专利名称：一种猪源a型流感病毒头部蛋白及其制备方法和应用的制作方法流行性感冒(简称流感)(influenza)是由流感病毒引起的一种人、禽、畜共患的急性传染病。流感病毒在病毒分类上属于正粘病毒科。按照病毒核蛋白(nucleocapside protein, NP)和基质蛋白(matrix protein)的特征，流感病毒分为甲(A)、乙(B)和丙(C) 3个型。根据病毒颗粒表面血凝素(hamagglutinin，HA)和神经氨酸酶( neuraminidase, NA)蛋白抗原性的差别，甲型流感病毒又可进一步分为不同的亚型。目前所发现的甲型流感病毒有16个HA亚型，9个NA亚型。甲型流感病毒于1901年被发现，然而， 人甲型流感病毒直到1933年才被分离出来，它常以流行形式存在，能造成世界性流感大流行。自人流感病毒被发现以来，人甲型流感病毒曾出现过数次亚型毒株即1957年的H2N2 亚型，也称亚洲流感；1968年的H3N2亚型，也称香港流感；1977年的Hmi亚型，也称俄罗斯流感，它们均首发于我国。1997年和1998年在我国香港特别行政区及内地还发现了禽 H5N1和H9N2流感病例。同时，1998年以来WHO每年所公布的流感病毒疫苗株中大多数来自中国。因此，我国被世界公认为流感的多发地。流感病毒的编码产物共有10种蛋白，其中RNA聚合酶有3种，分别为PB1，PB2和PA。 核蛋白(NP)，Ml和M2蛋白、NSl和NS2蛋白以及血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)。除NSl 和NS2为非结构蛋白外，其余均为结构蛋白。甲型流感病毒粒表面有3种结构蛋白，即HA、 NA和M2。HA首先在细胞内质网合成分子量为76kD，含有562-566个氨基酸的HA蛋白前体 (HAO)，随后HAO分子水解成HAl (47kD)和HA2 U9kD)两个多肽，前者含有319-3 个氨基酸，后者含有221-222个氨基酸，两者间靠二硫键相连形成具有典型的I型膜蛋白结构的 HA分子。HA蛋白的大部分位于膜外，近HA2羧基末端的疏水区穿过双层类脂膜，将HA分子镶嵌在膜上。利用X射线衍射技术证实，流感病毒的HA蛋白以三聚体的形式存在于双层类脂膜上，即由3个非共价结合的HA蛋白单体所组成。HA蛋白三聚体可分为呈杆状的基底部和呈球状的头部。病毒的受体结合部位呈浅口袋状，位于HA蛋白的头部，受体结合部位的氨基酸组成在不同亚型病毒HA蛋白中高度保守。HA在病毒复制中起重要作用，它识别并结合宿主细胞表面上的受体，能使病毒囊膜与宿主细胞膜发生融合，并能刺激机体产生保护性中和抗体。NA在新合成病毒粒释放过程中起重要作用，它能防止新合成病毒粒相互聚集在宿主细胞表面，无法释放再去感染新的宿主细胞。它的抗体能减少病毒排泄量和噬斑形成量，但不能中和病毒感染性。M2则起离子通道作用，能使Ml膜打开，病毒RNP (核糖体蛋白)进入胞浆。其余结构蛋白均在病毒粒内部，无法刺激机体产生保护性抗体。HA蛋白是流感病毒的主要抗原之一，其抗体能中和流感病毒的感染，是主要的保护性抗体。分子流行病学研究的结果证明，流感病毒HA基因，主要是HAl编码区在持续不断地、快速的发生突变。造成HA基因快速变化的原因包括其RNA基因本身的快速改变及人群自然选择压力两种因素，前者是由于病毒RNA多聚酶缺少DNA多聚酶所具有的审阅功能，不能纠正RNA复制中的错误，是子代病毒的基因不完全忠实于亲代病毒。后者指人群特异性免疫对HA蛋白进化的作用。当今预防流感的最有效手段仍是流感病毒疫苗的接种，对于流感疫苗的研究从上世纪30年代起就开始进行。1937年鸡胚培养流感病毒获得成功，使大量生产疫苗成为可能。流感病毒灭活疫苗于1941年在美国首次被批准使用。1943年美国开始在军队使用，并证实有效。1945年开始在美国广泛应用。这种早期粗制的疫苗，使用含流感病毒粒的鸡胚尿囊液，经红细胞吸附和释放，进行有限的纯化，然后加强灭活。接种疫苗后，局部和全身的反应都很强。20世纪60年代，超速离心机和层析色谱技术的应用，使病毒粒纯化操作大大提高，制成了纯化全病毒粒疫苗。然而，儿童使用时仍可出现不良反应。如用裂解的纯化疫苗，不良反应就大为减少。1968年美国首次批准使用裂解疫苗。20世纪70和80年代，在裂解疫苗的基础上，又研制出了毒粒亚单位(HA和NA)疫苗。在英国使用证实了免疫效果与裂解苗相同，并可用于儿童。1980年英国首次批准使用，而后扩展到其他国家。为了进一步提高疫苗产量，降低成本，研究出了高产的重配疫苗株。如用在实验室长期适应的A/ PR/8/34(HlNl) (PR8)毒株与野毒株进行重配的疫苗株。这样重配的疫苗株不但具备野毒株的表面抗原(HA和NA)，同时也获得PR8毒株在鸡胚中的复制能力。近来还应用基因克隆技术,在杆状病毒丝蚕系统(baculovirus silk worm system)中获得大量高纯度、高效价的流感毒粒HA亚单位。随着分子生物学的飞速发展，促进了基因工程和蛋白质工程技术的建立。分子生物学的飞速发展，促进了基因工程和蛋白质工程技术的建立。运用此类技术对疫苗进行了多方面的研究。沿着这个方向，流感疫苗已有下列开拓性工作。有人研制NP、 Ml和M2疫苗，因它们抗原性保守并具有型的特异性，故刺激机体所产生的抗体在不同亚型毒株间有交叉保护，具广谱性，不必随流行毒株抗原性变异而改变，但它们目前仍处于试验阶段。MDP-微毒粒疫苗是利用佐剂来提高免疫效果的，日本已开始在志愿者中使用。该疫苗的抗体阳转率较为理想，但有不良反应。近年来发展一种流感DNA疫苗，其不但能使机体产生保护性抗体还产生强烈的细胞应答。但至今仍较一致认为DNA疫苗仍处于婴儿时期， 许多问题仍有待解决。我国生产流感疫苗主要是通过鸡胚培养扩增病毒，而后收集尿囊液中的病毒进行灭活处理，然后与免疫佐剂混合制备成全病毒灭活疫苗。其在生产过程中面临生产周期长生产成本高的问题，而且在生产过程中需要大量的SPF鸡胚。
本发明所要解决的技术问题是提供一种猪源A型流感病毒蛋白。所述流感蛋白为(a)或(b)的蛋白质(a)有SEQID NO. 1所示的氨基酸组成的蛋白质，(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个氨基酸或几个氨基酸且具有流感蛋白抗原性的由(a)衍生的蛋白质。本发明要解决的另一个技术问题是提供一种产所述流感蛋白的基因工程菌。所述基因工程菌为大肠杆菌BL21。所述基因工程菌使用分泌型表达载体，所述表达载体为pET系列。本发明要解决的另一个技术问题是提供一种制备所述流感蛋白的方法。为解决上述技术问题，本发明的具体技术方案为(1)根据GenBank:FJ966082. 1序列，人工合成编码SEQ ID NO. 1所述蛋白质的核苷酸序列 SEQ ID NO. 4 ；
(2)将步骤(1)中得到的核苷酸片段克隆到表达载体pET21a;
(3)将步骤2得到的表达载体转化大肠杆菌BL21；
(4)诱导表达权利要求1所述蛋白质；
(5)纯化步骤(4)得到的蛋白质，得到大量包涵体；
(6)将步骤(5)得到的包涵体进行复性处理，制备有活性的病毒蛋白。所述复性条件为lmL dissolution buffer(6M Guanidine Hydrochloride ； 10% 甘油；IOOmM NaCl ； IOmM EDTA ； IOmM DTT)，4 °C 搅拌溶解；配制 refolding buffer (IOOmM Tris pH8. 0 ；400mM L-Arginine monohydrochloride ；2mM EDTA ；5mM GSH ；0.5mM GSSG)于冰上或4°C预冷；用5mL注射器将溶解后的包涵体约3_5mL分两次每次间隔8小时加入注射器，使之一滴一滴地往refolding buffer内滴下，慢慢搅拌8_10小时。发明原理接种疫苗仍是当今预防流感最有效的一种手段，然而流感病毒抗原性容易变异导致疫苗接种无效，是流感发病和流行至今无法完全控制的主要原因之一。HA头部区是主要的变异部位，可以通过流行病学调查分离到优势血清型的流感病毒毒株，并将其HA头部区基因克隆到本实验所设计的表达载体中，利用大肠杆菌的表达系统以最快的时间大量生产HA头部区蛋白，从而应对流感病毒抗原性的变异。本发明在前期研究基础上，克隆HA头部区亚单位免疫元片段，利用大肠杆菌表达系统以最快的时间大量生产HA头部区蛋白亚单位。本发明可以提高流感病毒HA的产量，每两升培养基可以得到纯化的HA蛋白大于 200毫克。只需5-6天即可得到一批纯化的蛋白，缩短生产时间。由于不会使用流感病毒因此可以保证疫苗的生物安全性，不会出现散毒的危险，而且不需要鸡胚扩增病毒大大降低了生产成本。通过western blotting实验证明纯化获得的HA蛋白可以与流感病毒的多克隆抗体结合(图1)，表明原核表达的HA蛋白具有免疫原性。本发明构建了流感病毒HA头部区蛋白的表达载体，因而可根据需要随着流感病毒抗原性变异而不断改变病毒基因即可获得大量蛋白用于制备疫苗。


图1 HlHA头部蛋白抗原性检测
图2 HlHA头部区蛋白纯化和SDS-PAGE
AiHlHA头部区蛋白纯化B: HlHA头部区蛋白SDS-PAGE检测
图3 HlHA头部区攻毒保护实验。

所述流感蛋白氨基酸组成如SEQ ID NO. 1所示。SEQ ID NO. 1:APLHLGKCNIAGWILGNPECESLSTASSWSYIVETPSSDNGTCYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKTSSWPNHDSNKGVTAACPHAGAKSFYKNLIWLVKKGNSYPKLSKSYINDKGKEVLVLWGIHH PSTSADQQSLYQNADTYVFVGSSRYSKKFKPEIAIRPKVRDQEGRMNYYWTLVEPGDKITFEATGNLVVPRYAFAME RN
所述流感病毒蛋白氨基酸组成还可以为SEQ ID NO. 1所示蛋白中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个氨基酸或几个氨基酸且具有流感蛋白抗原性的蛋白质，如SEQ ID NO. 2
APLQLGKCNIAGWLLGNPECDLLLTASSWSYIVETSNSENGTCYPGDFIDYEELREQLSSVSSFEKFEIFPKT SSWPNHETTKGVTAACSYAGASSFYRNLLWLTKKGSSYPKLSKSYVNNKGKEVLVLWGVHHPPTGTDQQSLYQNADA-YVSVGSSKYNRRFTPEIAARPKVRDQAGRMNYYWTLLEPGDTITFEATGNLIAPWYAFALN ；或 SEQ ID NO. 3
APLQLGKCNIAGWLLGNPECDPLLPVRSWSYIVETPNSENGICYP⑶FIDYEELREQLSSVSSFERFEIFP KESSWPNHNTTKGVTAACSHAGKSSFYRNLLWLTEKEGSYPKLKNSYVNKKGKEVLVLWGIHHPSNSKDQQNIYQN ENAYVSVVTSNYNRRFTPEIAERPKVRDQAGRMNYYWTLLKP⑶TIIFEANGNLIAPRYAFALS 所示，SEQ ID NO. 2及SEQ IN NO. 3蛋白的制备方法参考SEQ ID NO. 1蛋白。
实施例2流感病毒蛋白的制备 1、目的基因的获得
本实验所选择的流感病毒 A/California/04/2009 (Hmi), GenBank:FJ966082. 1，根据 GenBank:FJ966082. 1序列人工全合成(本合成由上海生工生物工程技术服务有限公司)核苷酸序列SEQ ID N0. 4，
gccccatt gcatttgggt aaatgtaaca ttgctggctg■ gatcctgggaaatccagagtgtgaatcactctccacagcaagctcatggtcctacattgtggaaacacctagttcagacaatggaacgtgttacccaggagatttcatcgattatgaggagctaagagagcaattgagctcagtgtcatcatttgaaaggtttgagatattccccaagacaagttcatggcccaatcatgactcgaacaaaggtgtaacggcagcatgtcctcatgctggagcaaaaagcttctacaaaaatttaatatggctagttaaaaaaggaaattcatacccaaagctcagcaaatcctacattaatgataaagggaaagaagtcctcgtgctatggggcattcaccatccatctactagtgctgaccaacaaagtctctatcagaatgcagatacatatgtttttgtggggtcatcaagatacagcaagaagttcaagccggaaatagcaataagacccaaagtgagggatcaagaagggagaatgaactattactggacactagtagagccgggagacaaaataacattcgaagcaactggaaatctagtggtaccgagatatgcattcgcaatggaaagaaatO
2、载体的制备
将PCR产物及表达载体pET2Ia用限制性内切酶进行切割，而后进行DNA电泳，通过DNA凝胶回收试剂盒分别将载体和DNA片段回收出来，在将回收的载体与片段通过T4DNA 连接酶，16°C过夜连接，最后将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞DH5 α中。将得到的重组子分别通过菌液PCR和质粒酶切的方法进行鉴定，表明克隆正确。而后将鉴定好的阳性克隆提取质粒转化到大肠杆菌感受态细胞BL21中。本实验使用的限制性内切酶均是大连宝生物工程有限公司产品。根据使用的限制性内切酶使用Takara公司提供的使用说明选择合适的缓冲液和酶切温度，酶切体系为 20μ L。10ΧΗ Buffer2μ L EcoRl 1 μ LXhol DNA
1 μ L 16 μ L
37°C酶切4小时。回收时使用DNA凝胶回收试剂盒。
连接体系如下
Vector DNA Insert DNA
10XT4 DNA Ligation Buffer T4 DNA Ligase
IOOng Variable
1 μ L 1 μ L
总体系10 μ L，连接混合物置于16°C连接2h，然后4°C过夜。在每个连接体系中载体的摩尔数插入DNA的摩尔数比例约为1 :1或1 :3。连接产物及质粒的转化取_70°C冻存的感受态细胞于冰上融化后，加入连接产物5μ ，轻轻混勻，冰浴30分钟。42°C水浴热激90秒，再迅速放回冰上2min。加入400μ LB 液体培养基，37°C 200r/min-220r/min振荡培养45min后，以恢复质粒的抗性。4°C 4000r/ min离心5min，弃去上清400μ ，将剩余的ΙΟΟμ 菌液混勻后涂氨苄平板，37°C培养30min (平皿正放)，待菌液吸收完全，再将平皿倒置培养约12h - 16h，至单菌落出现。重组子鉴定PCR快速鉴定用无菌牙签挑取细菌转化子，涂抹于无菌的EP管底部，加入20 μ L无菌的蒸馏水，涡旋混勻，煮沸5 min，于冰上骤冷，12，000 r/min离心1 min，取上清用作PCR扩增的模板，进行PCR鉴定，结果标明重组子中含有转化后的质粒。重组质粒酶切鉴定挑取快速鉴定为阳性的重组子，接种到含相应抗性的液体 LB培养基中，37°C 250-300 r/min培养过夜，提取质粒，用适当的限制性内切酶消化，1%琼脂糖凝胶上电泳，紫外灯下观察结果。3、克隆基因表达
小量表达挑取含有正确表达质粒的大肠杆菌BL21单菌落，接种到5mL含有氨苄青霉素的LB培养基中，0. ImM IPTG 37°C诱导4小时，同时设置不加IPTG的空白对照。SDS-PAGE 验证该蛋白的可溶性。大规模表达与纯化挑取新鲜平板上含有正确表达质粒的单菌落接种于2mL含氨苄青霉素的LB液体培养基，37°C震荡培养过夜，然后转接到20mL LB液体培养基中同样培养过夜。将20mL菌液全部转接到2L含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 °C震荡培养约3_5 小时。待0D600达到0. 4左右时加入IPTG至终浓度0. ImM，37°C诱导导4小时，6000 rpm离心收获菌体。菌体在4°C下用PBS重悬后，放置于冰上用超声破碎仪裂解细菌。12，OOOrpm 离心30分钟，弃去上清液用玻璃棒将细菌碎片剥掉，沉淀即为包涵体。4、从包涵体中纯化表达蛋白蛋白质在大肠杆菌中的高水平表达，常常导致形成相差显微镜下可见的细胞质颗粒或包涵体。这些由表达蛋白聚集成的包涵体很容易与可溶性蛋白和膜结合蛋白分离。高水平表达外源蛋白的细菌经离心浓缩后，可通过机械法、 超声处理法或溶菌酶加去污剂的方法进行裂解。包涵体经离心沉淀后可用Triton X-100 和EDTA或用尿素洗涤。洗涤的目的是尽可能从聚集的外源蛋白中除去可溶的、粘附的细菌蛋白。为获取可溶性的活性蛋白，必须将洗涤过的包涵体溶解，然后进行重折叠。HA头部区蛋白包涵体复性的方法
用 washing buffer (0. 5% TritonX-100；50mM Tris pH8. 0；300mM NaCl；IOmMEDTA;10mM DTT)将包涵体悬起。离心后可看到细菌有无完全裂解，若无可以再次超声(4 秒，10秒，43次)，超声条件可以自行调整。超声后12，OOOrpm离心10-20分钟，用washing buffer 洗涤尽量去除细菌碎片。Mresuspension buffer (50mM Tris ρΗ8· 0 ； IOOmM NaCl ； IOmM EDTA ； IOmM DTT)重悬包涵体12，OOOrpm离心10-20分钟弃去上清，并将包涵体称重。 按照 30mg 包涵体力口 ImL dissolution buffer (6M Guanidine Hydrochloride ； 10% 甘油； IOOmM NaCl ；IOmM EDTA ；IOmM DTT)，4°C搅拌溶解。包涵体复性配制 refolding buffer (IOOmM Tris pH8. 0 ；400mM L-Arginine monohydrochloride ；2mM EDTA ；5mM GSH ；0. 5mM GSSG)于冰上或 4°C预冷。用 5mL 注射器将溶解后的包涵体约3-5mL分两次每次间隔8小时加入注射器，使之一滴一滴地往refolding buffer内滴下，慢慢搅拌8-10小时。复性后可用浓缩杯浓缩样品，然后换成适合于此蛋白的缓冲液，再转到浓缩管内浓缩，如果复性体系小的话可直接用浓缩管换液。将得到的蛋白用Superdex 200 (Amersham Biosciences)凝胶过滤柱进一步纯化(图2)，收集含目的蛋白的洗脱峰，用超滤管将蛋白浓缩至约30 mg.mL—1。实施例3蛋白质动物试验 HlHA头部区蛋白免疫原性实验
实验动物^？？鸡对只，每6只分成一组共4组，分别为空白对照组、佐剂对照组、 50 yg抗原量组、100 μ g抗原量组
试剂弗氏完全佐剂、不完全弗氏佐剂购自sigma公司方法分别以纯化的HlHA头部区重组蛋白50 μ g和100 μ g与弗氏完全佐剂混合进行肌肉注射免疫，3周后以相应的抗原与不完全弗氏佐剂混合后加强免疫。同时设空白对照组及佐剂对照组。免疫前及末次免疫后10天收集鸡血清。末次免疫后第21天经鼻腔接种 50 μ L含IO6EID50 A/California/04/2009 (HlNl)病毒量的稀释液，并观察20天监测鸡死亡情况及存活的平均体重变化，结果表明经HlHA头部区蛋白免疫后的SPF鸡死亡率低(图3)。实施例4 HlHA头部区蛋白在亚单位疫苗制备中的应用
将纯化得到的HlHA头部区蛋白，与佐剂混合制成含有流感病毒血凝素的亚单位疫苗， 肌肉注射免疫动物，使动物获得主动性免疫，从而抵抗流感病毒的感染。亚单位疫苗生产中的应用可参考下列文献。[1] Oriol Manuel, Manuel Pascualj Katja Hoschler. Humoral Response to the Influenza A H1N1/09 Monovalent AS03_Adjuvanted Vaccine in Immunocompromised Patients. Clin Infect Dis. 2011 Jan;52 (2):248-56 Robert B. Bel she, Sharon E. Freyj Irene Graham. Safety and immunogenicity of influenza A H5 subunit vaccines: effect of vaccine schedule and antigenic variant. J Infect Dis. 2011 Mar；203(5):666-73
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。


本发明公开了一种猪源A型流感病毒头部蛋白及其制备方法和应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。使用本发明所提供的方法可以提高流感病毒HA的产量，每两升培养基可以得到纯化的HA蛋白大于200毫克。只需5-6天即可得到一批纯化的蛋白，缩短生产时间。此外，由于不会使用流感病毒因此可以保证疫苗的生物安全性，不会出现散毒的危险，而且不需要鸡胚扩增病毒大大降低了生产成本，具有很好的应用前景。