专利名称：Hla-a0201限制性抗原特异性ctl制备方法一、肿瘤治疗的困境与机会恶性肿瘤已成为人类第一号“杀手”，手术、放疗与化疗是治疗肿瘤的三大常规方法，能在短期内有效的减轻肿瘤负荷，但仍不能有效清除肿瘤细胞。微小残留病灶、对放疗、化疗的部分敏感和耐药是肿瘤复发及转移的根源，而复发与转移正是肿瘤患者死亡的主要原因。常规治疗方法已力不从心，开发新型的肿瘤治疗技术与产品迫在眉睫。二、细胞免疫治疗技术的诞生与发展上世纪80年代起免疫学与肿瘤学的迅速发展，1982年美国NIH Rosenberg教授为首的研究小组研制出淋巴因子活化的杀伤细胞(LAK)免疫疗法，并在后续研究中对LAK细胞的临床应用进行了深入的探讨。但是LAK细胞杀伤力不够强，临床应用需要大量输注(3X ΙΟ.11)，另一方面扩增能力有限，需要在输注细胞的同时大剂量应用白细胞介素-2(IL_2) (10万IU/kg，q8h)，因而产生了相关的不良反应。而后Rosenberg又提出了肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，其杀瘤能力较LAK有了明显提高，并且无需大剂量IL-2联合应用，但细胞需要从肿瘤组织中分离获得，这极大限制其广泛的临床应用。在以上的工作基础上，1991年Stanford大学的Schmidt-Wolf等采用干扰素Y (IFN- y )、IL-2和鼠抗人CD3单克隆抗体(Mouse anti-Human CD3mAb)共同诱导出了具有强大抗肿瘤活性的细胞群,命名为细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)。树突状细胞(DCs)是迄今为止已知的体内功能最为强大的专职抗原递呈细胞(APC)，其表面存在丰富的抗原捕获分子，抗原递呈分子(MHC I类和MHC II类分子)，免疫共刺激分子(⑶80、CD83、⑶86、⑶40等)。经抗原刺激后的DC细胞向淋巴结迁移，将其携带的抗原信息传递给相应的T淋巴细胞，启动、激发CD4+/CD8+T细胞免疫应答，特异性地杀灭肿瘤细胞。同时经抗原刺激后的DCs可分泌白细胞介素-8 (IL-8)、干扰素a (IFN_a)、白细胞介素-12(IL_12)、肿瘤坏死因子a (TNF-a )等，增强机体非特异性免疫应答(天然免疫)，故DC有“天然免疫佐剂”的美称，其发现者Ralph Steinman教授获得2011年诺贝尔医学奖。鉴于DC在机体免疫防御系统中所处的中心地位，基于DC开发的抗肿瘤疫苗已使之成为最先进、最有希望的肿瘤免疫治疗技术之一，近年来国内外学者对其进行了广泛的探索。1992年Stanford医学院的2位教授成立了世界上第一家以DC为基础的肿瘤疫苗公司(Dendreon，CA)，该公司的产品Provenge已于2010年4月29日获得FDA批准上市。但是DC在体内的功能受到患者本身免疫状态，肿瘤微环境的影响，而肿瘤患者体内存在大量抑制因子，因此DC的体内效果并不如体外效果理想。 细胞毒性T淋巴细胞(CTL)构建是近期兴起的免疫治疗技术，因其具有特异、直接杀伤肿瘤靶细胞的能力，因此成为研究的热点。三、CTL作用机理I、机体T细胞免疫反应过程机体存在庞大的T细胞库，通过其表面表达不同的T细胞受体(TCR)特异识别不同的外部抗原分子(细菌、病毒和肿瘤抗原多肽)，被活化为具有杀灭靶细胞的CTL，清除细菌、病毒的感染和肿瘤细胞，且能产生免疫记忆性CTL，防止细菌、病毒的再次入侵和肿瘤的复发。CTL免疫应答大致分四个阶段(I)抗原识别APC通过表面受体识别并捕获抗原(细菌、病毒、肿瘤细胞)；(2)抗原加工与递呈抗原经APC消化、裂解成多肽分子，后者与APC胞内丰富的MHC-I类或II类分子结合分别形成MHC-I-多肽或MHC-II-多肽复合物，并被转运至APC表面；(3) T细胞激活(双信号学说):APC与T细胞相遇，T细胞通过自身TCR识别APC递呈的MHC-I/II-多肽复合物，其中⑶8+T细胞识别MHC-I-多肽复合物，⑶4+T细胞识别MHC-II-多肽复合物，T细胞接受了抗原的刺激信号(第一信号)加上免疫共刺激信号(第二信号)开始活化，具有细胞毒性作用即CTL ；(4)靶细胞杀灭活化CTL循环至抗原所在部位，通过CTL表面的TCR特异识别抗原表达细胞后进行杀伤和清除。但，已发现肿瘤患者体内存在大量免疫抑制因子，影响CTL的有效活化和增殖，数量甚少，不足以与迅速增殖的肿瘤抗衡。若能在体外制备大量抗原特异性CTL并回输给患者，可直接、快速杀伤肿瘤细胞起到治疗作用，对常规治疗无法清除的残留肿瘤细胞进行杀灭，将可以防止肿瘤的复发和转移。2、CTL表型与功能差异根据CTL表面分子的表达种类可分为两型中央记忆型CTL (CTLqi)和效应记忆型CTL(CTLem)。Klebanoff等研究发现表型分析为CD3+CD45R0+CD62L+CCR7+的CTLcm具有更强的抗肿瘤能力Johnson等比较了 MART-I TCR基因修饰的CTL_cm和CTL_EM，结果发现前者消退恶性黑色素瘤细胞的能力是后者的10倍。Berger等研究结果还显示CTL.输注后较表型为CD3+CD45R0+CD62L-CCR7-的CTL_EM在体内能存活更长的时间。3、CTL技术开发现状综合国内、国外CTL体外制备技术可归类为三种方法与来源(I)肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)体外扩增法从肿瘤患者肿瘤组织中分离TIL，加入白细胞介素-2(IL_2)培养，克隆稀释法筛选肿瘤抗原阳性的T细胞克隆，再加入鼠抗人CD3单克隆抗体和IL-2进行扩增培养获得。Li等选择HLA-A201阳性的IV期恶性黑色素瘤患者，将其肿瘤组织制备成单细胞悬液后，加入IL-2培养，5周后筛选扩增细胞中⑶8+T+MART-1+的阳性T细胞克隆，再加入鼠抗人CD3单克隆抗体和辐照后的PBMC饲养细胞扩增培养，次日加入IL-2，再培养12天可获得CTLs，能对负载MART-I多肽的T2细胞株特异性识别和杀伤。(2) TCR基因修饰法TCR是T细胞识别抗原、介导免疫应答的关键分子，包括α、β、Υ、δ四条链，由二硫键连接成α/β和Υ/δ两种异二聚体，其中α/β+T细胞占外周血T细胞的90-95%，是主要的免疫效应细胞。TCR基因修饰即通过外源质粒转染自体T淋巴细胞，导入能识别特异性抗原多肽的TCR基因，挑选阳性克隆，在体外扩增培养获得CTL。较为常用的质粒有逆转录病毒质粒或慢病毒质粒。Morgan等采用抗⑶3+⑶28+磁珠激活⑶8+T细胞，应用慢病毒质粒转染修饰MART-I或gplOO特异性的TCR基因，采用鼠抗人⑶3单克隆抗体和IL-2培养体系制备CTLs，在12天能扩增培养至IO9个细胞，用于15例HLA-A2+的黑色素瘤患者的治疗，结果显示有2例患者出现了明显的临床疗效，I例52岁男性患者的腋窝转移病灶消失，肝转移病灶缩小了 89 %，无病生存期为21个月；I例30岁男性患者，肺部转移病灶消失，无病生存期为20个月。 Peiro等采用白细胞介素-15 (IL-15)和白细胞介素_21 (IL-21)细胞因子组合促进TCR基因转染非增殖的T细胞，可以维持T细胞高表达⑶62L和⑶28。(3)体外抗原致敏法用人工APC(Artificial APC)，或抗原(蛋白质，多肽，或全细胞)体外反复刺激T细胞，获得抗原特异性CTL。浙江大学的发明专利(专利号CN102168066A)体外诱导乙型肝炎病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞的方法即采用该方法。将MHC-I-Ig和抗⑶28mAb包被磁珠构建人工APC，抗原表位肽负载APC后，体外致敏3-4周，再以磁珠吸附分离抗原特异性CTL，Tetramer染色鉴定。上述三种方法的缺陷(I) TIL体外扩增法①需要获得患者的新鲜肿瘤组织作为CTL来源，仅限于可手术的患者，且肿瘤组织来源有限；②TIL分离，CTL克隆的获取与鉴定方法复杂，肿瘤组织中各种细胞成分较多，较复杂，分离细胞的时间长，一般都需要I个月以上；③TIL中混有⑶4+⑶25+Treg亚群，其会抑制CTL扩增效率；④由于体外分离扩增时间长，增加了污染的机会。(2) TCR基因修饰法①外源性质粒(逆转录病毒或慢病毒等)的引入，给临床应用带来一定的风险；②内源性TCR干扰，导入的TCR基因可能并不能导入预期的位点，而与内源性的TCR发生错排，其能识别抗原不是预期设计的，且是未知的，存在很大的风险。(3)体外人工APC负载抗原致敏法①引入外源物质人工APC，制备的CTL是否有人工APC残留仍是疑问；②人工APC体外致敏CTL的周期较长，需要3_4周，获得CTL还需要扩增培养后才能满足临床治疗的需要，因此体外培养的周期长，污染的几率较大。目前还没有文献报导过制备时间短、扩增倍数高、CTL纯度高且杀伤效果好的HLA-A201限制性抗原特异性CTL的制备方法
本发明的目的是针对上述技术问题提供一种制备时间短、扩增倍数高、CTL纯度高且杀伤效果好的HLA-A201限制性抗原特异性CTL的制备方法。本发明的目的是通过下列技术方案实现的HLA-A0201限制性抗原特异性CTL制备方法，该方法包括下列步骤a.第一步CTL前体细胞来源 细胞的富集与纯化方法用自动单个核细胞采集仪(单采仪)采集外周单个核细胞(PBMC)作为细胞来源；采用临床级阴性磁珠分离法，从PBMC中富集、纯化CTL前体细胞即CD8+T淋巴细胞。b.目标CTL诱导与第一轮扩增用负载HLA-A0201限制性目标抗原多肽的成熟树突状细胞(mDC)刺激⑶8+T淋巴细胞，不仅提供给T细胞活化的第一信号(抗原)，同时DC提供给T细胞活化必须的第二信号(免疫共刺激分子⑶40、⑶80、⑶83等)；同时加入rhIL-2和rhIL-7两种细胞因子联合促进T细胞生长，抑制活化诱导的细胞凋亡反应(AICD)，延长活化细胞的生存周期。c.目标CTL纯化方法在第一轮用负载抗原的mDC刺激并扩增目标CTL数量后,采用Tetramer标记方法和流式细胞分选术再一次纯化目标CTL(目标CTL是指表达识别特定抗原多肽TCR的CD8+T，即Tetramer+CD8+T淋巴细胞)，即选择Tetramer+CD8+T，剔除非特异性扩增的T细胞，以减少其对目标CTL增殖的影响。d.目标CTL的第二轮扩增采用固相包被的anti-human-⑶3mAb和IL_2刺激目标CTL的生长与增殖；再加入经Y射线辐照的自体PBMC增强对目标CTL的活化；加入rhIL-15 —方面可以促进记忆性T细胞的增殖，另一方面可抑制细胞的凋亡。e.第二轮扩增后目标CTL表型鉴定采用流式细胞术对已制备的目标CTL进行表型分析，根据其表达的分子譜不同将其分为中心记忆性 CTL (CTL_cm :CD8+CD45R0+CD62L+CCR7+)和效应性 CTL (CTL_EM CD8+CD45R0+CD62L-CCR7-)。所述的制备方法，步骤b中的目标抗原为已知的具有明确抗原表位和HLA-A0201限制性的肿瘤或病毒抗原多肽，多肽长度为9-15个氨基酸。如Herf-neu抗原多肽、AFP抗原多肽、CEA抗原多肽、PSA抗原多肽、HBV抗原多肽、EBV抗原多肽或HPV抗原多肽等。所述的制备方法，步骤b中负载目标抗原的自体成熟DC是通过下列方法制备得到的PBMC贴壁后加入rhGM-CSF、rhIFN α、灭活的混合正常人AB血清和RPMI1640培养基培养三天，收获的DC再加入目标抗原孵育即得。所述的制备方法，步骤c中用于目标CTL扩增的Y射线辐照的自体PBMC是通过下列方法制备得到的留取部分单采获得的PBMC，经30-50GY的Y射线辐照后保存；保存液含 20% (v/v，ml/ml)DMSO 和 20% (v/v, ml/ml)正常人 AB 血清的 RPMI1640 培养液，保存温度-80°C超低温保存。所述的制备方法，步骤d中用于目标CTL扩增的⑶3单抗克隆抗体(⑶3-mAb)是如下操作的将CD3单抗固相包被于用于扩增细胞的容器表面，CD3-mAb可与多个CTL表面的CD3分子结合，促进CTL细胞克隆的形成，促进细胞接触，快速进入增殖周期。所述的制备方法，各步骤中刺激分子或细胞的初始加入量分别为a.目标CTL第一轮扩增rhIL_2终浓度为500_1000IU/ml，rhIL-7终浓度为50-100ng/ml，负载目标抗原的DC与起始T细胞数量比为I : 5。b.目标CTL第二轮扩增rhIL-2终浓度为250_500IU/ml，rhIL-15终浓度为100-250ng/ml，CD3单克隆抗体包被浓度为I. 0-3. O μ g/ml, Y射线辐照的PBMC与起始CTL数量比为2 I。所述的制备方法，各步骤操作后细胞数量与表型特征见表I。表I 本发明属于生物技术开发与应用研究领域，公开了HLA-A0201限制性抗原特异性CTL制备方法。该方法通过单采收集外周单个核细胞，富集、纯化CD8+T淋巴细胞；用负载HLA-A0201限制性目标抗原多肽的成熟树突状细胞刺激CD8+T淋巴细胞，并用rhIL-2和rhIL-7联合促进T细胞生长；采用Tetramer标记方法和流式细胞分选术纯化目标CTL；采用固相包被的抗人-CD3mAb和IL-2刺激目标CTL的生长；加入γ射线辐照后的自体PBMC增强目标CTL的活化；加入rhIL-15培育扩增，收集鉴定。本方法制备的CTL具备高纯度，高增殖能力，高杀伤活性，高比例CTL-CM，可用于肿瘤等免疫治疗。