专利名称：一种通过组织工程构建的骨组织的制作方法组织工程是二十一世纪生命科学一大热点。它的核心内容是体外细胞三维培养， 它的基本方法是将种子细胞与可降解生物材料组成复合体，替代受损组织器官。目前，国内外骨组织替代品主要采用自体骨，约占70 %。异种骨中相对成功的是一些完全去除骨有机成分的骨矿材料，如KEIL骨，BIOOSS骨，及无机骨，以及完全去除骨矿成分的有机成分材料，如脱钙骨，骨基质明胶等。前者不含有机成分，因而疏松易碎，不具备基本机械强度；后者缺乏骨矿，因而质地柔软，不具备基本力学刚度。
本发明的目的是克服上述现有替代品的缺点，构建理想的组织工程骨组织替代PΡΠ O本发明构建的组织工程化骨组织步骤如下先模拟正常骨结构对具有一定强度的各类皮质骨替代材料按实际缺损情况进行塑形，构成骨皮质框架。框架中空部位填塞接种有骨髓间质干细胞(MSC)的松质骨替代材料，替代正常骨结构中松质骨和骨髓细胞成分。 临床应用中，医师可根据患者的CT片预先测定手术切除范围，并按缺损部分的CT重构数据按上述方法对组织工程化骨支架材料进行塑形，从而实现个体化治疗。本发明所述皮质骨和松质骨支架材料包括同种异体或异种骨脱细胞基质、同种异体锻烧骨、同种异体冻干骨、珊瑚、羟基磷灰石和磷酸三钙等。本发明是通过下述技术方案和步骤实现的A .提取并在体外扩增患者自体MSC，制成种子细胞； B .将上述种子细胞接种于柔软的松质骨支架材料上，构建组织工程化松质骨； C .构建组织工程化骨三维计算机辅助设计(CAD )重构模型； D .利用皮质骨支架材料个体化构建组织工程化骨皮质骨框架； E .将上述组织工程化松质骨充填入皮质骨框架内构建完整的组织工程化骨组织。具体步骤如下1 )体外分离、培养骨髓间质干细胞抽取患者自体骨髓Ficoll分离，提取有核细胞，PBS + E DTA清洗。置于纤维连接蛋白包被培养皿，加入DMEM培养液37°C含5 %二氧化碳培养箱。两天后去除未贴壁细胞，DMEM培养液培养。传代培养
当细胞融合到60 %-75 %密度时，用无钙镁PBS冲洗，经胰酶消化后，加入含胎牛血清的DMEM培养液终止消化，移入离心管中，离心。弃去上清液，加入含胎牛血清的DMEM 培养液，混勻，计数，按比例传代培养。2 - 3日换培养液，细胞融合至60%-75 %密度时，
3再传代培养。2 )将骨髓间质干细胞接种于松质骨支架材料，体外培养后，构建组织工程化松质骨。3 )皮质骨骼三维重构CT扫描得到骨骼每隔一定距离的各断面灰度图像。采用比利时materialise公司的重构软件CT MIMICS对病变骨骼进行三维计算机辅助设计重构。通过对比度增强、闭值化、轮廓编辑、三维区域增长、平滑处理、三维编辑等处理，获得病变骨骼皮质骨的三维CAD重构模型。所述模型可输出成STL文件，供快速成型机直接加工实物模型；还可生成工GES格式，输入三维CAD软件中进一步分析、修改，最后生成 CNC数控指令，控制机床进行数控加工。4 )塑形支架材料
首先对各类皮质骨替代材料置入预先制作的模框中，用骨水泥粘合成一个整体，得到所需的基材，包括板材和/或棒料。所得到的基材基本可保持材料固有的孔隙率，并具有较高的机械强度和可加工性能。本发明采用骨水泥作为粘结剂具有良好生物相容性、骨传导作用和生物降解性。本发明根据CT重构得到的数据可直接用CNC将基材加工成所需形状。本发明还利用快速成形法先进行构建模具，再将颗粒状材料和粘和剂灌注入模具，从而得到各类不同形状的基材。5 )将接种有MSC的松质骨直接填塞入组织工程化皮质骨框架中，构建个体化的组织工程化骨。所述组织工程化骨与正常骨组织相似，具有皮质骨、松质骨及细胞成分。按上述方法得到的组织工程化骨组织具有与正常骨组织相似的皮质骨、松质骨及细胞成分。既保持一定的机械强度，基本力学刚度，又具有合理的孔隙率，良好的细胞相容性。是一种具有自我更新，自我修复能力的活组织。

1 )体外分离、培养骨髓间质干细胞抽取患者自体骨髓5 - 10 ml, Ficoll分离，提取有核细胞，PBS + EDTA清洗两次。加入DMEM (购于GIBC0BRL公司。含有20%胎牛血清)培养培养液，放置于纤维连接蛋白包被培养皿，37°C含5 %二氧化碳培养箱。两天后去除未贴壁细胞，条件培养液培养。传代培养
当细胞融合到60 75 %密度时，用IOml无钙镁PBS冲洗，经0.25 %胰酶37 V消化5分钟，加入含10 %胎牛血清的DMEM培养液终止消化，移入离心管中，1200r / min离心5分钟。弃去上清液，加入含10 %胎牛血清的DMEM培养液IOml，混勻，计数，按1 3的比例传代培养。2 - 3日换一次培养液，直到细胞融合至60 75 % 密度时，再传代培养。本发明采用的体外分离、培养骨髓间质干细胞的方法是已知方法。2 )将骨髓间质干细胞接种于IXlcm全脱钙猪骨脱细胞基质，接种密度为IO5 -IO8，体外培养后，构建成组织工程化松质骨。3 )骨骼的三维重构CT扫描得到骨骼每隔一定距离的各断面灰度图像。对病变骨骼进行三维CAD重构， 重构软件采用比利时materialise公司的CT MIMICS。通过对比度增强、闰值化、轮廓编辑、三维区域增长、平滑处理、三维编辑等处理，获得病变骨骼的三维以D重构模型。所述模型可输出成STL文件，供快速成型机直接加工实物模型。4 )塑形支架材料
首先对一般不规则的小块片状材料进行初步预处理，切割成基本规则的长方体，再置入预先制作的长方形模框中，用骨水泥粘合成一个整体。得到所需的一定规格的基材，包括板材和/或棒料。根据CT重构得到的数据直接用CNC将基材加工成所需形状。5 )将上述接种有MSC的松质骨直接填塞入组织工程化皮质骨框架中，构建成个体化的组织工程化骨组织。


本发明属生物医学工程领域，具体涉及一种通过组织工程构建的骨组织。本发明根据所需修复骨缺损具体形态对组织工程化骨支架材料进行塑形。所得组织工程化骨外层为骨皮质框架，其中间部位由接种有骨髓间质干细胞的松质骨替代品替代正常骨结构中松质骨和骨髓成分。本发明组织工程化骨组织具有与正常骨组织相似的皮质骨、松质骨及细胞成分。临床应用中，医师可根据患者的CT片预先测定手术切除范围，并按缺损部分的CT重构数据对组织工程化骨支架材料进行塑形，从而实现个体化治疗。