专利名称：一种生产人用狂犬疫苗的方法狂犬病是由狂犬病毒引起的人畜共患的病毒性传染病。人一旦被病畜咬伤致病， 病毒率极高。及时注射疫苗和预防性接种疫苗是临床上有效的防治狂犬病的有效手段。目前市场上存在的狂犬疫苗品种主要有4种第一种是鸡胚、鸭胚疫苗，这种疫苗 产量较低，生产强度大，有外源毒性因子存在可能性；第二种是地鼠肾细胞原代培养疫苗， 同样存在疫苗产量较低，生产强度大，有外源毒性因子存在可能性的问题；第三种是Vero 传代细胞生产的疫苗，该品种可以解决产能问题，但不能保证细胞基质的安全性和致瘤性 的问题，因此该品种疫苗需保证DNA残余量不能超标；第四种是以二倍体细胞为基质的疫 苗，该疫苗由于使用了健康的人二倍体细胞，该细胞不含外源污染因子和致瘤性，并且该细 胞的残余DNA无危险性，因而生产出来的疫苗具有免疫效果好，安全性高的优点。狂犬疫苗的产品质量取决于生产用的细胞基质、病毒毒种，产量取决于生产工艺。 中国专利公开号为CN1274607A的专利申请，公开了一种使用转瓶工艺生产狂犬疫苗的方 法，病毒株为CTN株，该专利由于采用的是转瓶工艺，因而产能较低；中国专利公开号为 CN1712068A的专利申请，公开了应用二倍体细胞生产狂犬疫苗的方法，生产工艺为转瓶，病 毒株为aG株和CTN株，该专利由于采用的是转瓶工艺，因而产能较低；中国专利公开号为 CN101028514A的专利申请，公开了利用生物反应器培养Vero细胞生产狂犬疫苗的方法，病 毒株为PV株，该专利由于使用的细胞基质是Vero细胞，因而存在DNA残余的生物安全性 问题，也没有使用生物反应器的线性放大技术；中国专利公开号为CN101716341A的专利申 请，公开了利用二倍体细胞生产狂犬疫苗的方法，细胞基质为MRC-5、IMR-90、WI 38、2BS、 KMB17，病毒株为PM株。我国一直以来投入大量人力物力致力于防治狂犬病，也取得了一定的成效。然而 狂犬疫苗生产技术发展到现在，仍然存在产能过低，疫苗质量不高的问题。
本发明目的在于提供一种生物反应器线性放大技术利用健康人二倍体细胞生产 狂犬疫苗进行规模化生产的新方法。本发明的方法采用三级或三级以上生物反应器线性放大技术培养人二倍体细胞株，在 每一级的生物反应器中的人二倍体细胞株达到106/ml后进行下一级的生物反应器的接种； 在最后一级生物反应器中人二倍体细胞在微载体上生长到密度达到106/ml以上后，再将狂 犬病毒毒株接种；接种病毒株使得该病毒在细胞上进行增殖，然后收获病毒原液，将收获的 病毒原液进行灭活、浓缩、纯化处理过程后，制备成人用狂犬疫苗。本发明的可以采用的狂犬病毒毒株为PV病毒株、AG病毒株、CTN病毒株、ERA中 的任——种；所用的健康人二倍体细胞株为MRC-5、MRC-9、HFL1、IMR-90、WI38、2BS、KMB17、3CCC-HPF-1P5的任——种。作为本发明的改进，本方法亦可采用狂犬病毒毒株为PM病毒株；所用的健康人二 倍体细胞株为MRC-9、HFL1、CCC-HPF-1P5的任——种。作为本发明的改进，本方法亦可采用的狂犬病毒毒株为Flury病毒株；所用的健 康人二倍体细胞株为LYSSAVAC细胞株。在本发明的生产方法中，生物反应器进行线性放大的方式是将前一级生物反应器 中的细胞通过洗脱后经管道抽取流动的方式接种到下一级生物反应器中。在本发明的生产方法中，所用的细胞培养生物反应器为搅拌式生物反应器。生物 反应器中的微载体为颗粒状微球微载体或者多孔性微载体。(1)、复苏人二倍体细胞(WI-38)，接种到方瓶中；(2)、待细胞长满方瓶后，按1:3的比例放大传代；
(3)、待细胞生长到一定数量时，接种到7.5L生物反应器中；生物反应器的工作体积 5L，配有2-20g/L微载体；
(4)、待7.5L生物反应器内的微载体长满细胞即细胞密度达到106/ml以上时，将细胞 接种到50L生物反应器中；生物反应器的工作体积35L，配有2-20g/L微载体；
(5)、待50L生物反应器内的微载体长满细胞即细胞密度达到106/ml以上时，接种到 500L生物反应器中；生物反应器的工作体积350L，配有2-20g/L微载体；
(6)、待500L生物反应器内的微载体长满细胞即细胞密度达到106/ml以上时，接种PV 病毒株毒禾中；
(7)、每天收获上清液300L，同时取样检测滴度；
(8)、连续收获20-25天病毒原液；
(9 )、将病毒原液经过过滤、浓缩、纯化后，制成狂犬疫苗。第二实施方式
(1)、复苏人二倍体细胞(2BS)，接种到方瓶中；
(2)、待细胞长满方瓶后，按1:3的比例放大传代；
(3)、待细胞细胞密度达到106/ml以上，将细胞接种到14L生物反应器中；生物反应器 的工作体积10L，配有2-20g/L微载体；
(4)、待14L生物反应器内的微载体长满细胞，即细胞密度达到106/ml以上时，将细胞 接种到100L生物反应器中；生物反应器的工作体积70L，配有2-20g/L微载体；
(5)、待100L生物反应器内的微载体长满细胞即细胞密度达到106/ml以上时，将细胞 接种到1000L生物反应器中；生物反应器的工作体积700L，配有2-20g/L微载体；
(6)、待1000L生物反应器内的微载体长满细胞即细胞密度达到106/ml以上时，接种PV 病毒株毒禾中；
(7)、每天收获上清液650L，同时取样检测滴度；
(8)、连续收获20-25天病毒原液；
(9 )、将病毒原液经过过滤、浓缩、纯化后，制成狂犬疫苗。
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第三实施方式
(1)、复苏人二倍体细胞(2BS)，接种到方瓶中；
(2)、待细胞长满方瓶后，按1:3的比例放大传代；
(3)、待细胞生长到一定数量时，将细胞接种到14L生物反应器中；生物反应器的工作 体积10L，配有2-20g/L微载体；
(4)、待14L生物反应器内的微载体长满细胞时即细胞密度达到106/ml以上时，将细胞 接种到100L生物反应器中；生物反应器的工作体积70L，配有2-20g/L微载体；
(5)、待100L生物反应器内的微载体长满细胞即细胞密度达到106/ml以上时，将细胞 接种到1000L生物反应器中；生物反应器的工作体积700L，配有2-20g/L微载体；
(6)、待1000L生物反应器内的微载体长满细胞即细胞密度达到106/ml以上时，接种 CTN病毒株毒种；
(7)、每天收获上清液650L，同时取样检测滴度；
(8)、连续收获20-25天病毒原液；
(9 )、将病毒原液经过过滤、浓缩、纯化后，制成狂犬疫苗。第四实施方式
(1)、复苏人二倍体细胞(MRC-9)，接种到方瓶中；
(2)、待细胞长满方瓶后，按1:3的比例放大传代；
(3)、待细胞生长到一定数量时，将细胞接种到14L生物反应器中；生物反应器的工作 体积10L，配有2-20g/L微载体；
(4)、待14L生物反应器内的微载体长满细胞即细胞密度达到106/ml以上时，将细胞接 种到100L生物反应器中；生物反应器的工作体积70L，配有2-20g/L微载体；；
(5)、待100L生物反应器内的微载体长满细胞即细胞密度达到106/ml以上时，将细胞 接种到1000L生物反应器中；生物反应器的工作体积700L，配有2-20g/L微载体；
(6)、待1000L生物反应器内的微载体长满细胞即细胞密度达到106/ml以上时，接种PM 病毒株毒禾中；
(7)、每天收获上清液650L，同时取样检测滴度；
(8)、连续收获20-25天病毒原液；
(9 )、将病毒原液经过过滤、浓缩、纯化后，制成狂犬疫苗。第五实施方式
(1)、复苏人二倍体细胞(MRC-5)，接种到方瓶中；
(2)、待细胞长满方瓶后，按1:3的比例放大传代；
(3)、待细胞生长到一定数量时，将细胞接种到即细胞密度达到106/ml以上时，将细胞 接种到3L生物反应器中；生物反应器的工作体积2L，配有2-20g/L微载体；
(4)、待3L生物反应器内的微载体长满细胞即细胞密度达到106/ml以上时，将细胞接 种到30L生物反应器中；生物反应器的工作体积20L，配有2-20g/L微载体；
(5)、待30L生物反应器内的微载体长满细胞即细胞密度达到106/ml以上时，将细胞接 种到300L生物反应器中；生物反应器的工作体积200L，配有2-20g/L微载体；
(6)、待300L生物反应器内的微载体长满细胞即细胞密度达到106/ml以上时，接种PV 病毒株毒禾中；(7)、每天收获上清液180L，同时取样检测滴度；
(8)、连续收获20-25天病毒原液；
(9 )、将病毒原液经过过滤、浓缩、纯化后，制成狂犬疫苗。
第六实施方式
(1)、复苏人二倍体细胞(2BS)，接种到方瓶中；
(2)、待细胞长满方瓶后，按1:3的比例放大传代；
(3)、待细胞生长到细胞密度达到106/ml以上时，将细胞接种到3L生物反应器中；生物 反应器的工作体积2L，配有2-20g/L微载体；
(4)、待3L生物反应器内的微载体长满细胞即细胞密度达到106/ml以上时，将细胞接 种到30L生物反应器中；生物反应器的工作体积20L，配有2-20g/L微载体；
(5)、待30L生物反应器内的微载体长满细胞即细胞密度达到106/ml以上时，将细胞接 种到300L生物反应器中；生物反应器的工作体积200L，配有2-20g/L微载体；
(6)、待300L生物反应器内的微载体长满细胞即细胞密度达到106/ml以上时，接种ERA 病毒株毒禾中；
(7)、每天收获上清液180L，同时取样检测滴度；
(8)、连续收获20-25天病毒原液；
(9 )、将病毒原液经过过滤、浓缩、纯化后，制成狂犬疫苗。


一种生产人用狂犬疫苗的方法，采用三级或三级以上生物反应器线性放大技术培养人二倍体细胞株；在每一级的生物反应器中的人二倍体细胞株达到106/ml后进行下一级的生物反应器的接种；在最后一级生物反应器中人二倍体细胞在微载体上生长到密度达到106/ml以上后，再将狂犬病毒毒株接种；接种病毒株使得该病毒在细胞上进行增殖，然后收获病毒原液，将收获的病毒原液进行灭活、浓缩、纯化处理过程后，制备成人用狂犬疫苗。由于使用反应器线性放大技术培养人二倍体细胞，该细胞不含外源污染因子和致瘤性，并且该细胞的残余DNA无危险性，具有免疫效果好，安全性高的优点，符合大规模产业化生产狂犬疫苗的要求。