GsNAC73蛋白的编码基因及其在培育耐逆植物中的应用的制作方法【技术领域】，尤其涉及一种GsNAC73蛋白的编码基因及其在培育耐逆植物中的应用。[0002]环境中物理化学因素的变化，例如干旱、盐碱、低温等对植物的生长发育有重要影响，严重时会造成农作物大规模减产，培育耐逆性作物是种植业的主要目标之一。目前，基因工程育种已经成为增强作物耐逆性的重要方法之一。高等植物细胞有多种途径应答环境中的各种逆境胁迫，其中转录因子起着调控耐逆相关效应基因表达的作用。植物中已经发现了多类转录因子与植物耐逆性相关，例如:EREBP/AP2中的DREB类，bZIP, MYB, WRKY等坐寸ο[0003]NAC (NAM/ATAF1/2/CUC2)家族是植物中特有的转录因子家族，已经研究的NAC基因在不同的生命过程中起到非常重要的作用。例如对病原菌的防卫、植物衰亡、形态发生以及对非生物胁迫的应答等。[0004]大豆起源于我国，我国有最丰富的野生大豆资源。
[0005]本发明的一个目的是提供一种DNA分子。
`[0006]本发明提供的DNA分子，为转录因子GsNAC73的编码基因，来源于大豆属野生大豆(Glycine soja Sieb.Et Zucc.),是如下(I)或(2)或(3)的 DNA 分子:
[0007](I)序列表中序列I所示的DNA分子；
[0008](2)在严格条件下与(I)限定的DNA序列杂交且编码植物耐逆性相关蛋白的DNA分子;
[0009](3)与(I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码植物耐逆性相关蛋白的DNA分子。
[0010]上述严格条件为在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65° C下杂交，然后用2 X SSC, 0.1%SDS 和 I X SSC, 0.1%SDS 各洗膜一次。
[0011]上述序列表中序列I编码的蛋白为GSNAC73，其氨基酸序列为序列表中的序列2。
[0012]含有上述DNA分子的重组载体A、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围。
[0013]上述重组载体A具体为将上述DNA分子插入表达载体中，得到的重组载体。表达载体具体为pBin438 ;在本发明的实施例中，所述重组载体A为将序列表中序列I插入载体pBin438的BamH I和Xba I的酶切位点间，得到表达GsNAC73蛋白的载体。
[0014]本发明的第二个目的是提供一种重组载体B。
[0015]本发明提供的重组载体B，为将DNA分子I和DNA分子2分别均插入pZHOl载体中，得到的载体；所述DNA分子I的核苷酸序列为序列I的自5’末端第125-360位核苷酸；所述DNA分子2的核苷酸序列为所述DNA分子I的反向互补序列。在本发明的实施例中，表达载体为pZHOl ;该重组载体B具体为将序列I的自5’末端第125-360位核苷酸插入PZHOl载体的SacI和KpnI酶切位点，且将序列I的自5’末端第125-360位核苷酸的反向互补序列插入PZHOl载体的SalI和XbaI位点间，得到的载体。
[0016]扩增上述DNA分子全长或其任意片段的引物对也是本发明保护的范围，引物对具体可为如下I)或2):
[0017]I)引物对中的一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列3，所述引物对中的另一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列4 ；
[0018]2)引物对中的一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列5，所述引物对中的另一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列6。
[0019]上述DNA分子或上述重组载体A、表达盒、转基因细胞系或重组菌或上述的重组载体B在调控植物耐逆性中的应用也是本发明保护的范围。
[0020]上述应用中，调控植物耐逆性为提高植物耐逆性或降低植物耐逆性。上述提高植物耐逆性具体体现为将所述基因通过所述重组载体A导入所述植物中，得到转基因毛状根，在盐胁迫或干旱胁迫下，所述转基因毛状根的增长率大于与转空载体毛状根；其中，转空载体毛状根为将pBin438转入植物得到的转空载体毛状根。
[0021]上述降低植物耐逆 性具体体现为将重组载体B导入所述植物中，得到转基因毛状根，在盐胁迫或干旱胁迫下，所述转基因毛状根的增长率小于转空载体毛状根；其中，转空载体毛状根为将PZHOl转入植物得到的转空载体毛状根。
[0022]上述应用中，所述耐逆性为耐旱性和/或耐盐性；所述植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物具体为大豆。
[0023]上述DNA分子或上述重组载体A、表达盒、转基因细胞系或重组菌在培育耐逆性植物中的应用也是本发明保护的范围。
[0024]上述应用中,所述耐逆性为耐旱性和/或耐盐性；
[0025]所述植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物具体为大豆。
[0026]上述应用具体为将所述DNA分子通过所述重组载体A导入所述植物中，得到转基因毛状根，在盐胁迫或干旱胁迫下，所述转基因毛状根的增长率大于与转空载体毛状根；其中，转空载体毛状根为将pBin438转入植物得到的转空载体毛状根。
[0027]可用现有的植物表达载体构建含有GsNAC73基因的重组表达载体。
[0028]所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。
[0029]使用GsNAC73构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子(如花椰菜花叶病毒(CAMV) 35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin))，或组织特异表达启动子(如种子特异表达的启动子)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用。此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
[0030]为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。
[0031]转化的细胞、组织或植物理解为不仅包含转化过程的最终产物，也包含其转基因子代。
[0032]本发明中所述的“多核苷酸”、“多核苷酸分子”、“多核苷酸序列”、“编码序列”、“开放阅读框(ORF) ”等包括单链或双链的DNA和RNA分子，可包含一个或多个原核序列，cDNA序列，包含外显子和内含子的基因组DNA序列，化学合成的DNA和RNA序列，以及有义和相应的反义链。
[0033]本发明基因可通过如下方式导入宿主中:将本发明基因插入表达盒中，再将表达盒通过植物表达载体、非致病自我复制的病毒或农杆菌导入宿主。携带本发明基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织。 [0034]转入本发明基因的植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。
[0035]本发明基因可通过如下方式导入宿主中:将本发明基因插入表达盒中，再将表达盒通过植物表达载体、非致病自我复制的病毒或农杆菌导入宿主。携带本发明基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织。
[0036]转入本发明基因的植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。
[0037]本发明的基因可以在序列I的基础上进行以下修饰，再导入宿主中，以达到更好的表达效果:
[0038]I)为了在转基因植物中表达本发明核苷酸序列，本发明核苷酸序列可根据实际需要进行修饰和优化。如可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述核苷酸序列编码的氨基酸的同时改变其密码子以符合植物偏爱性。而且，优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35%，优选为多于45%，更优选为多于50%，最优选多于约60%。
[0039]2)为了翻译的有效起始，可以修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列。例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰。
[0040]3)将本发明基因与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达。所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子。启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种。例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定。尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达。
[0041]优选的组成型启动子包括CaMV 35S和19S启动子。所述启动子还可为来源于在大多数细胞类型中表达的几种肌动蛋白基因中的启动子。另一个优选的组成型启动子为泛素启动子。上述启动子还可为在根、木髓、叶或花粉中引导表达的启动子，即组织特异性启动子。棉花核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶启动子(美国专利US 6，040，504)、水稻蔗糖合酶启动子(美国专利US 5，604，121)、夜香树黄化叶卷曲病毒启动子(W0 01/73087)。
[0042]化学诱导型启动子可为Rab29A启动子(美国专利US 5，614，395)。
[0043]4)将本发明基因与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率。例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9。任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接。
[0044]5)可向本发明基因中引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV, MCMV和AMV)。
[0045]在实际操作中，也可以将本发明基因进行细胞靶向定位。可利用本领域现有的技术实现。例如，将来源于靶向细胞器的靶基因序列与本发明基因序列融合，再导入植物细胞中，就可定位了。
[0046]上述重组载体中的出发载体可根据所使用的转化技术及靶植物物种的特性进行选择。上述选择可体现在载体中的抗性标记的选择上。对于一些靶物种，可以优选不同的抗生素或除草剂选择性标记。通常用在转化中的选择性标记包括赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptll基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因,和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因,赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因，和提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。
[0047]在优选的实施方式中，将本发明的核苷酸序列直接转化到质体基因组中。质体转化的主要优点是质体通常不需要实质修饰就能表达细菌基因，并且质体能表达单启动子控制下的多个开放读框。通过同源重组将基因插入每个植物细胞中存在的所有几千个环形质体基因组拷贝中的质体表达利用了拷贝数大大高于核表达基因的优势，使得表达水平可以容易地超过总可溶植物蛋白质的10%。将本发明基因插入到质体靶向载体中，并且转化进入期望的植物宿主质体基因组中。获得了对于含有本发明核苷酸序列的质体基因组而言属同质的植物,该植物具有高水平地表达核苷酸序列的能力。
[0048]本发明的实验证明，本发明从野生大豆中克隆了一个NAC家族的转录因子基因GsNAC73，通过干扰其表达和过量表达该基因的转基因实验，研究发现，GsNAC73基因的过量表达提高了转基因植株的耐逆性，干扰该基因表达，降低转基因植株的耐逆性，因此该基因对培育耐逆植物品种，特别是培育耐非生物胁迫(耐盐/耐旱)作物、林草等新品种具有重要的理论及实际意义，可用于农牧业和生态环境治理所需的耐逆性植物品种的培育和鉴定。
[0049]下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步说明。



[0050] 图1为GsNAC73在栽培大豆和耐盐野生大豆中的表达水平比较
[0051]图2为GsNAC73在干旱和盐处理时的表达特征[0052]图3为pBin438-GmNAC73植物表达载体示意图
[0053]图4为GsNAC73转基因毛状根的分子鉴定结果
[0054]图5为GsNAC73转基因毛状根和转空载体毛状根在NaCl和PEG处理时的生长
[0055]图6为GsNAC73转基因毛状根和转空载体毛状根经盐胁迫后的相对增长率
[0056]图7为GsNAC73转基因毛状根和转空载体毛状根经旱胁迫后的相对增长率

[0057]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0058]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0059]下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值土标准差。
[0060]所有植物材料均生长于22°C每天的光照为16h/8h (光照/黑暗)。
[0061]植物双元表达载体pBin438记载在李太元，田颖川，秦晓峰，等.高效抗虫转基因烟草的研究[J].中国科学(B辑)，1994，24(3):276-282中，中科院微生物研究所方荣祥院士提供。公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。
[0062]大豆科丰I 号(Glycine max L.Merr.Kefeng I)记载在 I K.Zhang, Y.J.Wang, G.Z.Luo, J.S.Zhang, C.Y.He, X.L.ffu, J.Y.Gai, S.Y.Chen, QTL mapping of tenagronomictraits on the soybean(Glycine max L.Merr.) genetic map and theirassociation withEST markers, Theor.App1.Genet, 2004, 108:1131-1139 ;也记载在王修强、盖钧溢、喻德跃，广谱抗源科丰I号对大豆花叶病毒强`毒株系群SC-8抗性的遗传研究，大豆科学，2003年03期；公众可从中科院遗传与发育生物学研究所获得；
[0063]发根农杆菌K599 记载在 Attila Kereszt, et al., Agrobacteriumrhizogenes-mediaded transformation of soybean to study of root biology, NatureProtocols, 2007，2 (4)，549-552 中，公众可从 Peter M Gressnon 教授，The University ofQueensland, St Lucia, Queensland 4072, Australia,获得，或经Peter M Gressnon教授同意(书面同意书)后由中科院遗传与发育生物学研究所获得。
[0064]载体pZHOl 记载在 Han Xiao, et al.Functional analysis of therice AP3 homo 1gue OsMADS 16 by RNA interference,Plant MolecularBiology, 2003, 52，957-966，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。
[0065]实施例1、大豆转录因子GsNAC73的获得及其表达受非生物胁迫诱导研究
[0066]将栽培大豆(Glycinemax(L.)Merrill) 1138-2 和耐盐野生大豆(Glycineso jaSieb.Et Zucc.)Y20及Υ55种子播种于装满蛭石的盆中，生长于25±2°C，连续光照，两周后取出大豆苗，操作时注意避免伤根，进行盐处理。处理过程为:盐处理，将根浸入200mMNaCl水溶液中，分别在0、1、3、12小时收集新鲜叶片和根各lg。将收集的叶片和根分别混合，在液氮中研碎，悬于4mol/L硫氢酸胍中，混合物用酸性苯酚、氯仿抽提，上清液中加入无水乙醇沉淀得到叶片和根的总RNA。
[0067]通过转录组分析，筛选20个盐胁迫诱导的基因，鉴定在大豆叶片和根中的表达水平。结果表明，其中一个基因表达不仅受盐胁迫诱导，同时在Y20和Y55叶和根中的表达均明显高于栽培大豆南农1138-2(图1)，将该基因命名为GsNAC73，其核苷酸序列为序列表中的序列I，该基因编码的蛋白命名为GsNAC73,该蛋白的氣基酸序列为序列表中的序列2。
[0068]分析了盐胁迫下GsNAC73的表达特征。材料和处理同上，两周龄的苗经200mMNaCl处理0、1、3、12小时，分别收集叶片和根各lg，提取总RNA。对GsNAC73基因在上述处理时的表达特征进行Real Time PCR分析，引物为Primer-F和Primer-R。大豆GmTubulin基因为内标，所用引物为Primer-TF和Primer_TR。
[0069]Primer-F:5，-ATGGGTCTGAGAGACATTGG-3’(序列 3)
[0070]Primer-R:5，-TCATTCCTTTGGAGGCATATG-3’(序列 4)
[0071]Primer-TF:5，-AACTCCATTTCGTCCATTCCTTC-3，
[0072]Primer-TR:5’ -TTGAGTGGATTCCCAACAACG-3’
[0073]Q-PCR得到的值是基因相对于GmTubulin的表达量。实验重复三次，结果取平均值土标准差。
[0074]结果如图2所示，GsNAC73基因在200mM NaCl处理时其转录水平均有不同程度升高，但是在Y20和Y55叶中的表达趋势基本相同，均为处理I小时时下降至12小时时急剧升高，在Y20和Y55根中的表达特征不同，未处理时，两个材料的根中表达量均明显低于叶中，Y20根中，盐胁迫I小时时表达量即明显升高，至6小时升至峰值，12小时时略有下降。Y55根中，NaCl处理I小时时略有升高，至12小时急剧上升。总体上，在两个材料的叶中GsNAC73的表达水平相似，而在根中，则Y20显著高于Y55。总体上，GsNAC73无论在叶还是根中均受盐胁迫的诱导表达。
[0075]实施例2、转录因子GsNAC73基因的耐逆性功能鉴定
[0076]一、过表达GsNAC73毛状根和RNA干扰GsNAC73毛状根的获得
[0077]1、转录因子GmMYB73基因的获得
[0078]将野生大豆Y20的总RNA，反转录成cDNA为模板(也可人工合成序列I作为模板)，用如下带BamH I酶切位点的上游引物和带XbaI酶切位点的下游引物进行PCR扩增，得到约440bp的PCR产物。
[0079]引物为:
[0080]带BamH I酶切位点的上游引物:
[0081]BamH I F-5，-gaAGATCTATGGGTCTGAGAGACATTGG-3’(序列 5)
[0082]带Xba I酶切位点的下游引物:
[0083]Xba I R-5，-gcTCTAGATCATTCCTTTGGAGGCATATG_3’(序列 6)
[0084]经过测序，该PCR产物大小约为441bp，具有序列表中的序列I所示的核苷酸，即为GsNAC73，其编码的蛋白为GsNAC73，其氨基酸序列为序列表中的序列2。
[0085]2、过表达载体pBin438-GsNAC73的构建
[0086]用限制性内切酶BamH I和Xba I双酶切由上述一得到的PCR产物，回收酶切产物，将该酶切产物与经过同样酶切植物表达载体pGEM-T Easy (Promega)连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，根据pGEM-T Easy载体上的羧卞青霉素抗性标记筛选阳性克隆，得到含有回收片段的重组质粒pGEM-T Easy-GsNAC73。以该重组质粒载体上的T7和SP6启动子序列为引物对其进行核苷酸序列测定，测序结果表明该PCR产物具有序列表中序列I所示的核苷酸，为GsNAC73,由441bp组成。
[0087]以上述重组质粒pGEM-T Easy_GsNAC73为模板，以上述引物扩增GsNAC73，得到约44Ibp的PCR产物与经过同样酶切植物表达载体pBin438连接，得到重组载体pBin438-GsNAC73,该载体为将序列表中的序列I插入pBin438的BamH I和Xba I酶切位点之间得到的载体，且序列表中的序列I位于CaMV 35S启动子之后。重组表达载体pBin438-GsNAC73结构示意图示于图3。
[0088]3、RNA 干扰载体 pZH01_GsNAC73-RNAi 构建
[0089]以上述pGEM-T Easy_GsNAC73 为模板，以引物(XbaI SacI)F (Sail KpnI) Rii行PCR扩增，得到236bp片段，经过测序该片段为序列表中序列I自5’末端第125-360位
核苷酸。
[0090](XbaI SacI)F-5，GCTCTAGAGAGCTCTGGTCGAAATTGACCTCCAC 3，(序列 7)
[0091](Sail KpnI)R-5，ACGCGTCGACGGTACCGTTCCTGTAGAACACCAGTG 3，(序列 8)
[0092]将PCR产物与RNAi载体pZHOl的链接，具体如下:第一链用SacI和KpnI双酶切链接，然后使用Xba I和Sal I双酶切将反链连接到第一链阳性克隆上，获得植物表达载体pZHOl-NEIPl - RNAi。经过测序，pZHOl-NEIPl - RNAi 为将序列 I 的自 5’ 末端第 125-360位核苷酸插入PZHOl载体的SacI和KpnI酶切位点，且将序列I的自5’末端第125-360位核苷酸的反向互补序列插入PZHOl载体的SalI和XbaI位点间，得到的载体，为RNA干扰载体。
[0093]4、过表达GsNAC73毛状根和RNA干扰GsNAC73毛状根的获得
[0094]I)将上述获得的重组表达载体pBin438-GsNAC73和pZH01_GsNAC73-RNAi，分别通过电击法导入转化发根农杆菌`K599，得到重组农杆菌K599/pBin438-GsNAC73和重组农杆菌 K599/GsNAC73-RNAi。
[0095]提取重组农杆菌K599/pBin438-GsNAC73的质粒，送去测序，结果为该质粒为PBin438-GsNAC73,说明重组菌构建正确。
[0096]提取重组农杆菌K599/GsNAC73_RNAi的质粒，送去测序，结果为该质粒为pZH01-GsNAC73-RNAi，说明重组菌构建正确。
[0097]2)用注射器将重组农杆菌 K599/pBin438-GsNAC73 和 K599/GsNAC73_RNAi 分别接种生长6天含两片真叶的大豆科丰I号幼苗，保湿生长:光照16小时，温度25°C，湿度50%。2周后，长出毛状根即为转化的毛状根。各获得40个转pBin438-GsNAC73 (标记为0E)和40个转GsNAC73-RNAi毛状根根系(标记为RNAi)，可进一步作转基因鉴定和耐逆性检测。
[0098]以相同的方法将空载体pBin438转入大豆科丰I号幼苗，得到39个转pBin438毛状根根系(记作K599)。
[0099]以相同的方法将空载体pZHOl转入大豆科丰I号幼苗，得到39个转pZHOl毛状根根系(记作K599)。
[0100]3)对上述转基因毛状根进行了分子鉴定
[0101]分别提取转pBin438-GsNAC73毛状根、转GsNAC73_RNAi毛状根、转pBin438毛状根和转PZHOl毛状根的总RNA，将其反转录为cDNA。以cDNA为模板，用Primer-73F和Primer-73R进行GsNAC73基因表达量分析。Real-Time PCR反应使用Τ0Υ0Β0公司的RealTime PCR Master Mix试剂盒，并按照说明进行操作。GsNAC73基因表达量检测所用引物为同上；大豆GmTubulin基因为内标，所用引物为Primer-TF和Primer-TR。实验重复三次，结果取平均值土标准差。[0102]Primer-73F:5，-ATGGGTCTGAGAGACATTGG-3’(序列 3)
[0103]Primer-73R:5，-TCATTCCTTTGGAGGCATATG-3’(序列 4)
[0104]Primer-TF:5，-AACTCCATTTCGTCCATTCCTTC-3，
[0105]Primer-TR:5’ -TTGAGTGGATTCCCAACAACG-3’
[0106]结果如图4所示，图4A为转GsNAC73-RNAi毛状根(记作GsNAC73_RNAi)和转pZHOl毛状根(记作K599)中GsNAC73表达的RT-PCR检测结果，表明，在K599中检测到内源GsNAC73的表达，而GsNAC73-RNAi毛状根中没有检测到GsNAC73的表达；图4B显示7 Real Time PCR 检测转 pBin438_GsNAC73 毛状根(记作 GsNAC73_0E)和转 pBin438 毛状根(记作K599 )中GsNAC73表达的结果，从图中看出，以大豆GmTubul in基因为内标，转pBin438-GsNAC73毛状根中GsNAC73的相对表达量约为51% ；转pBin438毛状根中检测出的GsNAC73的相对表达量是大豆原有的GsNAC73的表达，约为2%;可以看出，转pBin438-GsNAC73毛状根中GsNAC73的表达量远高于转pBin438毛状根中GsNAC73的表达量。
[0107]因此，转pBin438-GsNAC73毛状根为过表达GsNAC73毛状根；转GsNAC73_RNAi毛状根为RNA干扰GsNAC73毛状根。
[0108]二、过表达GsNAC73毛状根和RNA干扰GsNAC73毛状根耐逆性鉴定
[0109]实验样本为转pZHOl毛状根、转pBin438毛状根(标记为K599)、转pBin438-GsNAC73毛状根(标记为0E)和转GsNAC73_RNAi毛状根(标记为RNAi )。
[0110]1、耐盐性鉴定
[0111]将转pBin438毛状根(记作K599)、转pBin438_GsNAC73毛状根(记作0E)和转GsNAC73-RNAi毛状根(记作RNAi )各取6个经80mM NaCl水溶液处理3天，即浸入80mM NaCl水溶液中，25° C。实验重复三次，结果取平均值土标准差。
[0112]处理3天后，拍照观察，结果如图5所示，经80mM NaCl处理3天的转pBin438毛状根K599、转pBin438-GsNAC73毛状根0E、转GsNAC73_RNAi毛状根RNAi三者表型有显著
差异O
[0113]具体测量各组根系(统计主根长度)，
[0114]转pBin438毛状根(记作K599)处理前和处理后根长平均值分别约为6.2和7.6厘米；
[0115]转pBin438-GsNAC73毛状根(记作0E)处理前和处理后根长分别为平均值分别约为5.8和9.6厘米；
[0116]转GsNAC73_RNAi毛状根(记作RNAi )处理前和处理后根长分别为平均值分别约为5.1和5.5厘米。
[0117]再计算每一根毛状根的增长率=(处理后根长-处理前根长)/处理前根长，然后取平均值土标准差；将增长率作图如图6所示，经80mM NaCl水溶液处理转pBin438-GsNAC73毛状根OE的相对增长率为65±8% ;转pBin438毛状根K599的相对增长率为22±5%，转GsNAC73-RNAi毛状根RNAi的相对增长率为7±4%，三者间有显著差异。统计数据表明，GsNAC73的过量表达显著增加了毛状根对盐胁迫的耐性，而GsNAC73基因的失效，明显降低了毛状根的耐盐性。
[0118]采用同样的方法处理、检测转pZHOl毛状根，结果与转pBin438毛状根无显著差巳升。
[0119]2、耐旱性鉴定
[0120]以聚乙二醇6000 (PEG)处理替代干旱胁迫:将转pBin438毛状根(记作K599)、转pBin438-GsNAC73毛状根(记作0E)和转GsNAC73_RNAi毛状根(记作RNAi)分别浸入4% (体积百分含量)PEG水溶液处理3天，25° C。每个根系各为6个。 [0121]处理3天后，拍照观察如图5所示，经4% (体积百分含量)PEG水溶液处理3天的转 pBin438 毛状根 K599、转 pBin438_GsNAC73 毛状根 0E、转 GsNAC73_RNAi 毛状根 RNAi 三
者表型有显著差异。
[0122]毛状根测量具体如下(统计主根长度):
[0123]转PBin438毛状根(记作K599)处理前和处理后根长分别为平均值分别约为5.5和6.5厘米；；
[0124]转pBin438_GsNAC73毛状根(记作0E)处理前和处理后根长分别为平均值分别约为5.3和9.7厘米；
[0125]转GsNAC73_RNAi毛状根(记作RNAi )处理前和处理后根长分别为平均值分别约为
5.1和5.5厘米。
[0126]计算毛状根的相对增长率。计算毛状根长度增长率的公式同上。实验重复三次，结果取平均值。
[0127]结果如图7所示，可以看出，经4%PEG水溶液处理后，转pBin438-GsNAC73毛状根0E、转GsNAC73-RNAi毛状根RNAi与转pBin438毛状根K599间根的相对增长率有显著差别，具体如下:
[0128]转pBin438毛状根K599增长率约为18 ±4% ；
[0129]转GsNAC73_RNAi毛状根RNAi的相对增长率为8 土 3% ；
[0130]转pBin438-GsNAC73毛状根OE的增长率约为78±9% ；
[0131]采用同样的方法处理、检测转pZHOl毛状根，结果与转pBin438毛状根无显著差
巳
[0132]可以看出，GsNAC73的过量表达明显提高了毛状根的耐旱能力，而该基因的失活，则降低了毛状根的耐旱性。
[0133]上述实施例说明，野生大豆转录因子NAC家族成员GsNAC73与植物的耐盐、耐旱性相关，其过量表达显著增加植物的耐盐、耐旱性。