方法，对式(I)化合物的酚羟基(如果存在的话)进行醚化或酰化，或对官能团进行保护和脱保护。


图1为本发明化合物结构图2 — 4为LP系列结构相近的黄酮类化合物进行抗EV71体外活性评价示意图； 图 5 为 Chrysosplenetin 和 penduletin 抑制 EV71 的空斑形成； 图 6 为 Chrysosplenetin 和 penduletin 抑制 EV71 病毒增殖； 图7为Chrysosplenetin和penduletin降低病毒蛋白VPl的表达； 图8为Chrysosplenetin和penduletin作用阶段分析； 图9为chrysosplenetin和penduletin主要在病毒复制早期起作用； 图10为chrysosplenetin和penduletin抑制EV71细胞间的转播。

下面先用本发明的活性实验例来说明本发明的药理作用结果
活性实验筛选实验基于对感染细胞存活检测的抗EV71体外活性评价系统针对图1中LP系列结构相近的黄酮类化合物进行抗EV71体外活性评价，图2中除特别标示的浓度外，其它的都使用12. 5μ g/ml的样品浓度。在该实验中LP系列全部样品在所设浓度下都表现一定的活性，其中LP7和LP19活性最好，而两批LPlO和LPll未表现很强活性，且低浓度活性似乎更高。显微镜下观查，LPlO和LPll都能保护细胞不出现EV71感染的细胞病变，
图3和图4是降低样品浓度后进行实验的结果。图3为单浓度(2. 5ug/ml)实验结果，图4为从2. 5 μ g/ml往下倍比稀释3个浓度的实验结果。结果显示，在降低浓度后 LP7, LP9, LP15, LP16 和 LP21 抗 EV71 活性都不高，而 LP10，LPl 1, LP18, LP19 却表现出很好的活性。LP10、LP11和LP18的活性有随着浓度降低而升高的趋势，表明三者的细胞毒性依然存在。而LP19则是随着浓度降低而降低的趋势，表明LP19没有细胞毒性。因此从图3 和图4可以得到结论是，LP10, LP11,是系列黄酮中活性最强的2个，因此进一步针对LPlO 和LPlU chrysosplenetin (金腰带素)和penduletin (喷杜素)进行深入研究。
活性实验1 基于细胞病变效应(CPE)检测的抗EV71活性实验及细胞毒性实验 结果显示，无论是在Vero细胞还是在RD细胞上，chrysosplenetin (金腰带素)和 penduletin (喷杜素)都能非常有效地抑制EV71引起的CPE，它们的IC50值都很低。与利巴韦林(SI=8. 7)比较，chrysosplenetin (SI=69. 5)和 penduletin (SI=200)具有更高的活性和SI指数。结果表明，chrysosplenetin和penduletin具有非常好的抑制EV71活性。


具有如下结构式的黄酮类化合物或其药学上可接受的盐，其具有抑制肠道病毒尤其是EV71病毒活性，。