专利名称：纯化蛋白复合物的方法接种疫苗被广泛地接受为应对传染病和癌症的全球医疗负担的有利方法。然而， 虽然我们对与传染病和癌症有关的分子生物学的认识有显著的进展，但这些领域中的有效疫苗的开发还是有限的。所开发的最有效的疫苗使用活的、减毒的生物，然而，与这种减毒的病原体回复毒力有关的安全风险限制了它们的广泛应用。阻止更有效的疫苗的大规模开发和使用的其它主要阻碍是鉴定将以特定方式引起针对微生物病原体的突变菌株的宽泛的保护性免疫的候选病原体来源的蛋白的有限能力。一种显示赋予宽泛的、保护性免疫的前景的特定方法是将应激蛋白复合物用作针对传染病和癌症的疫苗(Colaco等人，(2004) Biochem Soc Trans32 :6^-6 等人， (2006)Cancer Immunol Immunother 55 =329-338) 已广泛记载了热休克蛋白 / 抗原肽复合物有效作为针对特定的癌症的疫苗(美国专利第5，997，873号；美国专利第5，935，576 号，美国专利第5，750，119号，美国专利第5，961，979号和美国专利第5，837，251号)。 已显示分离自热休克的BCG细胞的病原体来源的应激蛋白复合物在接种疫苗的宿主中诱导了辅助性T淋巴细胞I(Thl)介导的免疫应答，其在肺结核的小鼠气雾攻击模型中赋予了针对活体攻击(live challenge)的保护性免疫(国际PCT专利申请第WO 01/13944 号)。并且，在WO 02/20045、WO 00/10597和WO 01/13943中已显示分离自病原体或病原体感染的细胞的应激蛋白复合物有效作为针对传染病的疫苗中的免疫原性决定物 (immunogenicdeterminant)0热休克蛋白(hsp，HSP)形成广泛遍布植物界和动物界的高度保守的蛋白家族。根据它们的分子量，将主要的热休克蛋白分为6种不同的家族小型(hsp20-30kDa) ；hsp40 ； hsp60 ;hsp70 ;hsp90和hsplOO。虽然热休克蛋白最初鉴定于经受热应激(heat stress) 的细胞中，已发现它们与许多其它类型的应激有关，比如感染、渗透压应激、细胞因子应激和类似的应激。因此，根据其表达不仅由热应激所导致，也常将热休克蛋白称作应激蛋白 (SP)。hsp60家族的成员包括主要伴侣分子GroEL。这些主要伴侣分子与诸如GroES的辅伴侣分子形成多聚体复合物。许多微生物病原体具有形成不同于GroEL的复合物的另外的 hsp60家族，且一些hsp60家族成员可能更具免疫原性，比如分枝杆菌的hsp65。hsp70家族的成员包括DnaK，DnaK可与诸如DnaJ的辅伴侣分子形成多聚体复合物。其它主要hsp包括 AAAATP 酶、Clp 蛋白、触发因子、Hip、HtpG, NAC、Clp、GrpE, SecB 和前折叠素(prefoldin)。应激蛋白普遍表达于原核细胞和真核细胞两者中，其中它们在多肽的折叠和解折叠中作为伴侣分子起作用。应激蛋白的另一个作用是陪伴肽从一个细胞区室到另一个细胞区室，以及，在患病细胞的情况下，已知应激蛋白还陪伴病毒肽或肿瘤相关肽至细胞表面。应激蛋白的陪伴功能通过在应激蛋白和所陪伴的多肽之间形成复合物来实现。6所陪伴的多肽可包括肽片段，且所述复合物的形成受到ATP依赖的核苷酸交换系统的控制，对于细菌Hsp70同系物DnaK已十分清楚地证明了这点(&abo等人PNAS(1994)卷 91.10345-10349)。简言之，在其静息细胞状态中，DnaK与ATP(三磷酸腺苷)结合且对底物具有低亲和力(Palleros等人PNAS(1991)卷88. 5719-5723)。ATP水解导致DnaK 转化为高亲和力ADP(二磷酸腺苷)状态，导致了 DnaK-ADP-底物复合物的形成，其中所述底物通常是多肽或蛋白。ADP解离之后，ATP重新结合DnaK，导致构象改变，触发了正确折叠的底物蛋白从复合物的释放(Palleros等人J Biol Chem(19^)卷沈7，第8册， 5279-5285 ；Palleros 等人 Nature(1993)365(6447) :664-6 ；Szabo 等人 PNAS(1994)卷 91.10345-10349)。已显示导致底物释放的该最终步骤除结合ATP之外还需要钾(K+)和镁 (Mg2+) (Palleros 等人Nature (1993) 365 (6447) :664-6 ；Palleros 等人FEBS Letters (1993) 卷336，第1册，1对-1沘)。异源多肽或多肽片段与应激蛋白复合形成应激蛋白-肽复合物，可将其称作热休克蛋白复合物(HspC)。HspC被抗原呈递细胞(APC)捕获以提供抗原肽的来源，所述抗原肽可被装载到主要组织相容复合物(MHC)分子上以细胞表面呈递给免疫系统的T淋巴细胞。热休克蛋白/抗原肽片段复合物(HspC)作为癌症疫苗已被广泛研究(参见，例如，美国专利第5，997，873号和美国专利第5，935，576号)且因此已开发了用于从肿瘤细胞中分离用作针对所述肿瘤的有效疫苗的HspC的方法。例如，WO 02/28407公开了基于热休克蛋白对于肝素的结合亲和力用于纯化蛋白复合物的方法。两步方法包括肝素亲和色谱和可选的后续离子交换色谱步骤，以获得应激蛋白复合物制备物。WO 02/34205涉及利用 ConA琼脂糖凝胶纯化HSP70应激蛋白复合物。然而这些方法导致了单个热休克蛋白家族的分离，且因此忽略了多伴侣分子蛋白作为疫苗的使用。HspC作为癌症疫苗的用途可通过使用多伴侣分子蛋白尤其是热休克蛋白 (Bleifuss等人2008)来显著地改良，且因此已开发了用于纯化用于疫苗的多伴侣分子蛋白和伴侣分子蛋白复合物的方法。例如，美国专利第6，875，849号公开了使用非液相等电聚焦(FS-IEF)从肿瘤中纯化用作癌症疫苗的HspC。可使用自由流等电聚焦(FF-IEF)从病原体和感染的细胞中分离用作用于预防和治疗传染病的疫苗组合物中的免疫原性决定物的热休克蛋白/肽复合物。然而，该技术的关键限制是与开发大规模FF-IEF设备以产生大量热休克蛋白/肽复合物(HspC)有关的困难，大量热休克蛋白/肽复合物(HspC)是商业大规模的GMP疫苗生产所需要的。并且，使用两性电解质(安福灵(ampholines))来产生FF-IEF过程中需要的pH梯度导致了所得的纯化的含HspC的制备物中除离液剂之外另外污染物的引入。这样的污染物是管理机构不可接受的，为在含HspC的疫苗组合物的生产中使用FF-IEF方法设置了重要的阻碍。有趣地是，这些发明人甚至在使用离液剂时报道了 HspC的稳定性，诸如在FF-IEF过程中甚至在处理缓冲液中不存在二价阳离子和ADP时使用尿素和去垢剂(Bleifuss等人2008)。此外，自由流等电聚焦的过程缓慢，典型的运行时间为4小时，在该过程中产生了高水平的蛋白降解，严重限制了纯化的蛋白复合物的大规模生产中FF-IEF的使用。发明概述大量实验后，本发明人已鉴定了用于纯化诸如热休克蛋白/肽复合物(HspC)的应激蛋白-肽复合物的改良的方法，所述方法可用来纯化可安全用于疫苗生产的多应激蛋7白-肽复合物。该方法以表面电荷而非等电点为基础分离蛋白复合物。尤其是，已鉴定了允许包括复合于肽片段的应激蛋白的蛋白复合物的快速纯化的纯化方法，所述应激蛋白比如热休克蛋白，其中纯化的产物的产量足以允许制备用于制备疫苗组合物的商业上可接受的量的蛋白复合物。有利地，由于纯化过程中没有引入药学上不可接受的或不想要的添加剂或组分，纯化的蛋白复合物可用于制备疫苗制备物。特别地，本发明人已鉴定了对防止应激蛋白复合物的裂解或部分解离的特定缓冲条件的要求。因此，纯化方法有利地降低或改善了当纯化蛋白复合物用于疫苗组合物中以引起针对其的免疫应答时所述纯化蛋白复合物的解离和功能丧失，并同时消除了使用离液剂或其它化学物诸如表面活性剂以提高经历纯化的蛋白复合物的溶解度的需要。最令人惊讶的是，当与针对利用不使用本发明的缓冲条件的标准方法分离的相似复合物引起的免疫相比较时，利用本发明的方法纯化的热休克蛋白/抗原肽复合物(HspC)富集的制备物(HEP)在接种疫苗的受治疗者中引起了显著增强的免疫。本发明人已进一步鉴定了，当细胞裂解物在含有二磷酸腺苷(ADP)和至少一种二价阳离子的缓冲液中被缓冲时，或在一些实施方案中仅使用至少一种二价阳离子时，可进一步增强本发明的纯化的蛋白复合物用于制备疫苗制备物的效用。并且，利用本发明的改良的方法纯化的热休克蛋白/抗原肽复合物(HspC)富集的制备物(HEP)与包括至少一种二价阳离子和任选地二磷酸腺苷(ADP)的缓冲液相结合在施用所述复合物的受治疗者中引起了甚至更强的保护性免疫应答。根据本发明的第一方面，提供了用于从源混合物中纯化在应激蛋白和多肽之间形成的应激蛋白复合物的方法，所述方法包括以下的步骤(i)提供包括至少一种靶应激蛋白复合物的源混合物，所述靶应激蛋白复合物包括复合于多肽的应激蛋白，(ii)确定待从所述源混合物中纯化的至少一种靶应激蛋白复合物的等电点 (Pi)；(iii)从包括所鉴定的靶应激蛋白复合物的所述源混合物中制备澄清的细胞裂解物；(iv)使所述细胞裂解物经受利用离子交换的纯化，其中所述细胞裂解物被包括至少一种二价阳离子的第一缓冲液缓冲至靶应激蛋白复合物的pi的2个单位内的pH，并且其中第二缓冲液提供了用来洗脱包括靶应激蛋白复合物的混合物的盐梯度。在某些实施方案中，第一缓冲液还包括二磷酸腺苷(ADP)和/或二磷酸腺苷模拟物。在某些另外的实施方案中，至少一种二价阳离子是镁盐，通常是氯化镁(MgCl2)，或锰盐。在又一些另外的实施方案中，二价阳离子以从约0. ImM至约IOOmM的浓度被提供。在一个实施方案中，缓冲液仅包括作为二价阳离子的镁盐，通常为氯化镁(MgCl2)。在某些实施方案中，二磷酸腺苷以从约0. ImM至约IOOmM的浓度被提供。在某些实施方案中，第一缓冲液包括浓度为至少ImM的氯化镁(MgCl2)和浓度为至少ImM的二磷酸腺苷(ADP)。在某些实施方案中，缓冲液还包括HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)，其可以约50mM的浓度而存在。所述缓冲液可具有约pH6. 8的pH。在某些另外的实施方案中，第一缓冲液包括至少一种二价阳离子，但缺少二磷酸腺苷(ADP)、三磷酸腺苷(ATP)、ATP酶和/或、钾或钾盐中的至少一种。在一个实施方案中， 缓冲液仅包括作为二价阳离子的镁盐，通常为氯化镁(MgCl2)。在某些另外的实施方案中，第一缓冲液缺少以下中的至少一种离液剂、表面活性剂和/或两性电解质。离液剂(chaotrope)(也称作离液剂(chaotropic agent)或离液试齐U)包括尿素、盐酸胍和高氯酸锂。已知离液剂用作蛋白变性剂，导致蛋白展开和最终的三维结构的改变。两性电解质是含有酸性基团和碱性基团两者的分子。它们在某些PH范围中主要作为两性离子(具有零静电荷的化合物)存在。表面活性剂可包括阴离子表面活性齐[J，比如SDS，阳离子表面活性剂，比如CTAC、HTAB和DTAB，非离子表面活性剂，比如Tween 20，和两性离子表面活性剂，比如DAPS。在某些实施方案中，第一缓冲液还缺少以下中的至少一种三磷酸腺苷(ATP)、ATP酶、钾，或钾盐。在某些实施方案中，被洗脱的靶应激蛋白复合物的混合物在制备物中提供，所述制备物包括不同热休克蛋白种类的多个应激蛋白。因此，本发明的方法有利地提供了纯化的应激蛋白复合物的混合物，其中该应激蛋白的混合物包括不同的应激蛋白复合物。即，应激蛋白复合物的应激蛋白组分是来源于多个(即，一个以上)热休克蛋白种类或家族的混合物，例如，可以是来源于HSP60种类、 HSP70种类和/或HSP90种类、或来自存在于真核细胞或病原细胞中的任何其他热休克蛋白种类的热休克蛋白的混合物。特别地，存在于病原细胞或感染病原体的细胞的细胞裂解物中的任何应激蛋白复合物可通过本发明的方法来纯化，并因此存在于最终的纯化产物中。 该不同的热休克蛋白的混合物是重要的，因为随后作为疫苗组合物中的免疫原性决定物的纯化的复合物的施用导致由被免疫的宿主针对所述疫苗组合物而引起的增强的免疫应答。 该增强的免疫应答赋予针对受治疗者被免疫接种的病原体的提高的长期保护性免疫。因此，在某些方面，本发明延伸到从获自病原细胞、感染病原体的细胞或肿瘤细胞的细胞裂解物中纯化和/或分离多应激蛋白复合物的方法。通常，应激蛋白复合物包括不同应激蛋白种类的应激蛋白。所述纯化的和/或分离的应激蛋白复合物，或包括其的制备物或混合物则可常被用作疫苗组合物中的免疫原性决定物以引起针对所述裂解物来源的病原体或肿瘤细胞、或针对感染所述裂解物来源的细胞的病原体的免疫应答和相关保护性免疫。因此，所述方法将包括以下的步骤(i)从包括所鉴定的靶应激蛋白复合物的源混合物中提供澄清的细胞裂解物；(ii)使所述细胞裂解物经受利用离子交换的纯化，其中所述细胞裂解物用包括至少一种二价阳离子的缓冲液缓冲至所述靶应激蛋白复合物的pi的2个单位内的pH，并且其中使用盐梯度来洗脱靶应激蛋白复合物，知(iii)获得包括多应激蛋白复合物的富集的制备物。在某些实施方案中，纯化和/或分离多应激蛋白复合物或包括其的制备物或混合物包括来源于不同应激蛋白家族的应激蛋白，因此纯化的产物含有应激蛋白复合物的混合物，其中所述应激蛋白可来源于不同的应激蛋白家族，例如，纯化的混合物可包括与肽形成复合物的多个不同的热休克蛋白类型。在某些另外的方面，本发明延伸到纯化的级分或混合物作为疫苗组合物中的免疫原性决定物来制备疫苗组合物的用途，所述纯化的级分或混合物从纯化方法中获得，所述纯化方法通常为离子交换纯化，尤其是根据本发明的方法进行的离子交换色谱，或所述纯化方法使用根据本发明的缓冲液。缓冲液在某些另外的方面，本发明延伸到用于进行蛋白纯化方法的缓冲液，所述蛋白纯化方法尤其是离子交换，比如离子交换色谱，其中所述纯化方法基于对来源于细胞或细胞培养物的蛋白混合物的纯化、分离(isolation)和/或分离(s印aration)以分离和/或纯化来自其的多应激蛋白复合物，其中所述缓冲液包括至少一种二价阳离子。在某些实施方案中，至少一种二价阳离子是镁盐，通常是氯化镁。本文公开了另外适宜的二价阳离子。在某些实施方案中，缓冲液还包括二磷酸腺苷(ADP)。在某些实施方案中，缓冲液缺少以下中的至少一种或全部三磷酸腺苷(ATP)、ATP酶、钾、或钾盐、离液剂、两性电解质和表面活性剂。疫苗组合物在不同的另外的方面，本发明延伸到疫苗组合物，或延伸到介导或引起免疫应答的组合物，其包括通过本发明的方法获得的纯化的HspC富集的裂解物或纯化的和/或分离的多应激蛋白复合物或包括其的制备物或混合物。通常将所述疫苗组合物施用给哺乳动物，尤其是人类，以赋予针对病原体的保护性免疫。然而，由于公知的来自不同物种的应激蛋白之间的高水平的同源性，疫苗组合物可用来接种多种动物。因此，本发明的另一方面提供了疫苗组合物，所述疫苗组合物包括作为免疫原性决定物的通过本发明获得的纯化的HspC富集的洗脱级分或裂解物。在一个优选的实施方案中，本发明提供了疫苗组合物，其包括通过本发明的纯化方法获得的纯化的应激蛋白-多肽复合物(HspC)富集的洗脱级分或裂解物，其中所述裂解物在包括至少一种二价阳离子的缓冲液中被缓冲。该缓冲液还可包括二磷酸腺苷。在某些实施方案中，缓冲液缺少 ATP和/或钾。又一个另外的方面提供了用于在受治疗者中引起免疫应答的疫苗组合物，其中所述免疫原性决定物是利用本发明的纯化方法获得的纯化的和/或分离的多应激蛋白复合物或包括其的制备物或混合物。特别地，本发明的纯化方法包括等电色谱，其使用了本文所描述的缓冲液以提高从源蛋白混合物中纯化的应激蛋白复合物的稳定性并因此提高其免疫原性。在某些实施方案中，纯化的多应激蛋白复合物可以是分离的，从而疫苗复合物包括作为免疫原性决定物的纯化的和分离的复合物作为疫苗组合物的免疫原性决定物。在某些另外的方面本发明提供了根据本发明的疫苗组合物或利用本发明的方法获得的应激蛋白/肽复合物的纯化的和/或分离的混合物用于药物的用途。在某些另外的方面，本发明提供了纯化的应激蛋白-肽复合物的混合物、或包括其的制备物在制备用于治疗传染病或癌性病症或恶性病症的药物中的用途。在某些另外的方面，本发明提供了用于用来治疗或预防传染病或癌性病症或恶性病症的疫苗组合物的通过本发明的第一方面的方法纯化的多应激蛋白-肽复合物或包括其的制备物或混合物。在某些实施方案中，纯化的和分离的应激蛋白复合物或含有其的疫苗组合物作为预防性疫苗来施用。在某些另外的实施方案中，纯化的应激蛋白复合物、包括其的制备物， 或含有其的疫苗组合物作为治疗性疫苗来施用。在不同的另外的方面，本发明延伸到纯化的和分离的应激蛋白复合物或包括其的制备物或混合物、或含有其的疫苗组合物作为加强疫苗以在宿主中增强针对病原体或癌性10抗原产生的免疫应答的用途，先前已通过感染或由于初始疫苗的先前施用而使受治疗者暴露于所述病原体或癌性抗原。本发明的组合物可以是冻干的形式或水性的形式，即，溶液或悬浮液。该类型的液体制剂允许直接从其包装形式中施用所述组合物，而不需要在水性介质中重新构成，且因此对于注射是理想的。组合物可存在于药瓶中，或它们可提供于即用的已填充的注射器中。 注射器可以与针头一起提供或不与针头一起提供。注射器将包括单次剂量的组合物，而药瓶可包括单次剂量或多次剂量(例如，2剂量)。在某些实施方案中，配制根据本发明的疫苗组合物以用于在体内施用给受治疗者，从而其对于可接受的百分比的人类受治疗者赋予了优于每种抗原组分的血清保护标准的抗体滴度。这是评估疫苗在群体中的效力的重要检验。抗原以及高于其时认为宿主针对抗原进行血清转变的相关抗体滴度是熟知的，且所述滴度由诸如WHO的机构所公布。在一个实施方案中，具有统计学意义的受治疗者的样品的80%以上是血清转变的，在另一个实施方案中，具有统计学意义的受治疗者的样品的90%以上是血清转变的，在又一个实施方案中，具有统计学意义的受治疗者的样品的93%以上是血清转变的，在又一个另外的实施方案中，具有统计学意义的受治疗者的样品的96%-100%是血清转变的。选择每个疫苗剂量中的抗原的量为诱导免疫保护应答而在典型的疫苗中无显著的、严重的副作用的量。所述量将根据所用的特定的免疫原而不同。在某些实施方案中，疫苗组合物还可引起Thl淋巴细胞介导的免疫应答。当针对胞内病原体保护受治疗者时所述免疫应答是需要的。在某些实施方案中，包括本发明的纯化的应激蛋白复合物的疫苗组合物在宿主中引起免疫应答，所述免疫应答包括细胞介导的免疫应答和体液(抗体介导的)免疫应答。在不同的另外的方面，本发明提供了产生疫苗组合物的方法，所述方法包括将本发明的纯化的应激蛋白复合物或包括其的制备物或混合物与至少一种药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂相混合的步骤。在本发明的一个实施方案中，提供了用于用来治疗或预防病原性疾病的药物的疫苗组合物，所述病原性疾病比如通过病原细菌的感染导致的，所述病原细菌选自包括但不限于以下的组百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、破伤风梭状芽孢杆菌(Clostridium tetani)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、流感嗜血杆菌 b (Haemophilus influenzae b)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)禾口麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、 伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、月市炎链球菌(Streptococcus pneumonia)、霍舌L弧菌 (Vibrio Cholerae)和脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)。在本发明的另一个实施方案中，提供了用于用来治疗或预防病原性疾病的药物的疫苗组合物，所述病原性疾病比如通过致病病毒或致癌病毒的感染所导致的，所述致病病毒或致癌病毒选自包括但不限于以下的组流感病毒、肝炎病毒、疱疹病毒、HIV、HPV、RSV、多瘤病毒、CMV、EBV、轮状病毒、诺如病毒(Norovirus)和SARS病毒。在本发明的又一个实施方案中，提供了用于用来治疗或预防癌症和肿瘤性疾病的药物的疫苗组合物。此外，还提供了针对由百日咳博德特氏菌、破伤风梭状芽孢杆菌、艰难梭菌、白喉棒状杆菌、流感嗜血杆菌b型、结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌、伤寒沙门氏菌、霍乱弧菌、 肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟氏球菌和病原性病毒和致癌性病毒导致的疾病免疫接种受治疗者 (通常是人类)的方法，所述方法包括向宿主施用免疫保护剂量的本发明的疫苗。每个疫苗剂量中抗原(即，免疫原性决定物)的量被选择为在接种疫苗的受治疗者中引起免疫保护应答而无显著有害副作用的量。抗原的量根据所用的特异性抗原和其如何呈现而不同，然而，应理解针对本发明的纯化的复合物介导的增强的免疫应答将意味着， 当与包括利用本领域中已知的纯化方法获得的相似的量的蛋白复合物的疫苗组合物相比时，将针对利用本发明方法纯化的某一量的复合物介导增强的免疫应答。本发明还提供了纯化的HspC富集的裂解物，或来自其的分离的应激蛋白在接种受治疗者以引起针对病原体来源的传染病或癌症症状或恶性病症免疫的方法中的用途。因此本发明的另一方面提供了针对病原体来源的传染病或癌性病症接种受治疗者的方法，所述方法包括以下步骤-提供疫苗组合物，所述疫苗组合物包括作为免疫原性决定物的根据本发明的方法获得的纯化的应激蛋白复合物富集的制备物，所述纯化的应激蛋白富集的制备物来源于癌细胞、病原体、或感染针对其需要进行保护性免疫的病原体的细胞，并且包括作为纯化的制备物中的混合物的不同的应激蛋白类型，和-以足以在受治疗者中引起针对所述应激蛋白复合物富集的制备物的免疫应答的治疗有效量或预防有效量向受治疗者施用包括应激蛋白复合物富集的制备物的疫苗组合物。如本文所用的，术语“疫苗组合物”意为含有免疫原性决定物的任何组合物，所述免疫原性决定物以能够更好地响应于随后的攻击、病原性感染或肿瘤生成的方式刺激免疫系统。将理解地是，疫苗通常含有免疫原性决定物和任选地含有佐剂，佐剂非特异性地起作用来增强对于免疫原性决定物的免疫应答。在一些实施方案中，受治疗者是动物，通常是人。本发明的方法还可用来纯化用于用来治疗其他动物诸如马、牛、山羊、绵羊、猪和鸟的疫苗组合物的应激蛋白复合物。在某些实施方案中，本发明的纯化的应激蛋白复合物(HspC富集的制备物)来源的微生物病原体可根据其导致疾病或感染而选择。本发明提供的疫苗组合物可预防性地或治疗性地来使用。然而，本发明人认识到因为其生产的经济性和其引起针对肽、或肽和应激蛋白来源的病原体的保护性免疫应答的能力，组合物可特别用作预防性疫苗。本发明人已进一步地令人惊讶地鉴定了利用本发明的方法获得的应激蛋白-肽复合物可作为“加强”接种疫苗，所述加强接种疫苗在受治疗者中增强针对病原体或癌性病症提供的免疫，其中，通过利用活疫苗或减毒疫苗进行接种或通过其中免疫原性决定物为应激蛋白-肽复合物的疫苗组合物进行接种来赋予初始免疫。因此，本发明的又一方面提供了加强在受治疗者中针对病原体来源的传染病或癌性病症的保护性免疫应答的方法，其中所述保护性免疫应答已通过先前施用活疫苗或减毒疫苗、或先前施用包括来源于针对其需要进行免疫的病原体的肽的应激蛋白-肽复合物来引起，所述方法包括以下步骤-提供包括根据本发明的方法获得的应激蛋白/肽复合物富集的制备物的组合物，所述纯化的应激蛋白/肽复合物富集的制备物来源于癌细胞、病原体感染的细胞或针对其需要进行保护性免疫的病原体，且包括作为纯化的制备物中的混合物的不同的应激蛋白类型，和以足以在受治疗者引起针对应激蛋白/肽复合物富集的制备物的免疫应答的量向受治疗者施用包括应激蛋白/肽复合物富集的制备物的组合物。在某些另外的实施方案中，含有应激蛋白/肽复合物的本发明的疫苗可用来在先前利用其他亚单位疫苗、多重亚单位(multi-subunit)疫苗、碳水化合物疫苗或轭合物疫苗被免疫的动物中加强免疫应答。在另一个实施方案中，本发明的应激蛋白/肽复合物疫苗可用来在先前已经利用核酸或活疫苗免疫的动物中加强针对靶抗原的免疫应答。在又一个实施方案中，含有应激蛋白/肽复合物的本发明的疫苗组合物提供在先前针对病原特异性抗原或癌症特异性抗原被免疫的受治疗者中介导的免疫应答的加强。在某些另外的方面中，本发明延伸到用于在动物中加强免疫应答的包括通过本发明纯化的应激蛋白/肽复合物的疫苗组合物，其中所述动物先前已利用包括至少一种病原体来源的抗原、病原体，尤其是减毒病原体，或癌症特异性抗原的疫苗组合物来接种。通常， 肽组分来源于相同的病原体或癌细胞，因此其提供了用于起始接种的免疫原性决定物。在某些另外的方面中，本发明延伸到用于在动物中加强免疫应答的包括通过本发明纯化的应激蛋白/肽复合物的疫苗组合物，其中所述动物先前已暴露于存在于应激蛋白复合物中的病原体或癌症表达抗原。在某些另外的实施方案中，本发明提供了用于制备诸如树突状细胞(DC)的细胞疫苗的组合物，所述树突状细胞已利用本发明的纯化的应激蛋白/肽复合物富集的制备物来脉冲。向受治疗者施用经脉冲的树突状细胞将导致针对应激蛋白/抗原细胞复合物的T 细胞介导的反应。当治疗患有癌性病症或恶性病症的受治疗者时，所述治疗可以是特别有效的。在所述实施方案中，通常，所述应激蛋白/肽复合物来源于癌细胞。在某些实施方案中，本发明的疫苗组合物可用用于诱导免疫应答的组合物来替代，或被引起免疫应答的组合物替代，所述组合物通常包括与本文所描述的疫苗组合物中提供的那些免疫原性决定物相同的免疫原性决定物。

图1显示了来自BCG细菌细胞裂解物的蛋白复合物的纯化的SDS-PAGE分析(A) 和通过蛋白质印迹对这些样品的Hsp71蛋白和Hsp65蛋白的分析(B)。Vl是来自BCG的亲代高速离心裂解物，其被进一步处理而产生V2——利用常规等电聚焦方法纯化的HspC，* V3——利用本发明的第一方法纯化的HEP。图2显示了与亲代裂解物(LSS)和利用常规等电聚焦方法分离的HspC(IEF)相比较，利用本发明的第一方法分离自BCG的HEP(IEX)的免疫原性。图3显示了通过逐步盐梯度来洗脱的来自脑膜炎奈瑟氏球菌的蛋白复合物的纯化的SDS-PAGE分析(A)，和通过蛋白质印迹对这些样品的Hsp70蛋白、Hsp65蛋白和PorA 蛋白的分析(B)。图4显示了与利用常规等电聚焦方法从脑膜炎奈瑟氏球菌分离的HEP(IEF HspC) 相比较，利用本发明的基于等电色谱的纯化方法分离自脑膜炎奈瑟氏球菌的HEP(IEC HspC)的免疫原性。虽然两种HspC显示了比目前的外膜运载体疫苗(H44/760MV)更好的针对异源菌株的调理活性，IEC HspC显示了比IEF HspC更好的跨菌株免疫原性。图5A显示了在ADP+ 二价阳离子存在下从BCG细菌细胞裂解物纯化的HEP的蛋白质印迹分析。泳道1显示了考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE，而泳道2至4分别显示了通过蛋白质印迹对Hsp65、Hsp71和Ag85的识别。图5B显示了在二价阳离子(BCG 001/09)，加 ADP (HspC Vac)或ATP (BCG 002/09)存在下从BCG细菌细胞裂解物纯化的HEP的考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE。图6显示了分离自BCG的HEP的免疫原性。图6A显示了在不存在ADP+ 二价阳离子(IECO疫苗接种))或存在ADP+二价阳离子(记以2疫苗接种)+40 /1%2+)时，由分离自BCG细菌细胞裂解物的HEP疫苗诱导的细胞介导的免疫，与利用活BCG(BCG 8周)的接种与利用BCG初始免疫和HspC加强(BCG/IEC)的接种相比较。图6B显示了在ADP和二价阳离子(Vl)存在下或ATP和二价阳离子(V2)存在下或单独的二价阳离子(V3)存在下，由分离自BCG细菌细胞裂解物的HEP疫苗诱导的Thl偏向的体液免疫，和对于通过利用HspC 疫苗加强的(BCG和VI)目前的活BCG疫苗(BCG)的抗体响应的显著增强。图7A显示了在利用活TB攻击的HEP免疫的动物中肺部菌落计数的减少。利用作为阴性对照的盐水、活BCG细菌(BCG)、在不存在ADP+二价阳离子(IEC)或存在ADP+二价阳离子(IEC)时分离自BCG细菌细胞裂解物的HEP对动物进行免疫，或利用活BGC进行初始免疫并利用通过本发明的改良的方法分离的HEP进行加强免疫(BCG+IEC)。图7B显示了在利用HEP免疫或加强并利用活TB攻击的动物中肺部菌落计数的减少。用作为阴性对照的盐水、活BCG疫苗(BCG)、在存在ADP加二价阳离子(Vl)或单独的二价阳离子(V3)或二价阳离子加ATP以破坏HspC复合物(V2)时分离自BCG细菌细胞裂解物的HEP来免疫动物，或用BCG进行起始免疫并用HEP疫苗进行加强免疫(BCG+V1)。图8显示了不存在ADP和二价阳离子(泳道1至3)时和存在ADP和二价阳离子 (泳道4至6)时，对从脑膜炎奈瑟氏球菌中纯化的HEP中的Hsp60和Hsp70的考马斯蓝染色的SDS-PAGE(泳道1，4)和蛋白质印迹分析。图9显示了通过逐步盐梯度洗脱对来自CHO细胞的HEP的纯化的考马斯蓝染色的SDS-PAGE分析(A)，和通过蛋白质印迹对这些样品的Hsp70的分析(B)和Hsp60的分析 (C)。泳道1 分子量标记物，泳道2 流经，泳道3 洗涤，泳道4 150mM洗脱，泳道5 150mM 洗脱，泳道6 :250mM洗脱，泳道7 :250mM洗脱，泳道8 :350mM洗脱，泳道9 :350mM,泳道10 500mM洗脱，泳道11 :500mM洗脱，泳道12 IM洗脱。发明详述本发明提供了用于纯化包括复合于来自通常为细胞裂解物的源混合物的肽或肽片段的应激蛋白的复合物的混合物的方法。本发明的改良的方法提供了利用基于离子交换的方法纯化的蛋白复合物，而在纯化方法中不需要利用诸如离液剂、表面活性剂和两性电解质(安福灵)的化学物质。所述方法是有利的，因为药物制备物中外来成分的存在一般是不希望的，因为其导致应激蛋白/肽复合物的不稳定性和解离，这可导致应激蛋白复合物具有较低的免疫原性。因此，利用本发明的方法获得的纯化的复合物可用来产生改良的疫苗制备物，其在施用所述疫苗组合物的受治疗者中引起增强的免疫应答。并且，已知ATP 导致应激蛋白/肽复合物的解离。然而，在不存在ATP时，一般认为HspC是非常稳定的，即使在其纯化时使用了诸如去垢剂和7M尿素的离液剂。本发明人已令人惊讶地鉴定了在纯化过程中对于应激蛋白复合物的稳定性的需要，以产生比利用诸如传统等电聚焦(IEF)的纯化方法获得的相似的复合物更具免疫原性的HspC。本发明人已提供了改良的离子交换色谱方法，其不仅由于缓冲液中存在至少一种二价阳离子，比如镁盐而防止了应激蛋白复合物的解离，而且还任选地存在以使应激蛋白复合物的解离最小化的浓度存在于缓冲液中的腺苷二磷酸。稳定的应激蛋白复合物的存在，以及不同类型的应激蛋白的混合物的提供，提供了可在疫苗组合物中用作免疫原性决定物且将引起增强的免疫应答的混合物，所述增强的免疫应答超过利用本领域中已知的方法纯化的应激蛋白复合物引起的免疫应答。本发明的方法还有利地在于，其提供了比先前所用的诸如等电聚焦的蛋白纯化技术具有更高容量的纯化方法，以用于纯化应激蛋白复合物，从而可实现大规模的、商业上可行的、成本有效的含有所述复合物的疫苗的产生。并且，本发明人已令人惊讶地鉴定了利用本发明的方法纯化的应激蛋白复合物比利用诸如传统等电聚焦(IEF)的纯化技术获得的相似复合物更具免疫原性。本发明的改良的方法提供了待利用产生显示增强的免疫的HEP的特定缓冲液组成和条件纯化的蛋白复合物。因此，通过本发明的方法获得的HspC复合物比利用本领域中已知的标准纯化方法纯化的那些更具免疫原性，并可用来产生改良的疫苗制备物。源混合物本发明的应激蛋白通常从源混合物中纯化或分离。在某些实施方案中，源混合物是包括至少一种应激蛋白/肽片段复合物(需要对其进行纯化)和一种或多种污染物的混合物。存在于源混合物中的污染物的非限制性例子可包括除应激蛋白或应激蛋白复合物之外的宿主细胞蛋白、宿主细胞代谢物、宿主细胞组成型蛋白、核酸、内毒素、化学产物相关的污染物、脂质、培养基添加剂和培养基衍生物。在某些实施方案中，源混合物是蛋白混合物，或来源于细胞裂解物或细胞勻浆物。 在某些实施方案中，细胞裂解物或勻浆物来源于原核细胞、通常为病原性原核细胞，其中所述原核细胞可能是胞内病原性细菌或胞外病原性细菌。在某些另外的实施方案中，细胞裂解物可来源于感染原核细胞的细胞。在另外的实施方案中，细胞裂解物或勻浆物来源于真核细胞，比如感染病原体的真核细胞，所述病原体比如原核病原体。在某些实施方案中，细胞裂解物或勻浆物来源于肿瘤细胞、癌细胞团或组织，或来源于活检的细胞。在某些实施方案中，细胞为来源于细胞培养的细胞，其中细胞被转化或被转染。在某些另外的实施方案中，细胞裂解物或勻浆物可从宿主细胞或病原性生物中直接获得，或从感染病原性生物的细胞中直接获得。病原性生物可选自由以下组成的但不限于以下的组(i)病毒，例如，流感病毒、乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒、肝炎病毒(甲型、乙型或丙型)、HIV、麻疹病毒和类似的病毒，(ii)胞内原生动物，比如锥虫；或(iii)感染原核生物的细胞，所述原核生物尤其是胞内细菌，比如分枝杆菌属物种或奈瑟氏球菌属物种的细菌。可利用本发明的方法纯化的源混合物的另外的例子包括，收获的细胞培养液体、细胞培养上清液和条件细胞培养上清液。并且，细胞裂解物可来源于肿瘤细胞。在其中源混合物来源于细胞裂解物或包括细胞裂解物的实施方案中，裂解物可通过本领域中的技术人员已知的任何适宜的方式来获得，包括但不限于(i)机械方式，比如超声处理、空化作用(cavitation)、冻融循环，和使用细胞勻浆器诸如弗氏细胞压碎器 (French press)、Dounce勻浆器或马达驱动的玻璃/TEFLON勻浆器；(ii)利用去垢剂进行细胞裂解；或(iii)通过按需要将细胞与低渗缓冲液或高渗缓冲液相接触而进行渗透性裂解。在中使用细胞裂解来产生源混合物的某些实施方案中，还可将蛋白酶抑制物添加到源混合物中。
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在某些实施方案中，其中源混合物来源于勻浆的细胞制备物，比如细胞裂解物或组织样品，可将勻浆物离心至少一次，例如，在10，OOOg下离心30分钟。然后可收集上清液并对其进行进一步离心，或准备利用本文所描述的基于离子交换的方法对其进行纯化。在某些另外的实施方案中，离心步骤可用过滤步骤来替换或完成。在某些实施方案中，源混合物是蛋白的蛋白混合物，通常为包括多种蛋白的溶液。 在某些另外的实施方案中，源混合物是来源于癌细胞、病原性生物、感染病原性生物的细胞、或包括病原性生物的细胞培养物或感染其的细胞的细胞裂解物。在某些实施方案中，本发明的方法可用来从天然来源或生物合成来源提取、纯化和/或获得蛋白复合物。在某些另外的实施方案中，可使用该方法来从细胞培养或其它蛋白混合物中纯化合成的应激蛋白复合物或重组的应激蛋白复合物。在某些实施方案中，纯化的复合物存在于至少一种级分中，比如洗脱级分。通常， 所述至少一种级分包括一种或多种应激蛋白/肽复合物。所述级分可称作纯化的产物或纯化产物，且还可称作热休克蛋白/抗原肽复合物(HspC)富集的制备物(HEP)。不希望受理论束缚地，本发明人已鉴定，在施用疫苗组合物的受治疗者中可引起增强的免疫应答，所述疫苗组合物包括作为免疫原性决定物的应激蛋白/抗原肽片段复合物，所述应激蛋白/抗原肽片段复合物来源于癌细胞、病原性细胞、感染病原性生物的细胞、或经遗传修饰而表达来源于癌细胞或在宿主中导致传染病的病原体的异源蛋白的原核细胞或真核细胞，其中所述异源蛋白导致当向受治疗者施用时导致待针对其的免疫应答。 因此，在某些实施方案中，纯化的产物通常包括抗原肽/热休克蛋白复合物的混合物。应激蛋白在某些实施方案中，应激蛋白复合物可以是包括复合于肽片段的热休克蛋白的热休克蛋白复合物(HspC)。在某些实施方案中，热休克蛋白可以是来源于待纯化的细胞裂解物的任何适宜的热休克蛋白。在某些实施方案中，热休克蛋白可选自包括但不限于以下的组的种类中的任何一种hsp20-30kD ；hsp40 ；hsp60 ；hsp70 ；hsp90和hsplOO。在某些另外的实施方案中，应激蛋白可以是分类为伴侣蛋白的蛋白。所述蛋白可包括但不限于选自由以下组成的组的蛋白DnaK、DnaJ, GroEL, GroES, hspX、acr2、AAA+、clpA/B、HtpG、TRIC、CCT, IbpA、IbpB、钙网织蛋白、hsp40、hsp70、hsp72、hsp90、grp94、grp75、BiP/grp78、grp75/mt、gp96 禾口小型 hsp。在某些实施方案中，靶应激蛋白复合物包括来源于宿主细胞的热休克蛋白/抗原肽片段复合物，所述宿主细胞经遗传修饰以组成型地表达应激蛋白基因，和/或表达异源蛋白，比如抗原肽或肽片段。在某些另外的实施方案中，细胞可以是表达异源基因的宿主细胞，例如感染包括感兴趣的抗原基因的杆状病毒载体构建物的昆虫细胞。在另一些实施方案中，细胞可以是来源于人类或动物受治疗者的癌细胞。在某些实施方案中，其中提供了复合物的混合物，这可包括一个特定家族的热休克蛋白，例如，hsp70家族或hsp60家族，尽管优选地是，混合物包括来源于不同家族的不同热休克蛋白复合物。本发明的方法将提供用于纯化包括复合于(抗原)肽片段的热休克蛋白的所有复合物的方法，而与抗原肽或肽片段的身份、分子量或大小无关。在某些另外的实施方案中，热休克蛋白/抗原肽复合物(HspC)富集的制备物(HEP)包括来自不同应激蛋白家族或种类的热休克蛋白，比如hsp60、hsp65、hsp70和 hsp90，所述家族利用本发明的方法作为混合物被共纯化。在某些另外的实施方案中，热休克蛋白/抗原肽复合物(HspC)富集的制备物 (HEP)可以是特定分子量的热休克蛋白/肽片段复合物。在某些实施方案中，应激蛋白复合物具有在50KDa至900KDa范围内的分子量。抗原肽片段在某些实施方案中，与应激蛋白结合以形成应激蛋白复合物(HspC)的多肽是肽片段，即，肽片段是较大的多肽或蛋白的片段。通常，肽是抗原性肽，即，在施用所述肽的宿主细胞中介导针对多肽的促炎反应。肽或抗原肽将适宜于在施用应激蛋白复合物的宿主中产生针对其的T细胞介导的(细胞介导的)免疫应答或抗体介导(体液)的免疫应答。通常，多肽来源于病原体，或感染需要针对其进行免疫应答的病原性细胞的细胞。在某些另外的实施方案中，多肽来源于恶性细胞或癌细胞，或含有其的细胞裂解物，其中多肽或肽片段是肿瘤特异性抗原。在某些实施方案中，肽以非共价的方式复合于应激蛋白。在某些另外的实施方案中，通过共价键的方式将肽复合于应激蛋白。在某些实施方案中，肽片段是来源于病原性生物的抗原性肽片段，其中所述病原性生物通常在宿主中导致传染病。在某些实施方案中，病原性细胞可以是原核细胞，比如革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌或胞内细菌病原体或胞外细菌病原体。在某些另外的实施方案中，病原体是病毒病原体，或来源于其的肽片段。在某些另外的实施方案中，病原体可以是原生动物，寄生虫或真菌，比如酵母。在某些实施方案中，抗原性肽来源的病原性细胞可来源于原核生物，所述原核生物选自由以下组成但不限于以下的组埃希氏菌属(Escherichia)、链球菌属 (Streptococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、博德特氏菌属(Bordetella)、棒杆菌属(Corynebacterium)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、奈瑟氏球菌属(Neisseria) > Bfil 菌属(Haemophilus)、放线菌属(Actinomycetes)、链霉菌属(Streptomycetes)、诺卡氏菌属(Nocardia)、肠杆菌属(Enterobacter)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、弗朗西斯氏菌属(Fancisella)、巴斯德杆菌属(Pasturella)、莫拉氏菌属(Moraxella)、不动杆菌属 (Acinetobacter)、丹毒丝菌属(Erysipelothrix)、布兰汉氏球菌属(Branhamella)、放线杆菌属(Actinobacillus)、链杆菌属Gtr印tobacillus)、利斯特氏菌属(Listeria)、鞘杆菌属(Calymmatobacterium)、布鲁氏菌属(Brucella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)、密螺旋体属(Tr印onema)、沙门氏菌属(Salmonella)、克雷伯氏菌(Kleibsiella)、弧菌属(Vibrio)、变形杆菌属(Proteus)、欧文氏菌属(Erwinia)、 包柔氏螺旋体属(Borrelia)、钩端螺旋体属(L印tospira)、螺菌属(Spirillum)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、志贺氏菌属(Shigella)、军团菌属(Legionella)、假单胞菌属O^seudomonas)、气单胞菌属(Aeromonas)、立克次氏体属(Rickettsia)、衣原体属 (Chlamydia)、包柔氏螺旋体属(Borrelia)和枝原体属(Mycoplasma)的成员。在某些实施方案中，抗原肽片段可以是病毒肽。肽可能来源的病毒可以选自由以下组成但不限于的组人类免疫缺陷病毒(HIV)、甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒 (HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、任何其他肝炎相关病毒、人乳头瘤病毒(HPV)、尤其是高风
17险的原癌人类乳头瘤病毒类型、Kaposi氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)(还称作人类疱疹病毒-8(HHV-8))，单纯疱疹病毒(HSV)(任何亚型)、呼吸道合胞病毒(RSV)和相关的呼吸道病毒，流感病毒包括禽流感病毒和猪流感病毒，尤其是如果当这些可传染至人类时，冠状病毒包括SARS相关冠状病毒(SARS-CoV)、鼻病毒、腺病毒、SIV、轮状病毒、人乳头瘤病毒、 虫媒病毒、麻疹病毒、脊髓灰质炎病毒、风疹病毒、腮腺炎病毒、乳多泡病毒、巨细胞病毒、 水痘带状疱疹病毒、水痘病毒、汉坦病毒和任何新兴病毒(emergent virus)，尤其是依波拉病毒、马尔堡病毒、西尼罗病毒(West Nile virus，WNV)，圣路易斯脑炎病毒(St Louis Encephalitis virus，SLEV)、裂谷热病毒(Rift Valley Fever virus，RVFV)和布尼亚病毒科的其他成员。在某些实施方案中，其中抗原肽片段来源于原生动物病原体，原生动物通常可以为胞内原生动物，比如利什曼虫或锥虫。在其中抗原肽片段来源于酵母或真菌的实施方案中，所述真菌可来源于选自包括以下的组的属枝顶孢属(Acremonium)、链格孢属(Alternaria)、淀粉霉属 (Amylomyces)、Arthoderma、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、芽生裂殖菌属(Blastochizomyces)、葡萄孢属(Botrytis)、假丝酵母属(Candida)、枝孢属(Cladosporium)、隐球菌属(Crytococcus)、网柄菌属(Dictyostelium)、金孢子菌属(Emmonsia)、镰孢菌属(Fusarium)、地丝菌属(Geomyces)、地霉属(Geotrichum)、微 ？包子属(Microsporum)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉菌属 (Penicillium)、倚囊霉属(Pilaira)、马拉色菌属(Pityrosporum)、根霉属(Rhizopus)、红酵母属(Rhodotorula)、酵母属(Saccharomyces)、葡萄穗霉属(Stachybotrys)、毛藓菌属 (Trichophyton)、丝孢酵母属(Trichoporon)或耶罗威亚酵母属(Yarrowia)。在某些实施方案中，抗原肽片段可来源于肿瘤细胞。在这样的实施方案中，通常抗原肽片段是肿瘤特异性抗原或肿瘤特异性抗原的片段。在某些实施方案中，肿瘤细胞可来源于癌性病症或恶性病症，所述癌性病症或恶性病症选自包括但不限于以下的组急性和慢性骨髓性白血病(AML，CML)、滤泡性非霍奇金淋巴瘤、恶性黑素瘤、毛细胞白血病、多发性骨髓瘤、伴有类癌瘤综合征的类癌瘤和肝转移和淋巴结转移、AIDS相关Kaposi氏肉瘤、肾细胞癌、大肠腺癌、头颈鳞状细胞癌。并且，本领域中的技术人员熟知的是，一些传染病可在其感染的受治疗者中导致癌症。因此，根据本发明的方法纯化的复合物的施用可用来治疗或预防癌症，所述复合物中的多肽来源于传染病。例如，包括来源于人类乳头瘤病毒的多肽的复合物可用来在适宜的受治疗者中治疗或预防子宫颈癌。在某些另外的实施方案中，复合于应激蛋白的抗原肽片段是通过重组方法在宿主细胞中表达的异源蛋白或肽片段，所述重组方法例如通过导入到载体或相似构建体的宿主细胞。在某些实施方案中，异源抗原可来源于细菌病原体、病毒病原体，或是肿瘤特异性抗原。在某些另外的实施方案中，宿主细胞可以是被胞内病原体感染的真核细胞。在这样的实施方案中，应激蛋白复合物可包括来源于宿主细胞的热休克蛋白，其复合于来源于胞内病原体的抗原肽片段，或包括二者均来源于胞内病原体的应激蛋白和肽片段。在本发明的某些实施方案中，源混合物是细胞裂解物，其产生自暴露于诱导适宜于导致应激蛋白(通常是热休克蛋白)的诱导型表达(与组成型表达相对)的刺激的应激下的细胞群体。在某些实施方案中，诱导刺激的应激选自包括但不限于以下的组热休克、 渗透压休克、压力和营养匮乏。在某些另外的实施方案中，应激诱导通过对细胞进行遗传修饰以导致热休克蛋白基因的组成型表达来实现。在一个这样的实施方案中，遗传修饰是在微生物病原体中阻抑应激蛋白表达的抑制基因的失活，所述抑制基因例如hspR和HrcA抑制基因。其它这样的遗传修饰描述于W02002/020045和其中的参考文献中。对于应激蛋白的非遗传诱导，诱导应激蛋白的最佳条件可易于通过简单试验来确定，且关于利用常规技术的应激蛋白生成水平来评价应激刺激改变的作用的误差， 所述常规技术比如Current Protocols in Immunology (最新免疫学实验方案)，Wiley Interscience，1997中描述的那些。其他这样的条件描述于WO 2001/013944和其中的参考文献中。在一个实施方案中，利用本发明的方法纯化的至少一种热休克蛋白/抗原肽复合物(HspC)富集的制备物(HEP)包括热休克蛋白/抗原肽片段复合物(HspC)，其包括但不限于 hspC65、hspC70、hspC90 和 hspClOO。离子交换条件本发明的方法基于利用基于离子交换色谱的方法分离蛋白。然而，本文描述的方法已通过去除通常存在于缓冲液中的可能对蛋白结构和完整性具有不利影响、可导致蛋白复合物的解离或部分解离，或可导致纯化的级分中存在污染物的化学物而改良，超越了本领域中目前所用的标准离子交换色谱方案和方法。因此该方法使用了修改的离子交换方法以产生包括应激蛋白复合物的富集的制备物或纯化的制备物，其还可被称作HEP(HspC富集的制备物)。离子交换色谱(IEC)基于存在于样品混合物(细胞裂解物)中的蛋白和固定于所用的树脂或基质上的电荷之间的电荷-电荷相互作用。离子交换色谱可采取阳离子交换色谱的形式，其中带正电荷的离子与带负电荷的树脂结合，或采取阴离子交换色谱的形式，其中蛋白与具有负电荷的离子结合，并且固定的官能基质或树脂具有正电荷。将存在于样品混合物中的蛋白与树脂结合后，利用起始缓冲液洗涤柱子以使其平衡。通常该缓冲液是低离子强度的。在本发明的方法中，本发明人采用了使用包括至少一种二价阳离子的缓冲液， 所述二价阳离子诸如镁或锰，其通常以盐形式来提供，比如氯化镁。缓冲液还可包括二磷酸腺苷，其以将显著抑制应激蛋白/肽复合物的解离的水平存在于缓冲液中。所述缓冲液已由本发明人鉴定为保护应激蛋白复合物的结构稳定性，因为所述缓冲液防止纯化过程中应激蛋白-肽复合物的解离。本发明的方法提供了，通过改变柱中存在的盐梯度将结合的应激蛋白复合物洗脱在级分中，所述改变通常通过使用第二缓冲液来进行，所述第二缓冲液比如氯化钠或基于氯化钠的溶液。收集洗脱的级分，且在不同的Pl (等电点)下洗脱的级分含有不同应激蛋白复合物。因为已经鉴定了所期望的蛋白复合物的pi，含有感兴趣的复合物的洗脱级分将是可易于鉴定的。通常本发明的方法将导致应激蛋白复合物的纯化的(或分离的)混合物。与导致一个家族(比如HSP70)的应激蛋白复合物的回收的基于传统离子交换色谱的纯化方法不同，本发明的方法提供了纯化的产物(其也可称作分离的产物)， 其中存在不同应激蛋白的混合物。例如，如果细胞裂解物来源于感染病原体的真核细胞，则所得的纯化的产物可包括应激蛋白复合物，其中应激蛋白为HSP60或HSP70中的至少2种。 发现存在于细胞裂解物中的任何其他热休克蛋白也可存在于纯化的产物中。并且，如果在制备细胞裂解物的过程中还裂解了感染真核细胞的病原体，则本发明的方法还允许病原体来源的应激蛋白/肽复合物存在于纯化的产物中。例如，纯化的产物可包括应激蛋白复合物的混合物，其中应激蛋白可选自包括以下的组HSP40、HSP60、HSP70、HSP84、HSP90、Dna-K 禾口 Dna-J0等电点(pi)是特定分子诸如本发明的蛋白复合物没有净电荷时的pH。蛋白或蛋白复合物的Pi值可从其一级序列来确定，或利用常规的等电聚焦技术和商业上可获得的设备经验获得。蛋白复合物的Pl值可用来影响特定PH处的蛋白的溶解度。蛋白分子含有酸性官能团和碱性官能团二者。并且，氨基酸可以是带正电荷的、带负电荷的或中性的。这些因素赋予蛋白其整体电荷。在低于其Pl的PH处，蛋白携带净正电荷。在高于其pi的pH 处，蛋白携带净负电荷。蛋白在等于其Pl的PH下在盐溶液中具有最小的溶解度。这可导致蛋白复合物从溶液中沉淀出来。因此可期望地是，当根据本发明的方法改变盐梯度时，PH 不会从其起始PH下降，因为这可导致蛋白复合物从溶液中沉淀出来。因此，通常设定pH之后，将不再使其升高。在某些实施方案中，盐梯度的升高导致PH的升高。这样，在一些实施方案中，方法包括改变柱基质中所用的缓冲液的盐浓度，例如通过使用包括氯化钠的缓冲液来进行改变。通常缓冲液中的盐梯度的此改变导致应激蛋白复合物被洗脱，通常被洗脱在与盐浓度的改变相对应的级分中。因此，在某些实施方案中，渐进式添加洗脱缓冲液提供了盐梯度。通常，洗脱缓冲液含有氯化钠(NaCl)，且可通过改变基质所暴露的洗脱缓冲液中的氯化钠的存在来改变盐梯度。在某些实施方案中，氯化钠可以150mM、250mM、350mM或500mM的浓度存在于缓冲液中。在某些实施方案中，洗脱缓冲液提供了 PH梯度，其可随缓冲液的成分的改变而改变。在某些实施方案中，洗脱缓冲液包括至少一种二价阳离子，和任选地二磷酸腺苷。在某些实施方案中，应激蛋白复合物存在于被洗脱的收集的级分中，且具有从Pl 4到pi 8的范围内的pi。在某些实施方案中，可首先通过等电聚焦来确定待纯化的应激蛋白的pi。在某些实施方案中，不在尿素或相似的化合物或溶液存在下进行纯化方法(即， 在不存在尿素或相似的混合物或溶液时进行纯化方法)。在某些另外的实施方案中，在纯化方法中不使用两性电解质、离液剂和/或表面活性剂。在某些优选的实施方案中，缓冲液含有至少一种二价阳离子且还可含有二磷酸腺苷。通常该方法包括以下步骤(i)将源混合物应用于离子交换基质，( )调节pH，改变跨越离子交换基质的盐梯度，和(iii)收集洗脱的级分，其中所述级分包括纯化的或富集的应激蛋白复合物，所述纯化的或富集的应激蛋白复合物的洗脱通过在特定的条件下改变盐梯度而发生。在某些实施方案中，基质是树脂。在另外的实施方案中，基质是膜。通常基质包括带电粒子。在某些实施方案中，离子交换利用离子交换膜吸附器(absorber)来进行，所述离子交换膜吸附器用来将复合蛋白混合物分离成碱性级分和酸性级分。本发明人已鉴定该离子交换的形式导致方便、快捷和可重复的方法，且因此所述方法可产生持续高产量的保持其完整性的稳定的应激蛋白复合物，这将是产生商业品质的疫苗制备物所需，所述疫苗制备物包括作为免疫原性决定物的蛋白组分，比如应激蛋白-肽复合物。并且，在某些实施方案中，其中应激蛋白复合物用作疫苗组合物的制备物中的免疫原性决定物，并且其中在包括至少一种二价阳离子、和在某些实施方案中包括二磷酸腺苷的缓冲液的存在下纯化应激蛋白复合物，本发明人已鉴定，所述应激蛋白复合物具有介导或增强通过使用上述疫苗引起的免疫应答的较强能力，因为复合物保持了更稳定的状态，即，复合物不会解离以变为分离的应激蛋白和肽片段。在某些实施方案中，缓冲液缺少三磷酸腺苷(ATP)、ATP酶、钾、或钾盐、离液剂、两性电解质和表面活性剂中的至少一种。在一个实施方案中，利用技术人员已知的任何适宜的洗脱缓冲液可将热休克蛋白 /抗原肽复合物(HspC)富集的制备物(HEP)从离子交换色谱介质中洗脱以维持蛋白完整性。通常洗脱缓冲液包括盐，比如如前文所描述的氯化钠。洗脱缓冲液还可包括磷酸缓冲液或基于TRIS的缓冲液，醋酸盐、柠檬酸盐或氢离子缓冲液。如本文所用的，术语“离子交换”和“离子交换色谱”指色谱过程，其中在pH和电导率的适当条件下，将感兴趣的可离子化的溶质(例如，在细胞裂解物中提供的感兴趣的蛋白复合物)与连接于固相离子交换物质的带相反电荷的配体相互作用，从而感兴趣的溶质比混合物中的溶质杂质或污染物更多地或更少地与带电荷的化合物非特异性地相互作用。 可将混合物中的污染溶质比感兴趣的溶质更快地或更慢地从离子交换物质的柱中洗涤，或结合至树脂或从树脂中排出。“离子交换色谱”特异性地包括阳离子交换色谱、阴离子交换色谱和混合型色谱。在某些实施方案中，离子交换色谱介质包括离子交换柱。通常，离子交换柱包括高流动基质，比如琼脂糖或琼脂糖凝胶高流动基质。任选地，高流动基质包括表面延伸齐U，比如无动物葡聚糖。适宜的离子交换介质包括阳离子交换树脂和阴离子交换树脂二者，以及包括用季铵盐和磺酸基团衍生的那些的柱，例如CAPT0Q 柱和CAPT0S 树脂(GE Healthcare Limited)。在另外的实施方案中，离子交换色谱介质包括混合的多重离子交换树脂，例如，Capto MMC 柱和 CAPT0 粘附柱(Adhere column) (GE Healthcare)。在某些实施方案中，细胞裂解物被缓冲交换到50mM的磷酸缓冲液pH6. 8中。在某些实施方案中，离子交换柱包括高流动基质，优选地为琼脂糖高流动基质。在某些实施方案中，高流动基质包括表面延伸剂，例如，无动物葡聚糖，和Q配体，例如，季铵盐。短语“离子交换物质”指带负电荷的固相(即，阳离子交换树脂)或带正电荷的固相(即，阴离子交换树脂)。在一个实施方案中，可通过将一个或多个带电荷的配体(或吸附剂)结合到固相上来提供电荷，例如，通过共价连接来结合。可选地，或另外地，电荷可以是固相的内在属性(例如，在二氧化硅的情况下，其具有总负电荷)。在某些实施方案中，其中离子交换色谱是阳离子交换色谱，阳离子交换色谱步骤使用的配体选自包括但不限于以下的组磺酸盐、羧酸盐、羧甲基磺酸、磺酸异丁基、磺乙基、羧基、磺丙基、磺酰基、sulphoxyethyl和正磷酸盐。“阳离子交换树脂”指带负电荷的固相，且其具有游离的阳离子以用于与流过或经过固相的水溶液中的阳离子进行交换。可使用任何与固相连接的适宜于形成阳离子交换树脂的带负电荷的配体，例如，羧化物、磺酸盐和本文以下所描述的其他配体。商业上可获得的阳离子交换树脂包括，但不限于，例如，具有基于磺酸的基团的那些(例如，来自 GE Healthcare 的 MonoS、MiniS、Source 15S 和 30S，SP Sepharose FAST FLOW , SP 琼月旨糖高效液相(SP Sepharose High Performance)，来自 iTosoh 的 iToyopearl SP-650S 和 SP-650M, ^ g BioRad ^ Macro-Prep High S^g Pall Technologies ^ Ceramic HyperD
21S、Trisacryl M和LS SP和Spherodex LSSP)；基于磺基乙基的基团(例如，来自EMD的 Fractogel SE，或来自 Applied Biosystems 的 Poros S—10 禾口 S—20)；基于磺丙基的基团 (例如，来自 iTosoh 的 TSK Gel SP 5PW 和 SP-5PW-HR,来自 Applied Biosystems 的 Poros HS-20和HS 50)；基于磺异丁基的基团(例如，来自EMD的Fractogel EMD S03)；基于磺乙基的基团(例如，来自Whatman的SE52、SE53和Express-Ion S)，基于羧甲基的基团(例如，来自 GE Healthcare 的 CM Sepharose Fast Flow,来自 Biochrom Labs Inc. 白勺 Hydrocell CM, ^ g BioRad ^ Macro-Prep CM， 自 Pall Technologies ^ Ceramic HyperD CM, Trisacryl M CM, Trisacryl LS CM，自 Millipore 白勺Matrex Cellufine C500 和 C200，来自 Whatman 的 CM52，CM32, CM23 和 Express-Ion C，来自 iTosoh 的 iToyopearl CM-650S, CM-650M和CM-650C)；基于磺酸和羧酸的基团(例如，来自J. T. Baker的 BAKERBOND Carboxy-Sulfon)；基于羧酸的基团(例如，来自 J. TBaker 的 WP CBX，来自 Dow Liquid S印arations的DOWEX MAC-3，来自Sigma-Aldrich的两性电解质弱阳离子交换剂 (Amberlite Weak Cation Exchangers), DOWEXTM 弱阳离子交换剂(DOWEXTM Weak Cation Exchanger)和 Diaion 弱阳离子交换剂(Diaion Weak Cation Exchangers)和来自 EMD 的 Fractogel EMD C00-)；基于磺酸的基团(例如,来自 Biochrom Labs Inc.的 Hydrocell SP,来自Dow Liquid Separations的DOWEXTM细筛目强酸阳离子树脂，来自J. T. Baker 的 UNOsphere S, WPSulfonic，来自 Sartorius 的 Sartobind S 膜，来自 Sigma-Aldrich 的 Amberlite强阳离子交换剂，DOWEXTM强阳离子和Diaion强阳离子交换剂)；和基于正磷酸的基团(例如，来自Whatman的pi 1)。如果需要的话，可用阳离子交换膜代替阳离子交换树脂，例如，Sartobind S (Sartorius ；Edgewood, NY)。在其中离子交换色谱是阴离子交换色谱的某些实施方案中，阴离子交换色谱步骤可使用选自由以下组成的组的配体季铵或胺，二乙胺、二乙胺丙基、氨基、三甲基铵乙基、 三甲苄基铵、二甲基乙醇苄基铵、多胺。“阴离子交换树脂”指带正电荷的固相，从而具有与其连接的一个或多个带正电荷的配体。可使用与固相结合的适宜于形成阴离子交换树脂的任何带正电荷的配体，比如季铵基团。例如，AEC中所用的配体可以是季铵，比如季烷基胺和季烷醇胺，或胺、二乙胺、二乙胺丙基、氨基、三甲基铵乙基、三甲苄基铵、二甲基乙醇苄基铵、和多胺。可选地，对于AEC， 可使用具有带正电荷配体的膜，比如以上所描述的配体来替代阴离子交换树脂。商业上可获得的阴离子交换树脂包括但不限于，来自Applied Biosystems的 DEAE 纤维素、Poros PI 20、PI 50、HQ 10、HQ 20、HQ 50、D 50，来自 GE Healthcare 的 MonoQ、MiniQ、Source 15Q 禾口 30Q、Q、DEAE 禾口 ANX Sepharose Fast Flow、Q Sepharose high Performance、QAE SEPHADEXTM 和 FAST Q SEPHAROSETM，来自 J. T. Baker 的 WP PEI、 WP DEAM、WP QUAT，来自 Biochrom Labs Inc.的 Hydrocell DEAE 和 Hydrocell QA，来自 Biorad 的 UNOsphere Q、Macro_Pr 印 DEAE 禾口 Macro—Pr 印 High Q,来自 Pall Technologies 的Ceramic HyperD Q、ceramicHyperD DEAE>Q HyperZ>Trisacryl M禾口LS DEAE、Spherodex LS DEAE、QMA Spherosil LS, QMA Spherosil M，来自 Dow Liquid S 印