专利名称：一种提高植物抗病性及促进其生长的微生物菌剂的制作方法黄瓜在我国已有2000多年的栽培历史，富含维生素A、C以及多种有益矿物质，是我国的主栽蔬菜作物之一，并且，我国保护地黄瓜种植面积呈上升趋势。但保护地是一个高湿、弱光的生态环境，因此黄瓜抗病性降低，病害频繁发生，包括立枯猝倒病、枯萎病等土传真菌病害；灰霉病、白粉病等气传真菌病害；以及其它细菌和病毒引起的病害。目前生产上主要采用化学防治的方法控制这些病害的发生发展，但由于土传病害病原菌的生物学特性及土壤的屏障作用增加了防治难度，导致化学防治剂用量虽大却难以正常发挥作用，同时， 土壤微生物区系受到干扰，病原菌的抗药性增强，对土壤及黄瓜污染严重。随着全社会对食品安全的重视和可持续农业的发展，利用安全、高效、无环境污染的微生物菌剂防治植物病害已普遍为人们所接受。生防微生物的作用机制主要包括以下几个方面有些微生物可以产生一些抗生素对病原菌有拮抗作用；有些微生物能产生杀菌蛋白，起到杀灭病原菌的作用；有些微生物能产生几丁质酶，可以裂解真菌性病原菌的细胞壁从而起到生防作用；有些微生物能够诱导植物产生抗病性。由于拮抗作用和诱导抗性作用具有抗菌谱广、对植物病害防效显著等优点，因此在植物病害防治应用方面备受青睐。芽孢杆菌是土壤和植物微生态系统中的优势种群之一，是植物病害生防微生物的重要组成成分，在植物病害的生物防治方面发挥了重要作用，人们已在很多植物上检测过芽孢杆菌某些种的生防作用，如Guo等研究表明，从番茄根际分离的A/s sp. BBll对 Ralstonia引起的番爺细菌性枯萎病有一定的防治作用。目前对有害生物的防治策略已经从有害生物综合治理转向有害生物可持续控制。并且人们已越来越认识到杀菌剂的大量重复使用对环境造成的恶劣影响以及病原菌产生的抗药性所带来的严重后果， 因此利用有益微生物对病原进行防治是一种颇具潜力的方法。这种防治方法对人畜和非靶标生物安全，对环境友好，不易产生抗药性，易于保护生物多样性等优点。针对我国土壤、农作物与水体中农药残留量超标，病原菌抗药性严重等问题，利用有益防治蔬菜病害有利于环境保护和绿色蔬菜的生产，具有良好的市场前景，会产生巨大的生态效益和社会效益。
本发明的一个目的是公开了一种枯草芽孢杆菌EBC7,其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为=CGMCC No. 5586。本发明的另一个目的是公开了 CGMCC No. 5586菌株的制备方法。本发明的再一个目的是公开了采用CGMCC No. 5586制备微生物菌剂的方法。本发明的再一个目的是提供该微生物菌剂在促进黄瓜生长，提高黄瓜抗病性方面的应用。为实现上述目的，本发明提供如下的技术方案本发明公开的枯草芽孢杆菌于2011年12月13日；保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌株保藏号为CGMCC No. 5586。枯草芽孢杆菌Uaci77心subti I is) CGMCC No. 5586所具有的形态、生理生化特征如下(1)菌落及形态特征在NA培养基上菌落圆形、白色、表面色暗、不透明，细胞杆状、革兰氏染色阳性。显微镜观察菌株形态。(2)生理生化特性接触酶阳性，氧化酶阳性，V-P测定阳性，V-P培养物终pH〈6， D-葡萄糖、D-棉子糖、D-山梨糖醇和D-甘露醇产酸，葡萄糖不产气，水解酪朊、明胶和淀粉，利用柠檬酸盐、不利用丙酸盐，不水解酪氨酸，不产生苯丙氨酸脱氨酶和赖氨酸脱羧酶， 产生精氨酸双水解酶，将硝酸盐还原为亚硝酸盐，不形成吲哚，不需要NaCl、KC1、尿囊素和尿酸盐，在PH5. 7和6. 8的营养肉汤中生长，在2、5和7%的NaCl中生长，在0. 001%的溶菌酶存在时生长。本发明所述枯草芽孢杆菌subtiIisXGmc No. 5586的制备方法，其特征在于按如下步骤进行(X) Bacillus subti I is EBC7的分离从天津市西青区温室采集健康的、“津优10号” 黄瓜根系；流水冲洗1-2 h后，在70%的乙醇中浸泡I min后，在2. 5%的NaClO中消毒6-8 min,无菌水冲洗干净备用；(2)将步骤(I)得到的灭菌组织转移到无菌研钵中加入PBS缓冲液(pH7.0)研磨，取研磨汁液系列稀释后，各取100 W涂布于NA平板上，并置于28°C条件下黑暗培养，每处理3 次重复；(3)挑取NA平板上的单菌落，划线纯化培养，得到枯草芽孢杆菌菌株；然后将枯草芽孢杆菌接种于NB培养液中，150 rpm/min振荡培养24 h后，将得到的枯草芽孢杆菌菌液在 15%的甘油中-80°C保存备用；其中的NA培养基蛋白胨10g，NaCl 5g,牛肉膏3g，琼脂粉12g，补水至1000ml，pH7. 0-7. 2;NB培养基蛋白胨10g, NaCl 5g,牛肉膏3g，补水至 1000ml, pH7. 0-7. 2。本发明制备的枯草芽孢杆菌心subti I is) EBC7的特点
检验项目小鼠急性经口毒性试验
检测结果动物染毒后，未见明显中毒表现，观察期内无死亡，尸检中各主要脏器未见明显异常。检测结论本品的小鼠急性经口毒性LD5tl > 20. 0 / g / kg. BW。按《食品安全性毒理学评价疗程和方法》(GB15193. 3-2003)，本品属于无毒。本发明进一步公开了采用含量I.SUXIOki的枯草芽胞杆菌(也《77心
的发酵液制备微生物菌剂的方法，其特征在于枯草芽孢杆菌菌液在15%的甘油中_80°C保存，使用时接种到固体NA培养基上活化培养；之后取一环NA培养基上的菌苔接种于含有NB培养液基的三角瓶中进行种子培养，150 rpm/min振荡培养24 h后，以1_3%的接种量接种于发酵瓶中发酵培养48 h，得到含量I. 5-4. 5 X 101°发酵液；
其中的NA培养基蛋白胨10g，NaCl 5g,牛肉膏3g，琼脂粉12g，补水至1000ml，pH7. 0-7. 2 ；
NB培养基(种子培养基)蛋白胨10g，NaCl 5g,牛肉膏3g，补水至IOOOml， pH7. 0-7. 2 ；
发酵培养基黄豆粉lO.OOg，玉米淀粉5.00g，酵母粉0. 50g，KH2PO4 0. 35g, CaCl2 0. 20g，补水至 1000ml, pH7. 0-7. 2。本发明进一步公开了微生物菌剂在制备作为促进黄瓜植株生长、防治黄瓜抗病性菌剂方面的应用。其中所述的黄瓜抗病性包括对黄瓜枯萎病或黄瓜白粉病的抗性。其中黄瓜种子与微生物菌剂的重量份数比为20 :1。本发明的微生物菌剂，对黄瓜白粉病和枯萎病有明显的防治效果，并且能够显著促进黄瓜植株生长。经微生物菌剂处理后，黄瓜植株对白粉病的抗性明显增强，病叶率明显低于空白对照，相对免疫效果达到了 80.4%。经微生物菌剂处理后，黄瓜植株对枯萎病的抗性明显提高，出苗率明显高于空白对照，相对防治效果达到了 78. 5%。经微生物菌剂处理后， 黄瓜植株的生长明显增强，株高、地上部鲜重和干重均显著高于空白对照。本发明公开的微生物菌剂所具有的有益效果在于
有益生防细菌具有对人畜和非靶标生物安全，对环境友好，不易产生抗药性，易于保护生物多样性，来源广泛等优点。针对我国土壤、农作物与水体中农药残留量超标，病原菌抗药性严重等问题，利用益微菌防治蔬菜病害有利于环境保护和绿色蔬菜的生产，具有良好的市场前景，会产生巨大的生态效益和社会效益。

下面结合实施例说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定。下面通过实例来进一步阐明本发明微生物菌剂的制备方法。本发明所用到的试剂除特别指出外均有市售。津研4号黄瓜种子、 津优10号黄瓜种子均有市售。实施例I
细菌(枯草芽孢杆菌)的制备
(X) Bacillus subti I is EBC7的分离从天津市西青区温室采集健康的、“津优10号” 黄瓜根系；流水冲洗I h后，在70%的乙醇中浸泡I min后，在2. 5%的NaClO中消毒6 min, 无菌水冲洗干净备用；
(2)将步骤(I)得到的灭菌组织转移到无菌研钵中加入PBS缓冲液研磨，取研磨汁液系列稀释后，各取100W涂布于NA平板上，并置于28°C条件下黑暗培养，每处理3次重复；
(3)挑取NA平板上的单菌落，划线纯化培养，得到枯草芽胞杆菌菌株；然后将枯草芽孢杆菌接种于NB培养液中，150 rpm/min振荡培养24 h后，将得到的枯草芽孢杆菌菌液在 15%的甘油中-80°C保存备用；其中的NA培养基蛋白胨10g，NaCl 5g,牛肉膏3g，琼脂粉12g，补水至1000ml，pH7. 0-7. 2 ;NB培养基蛋白胨10g, NaCl 5g,牛肉膏3g，补水至 1000ml, pH7. 0-7. 2。实施例2
细菌(枯草芽孢杆菌)在15%的甘油中_80°C保存，使用时接种到NA固体培养基上活化培养；活化后取一环菌苔接种于含有NB培养基的三角瓶中进行种子培养，150 rpm/min振荡培养24 h后，以3%的接种量接种于发酵瓶中发酵培养48 h，得到含量I. 5 X IO10发酵液含有芽孢杆菌的营养体和/或芽孢以及抗菌代谢产物。其中的NA培养基蛋白胨10g，NaCl 5g,牛肉膏3g，琼脂粉12g，补水至 1000ml, pH7. 0 ；
NB培养基(种子菌培养基):蛋白胨10g, NaCl 5g,牛肉膏3g，补水至1000ml，pH7. 0 ; 发酵用培养基黄豆粉10.008，玉米淀粉5.008，酵母粉0.5(^，KH2PO4 0. 35g, CaCl2 0. 20g，补水至 1000ml, pH7. O。实施例3
细菌(枯草芽孢杆菌)在15%的甘油中_80°C保存，使用时接种到NA固体培养基上活化培养；活化后取一环菌苔接种于含有NB培养基的三角瓶中进行种子培养，150 rpm/min振荡培养24 h后，以3%的接种量接种于发酵瓶中发酵培养48 h，得到含量4. 5 X 101°发酵液 (含有芽孢杆菌的营养体和/或芽孢以及抗菌代谢产物)。其中的NA培养基蛋白胨10g，NaCl 5g,牛肉膏3g，琼脂粉12g，补水至 1000ml, pH7. 0 ；
NB培养基蛋白胨10g, NaCl 5g,牛肉膏3g，补水至1000ml，7. 2 ;
发酵用培养基黄豆粉10.008，玉米淀粉5.008，酵母粉0.5(^，KH2PO4 0. 35g, CaCl2 0. 20g，补水至 1000ml, pH7. 2。实施例4
细菌在15%的甘油中-80°C保存，使用时接种到固体NA培养基上活化培养；之后取一环NA培养基上的菌苔接种于含有NB培养液基的三角瓶中进行种子培养，150 rpm/min振荡培养24 h后，以1%的接种量接种于发酵瓶中发酵培养48 h，得到含量3. 5X 101°发酵液 (含有芽孢杆菌的营养体和/或芽孢以及抗菌代谢产物);
其中的NA培养基蛋白胨10g，NaCl 5g,牛肉膏3g，琼脂粉12g，补水至1000ml， pH7. 0-7. 2 ；
NB培养基(种子菌培养基)蛋白胨10g，NaCl 5g,牛肉膏3g，补水至1000ml， pH7. 0-7. 2 ；
发酵培养基黄豆粉lO.OOg，玉米淀粉5.00g，酵母粉0. 50g，KH2PO4 0. 35g, CaCl2 0. 20g，补水至 1000ml, pH7. 0-7. 2。实施例5
该微生物菌剂在促进黄瓜生长，提高黄瓜抗病性方面的试验应用实例。[试验实例I]
该微生物菌剂对黄瓜枯萎病的防治作用
将在沙-玉米粉培养基上培养的黄瓜枯萎病菌(黄瓜研究所提供)与消毒土按I :50(w/ w)混匀，装钵备用。津研4号黄瓜种子与该微生物菌剂的500倍水稀释液(见实施例2)按 20 I (W/W)拌种，播于钵中，每钵6粒种子，每处理6钵，重复3次。以清水拌种为对照，播种后7d调查种子出苗率，15d时调查发病情况，并计算病情指数及相对防治效果。病级如下 0 :未发病；1 :病斑面积占叶片的0-25% ；2:病斑面积占叶片的25-50% ；3 :病斑面积占叶片的50-75% ；4 :病斑面积站叶片的75-100%。采用单因素方差分析，并进行F检验。表I微生物菌剂对黄瓜枯萎病的防治作用


一种提高植物抗病性及促进其生长的微生物菌剂。本发明公开了一种提高黄瓜抗病性及促进其生长的微生物菌剂，主要活性成分为含量1.5-4.5×1010的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)EBC7发酵菌液。本发明进一步公开了微生物菌剂在提高黄瓜抗病性和促进其生长方面的应用。其中对黄瓜枯萎病的相对防治效果达到78.5%；对黄瓜白粉病的相对防治效果达到80.4%；并且显著增加黄瓜的株高以及地上部鲜重、干重。本发明的枯草芽孢杆菌制剂可广泛应用于农业生产，安全无污染，并且能够恢复和保持土壤环境的生态平衡。