专利名称：含小檗碱的黄檗愈伤组织培养方法黄檗(Phello dendron amurense Rupr.)又名关黄柏、黄波罗，为芸香科(Rutaceae)黄柏属(Phellodendron)多年生落叶高大乔木，主要分布在我国的黑龙江、吉林、辽宁、河北等省，具有重要的经济和药用价值。其内皮(韧皮部)入药，称为关黄柏(产于四川等地的黄皮树的内皮则称为川黄柏)，是我国传统中药黄柏的重要来源植物之一。黄檗已经被国家列为二级保护植物和重点的植物保护资源，中国植物红皮书将其列为渐危种。传统的黄檗药用方法主要是采取将黄檗立木扒皮，而黄檗的主要药用成分为小檗碱，其在植株中含量低，且黄檗生长缓慢，剥皮严重影响着植株的生长甚至导致死亡，而且消耗大而产出很少，不利于黄檗资源的有效利用。早在20世纪50年代，人们就发现离体培养的高等植物细胞具有合成并积累植物次生代谢产物的潜力，随着生物技术的发展，用组织培养生产有用的次生代谢产物已成为可能并且取得了相当大的成绩。目前已有80多种药用植物可通过组织培养技术生产其体内含的药用有效成分，有30多种药用植物细胞培养物累积的有效成分等于或高于原植物的含量，如人参皂苷、迷迭香酸等。为了更有效地保护黄檗资源，利用细胞或组织培养生产天然产物药物是开发利用珍贵药用资源的重要途径。
本发明目的在于克服上述利用的不足之处，提供一种含小檗碱较高的黄檗愈伤组织培养方法以及适应该方法所用的培养基。解决上述技术问题所采用的技术方案是它包括以下步骤(I)外植体制备材料消毒在超净工作台上将取下的黄檗叶或黄檗茎段在70%的酒精中浸泡15-20秒，再用10%的次氯酸钠消毒8分钟，期间不断摇动，然后用无菌水冲洗3-5次，每次2分钟，用无菌滤纸吸干表面水分；(2)愈伤组织诱导将(I)中处理好的黄檗叶片切成0. 5X0. 5cm2的切块，黄檗茎段切成0. 5cm长的切段接入诱导愈伤组织培养基中诱导愈伤组织，该诱导愈伤组织培养基为在I升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成蔗糖20 -40 g琼脂粉5.8 7.6 g2，4_二氯苯氧乙酸 0.5 2.5 mg6—(节胺基)嘌呤0.5 2.0 mgpH为5. 8，配制好的诱导愈伤组织培养基分装在培养瓶中，每瓶25毫升，盖好瓶盖，在压力为0. I 0. 15MPa下灭菌30分钟，将培养瓶置于温度为22 26°C、光照强度为40 u mo I m_2 s—1的培养室中培养，每天光照12 14小时，培养15 20天，待黄檗愈伤组织形成叶后，继续培养30 50天，至黄檗愈伤组织褐化。本发明培养方法中所用的优选诱导愈伤组织培养基为I升MS培养基中加入下述 的原料及其配比制成鹿糖25 35 g琼脂粉6 2 7.2 g
2，4_二氯苯氧乙酸 I 5 2.5 mg
6-(苄胺基)嘌呤0.8 1.5 mg本发明培养方法中所用的最用的最佳诱导愈伤组织培养基为在I升MS基本培养基中加入下述的原料及配比制成
蔗糖30 g
琼脂粉6.8 g
24一二氯苯氧乙酸2.0 mg
6—(苄胺基)嘌呤LOmg本发明培养方法采用喜树叶或茎段为外植体，在MS基本培养基中加入蔗糖、琼脂粉、2，4 一二氯苯氧乙酸、6-(苄胺基)嘌呤的培养基中组织培养，得到黄檗愈伤组织。采用本发明组织培养方法以及使用的培养基所培养的褐化黄檗愈伤组织，经高效液相法检测，本发明方法所得到的愈伤组织中小檗碱的含量为5. 4%以上，高于现有报道的黄檗枝叶中和黄檗皮中的小檗碱的含量。本发明培养方法以及所采用的培养基，可用于黄檗愈伤组织的培养。

实施例I(I)外植体制备材料消毒在超净工作台上将取下的黄檗叶或黄檗茎段在70%的酒精中浸泡15-20秒，再用10%的次氯酸钠消毒8分钟，期间不断摇动，然后用无菌水冲洗3-5次，每次2分钟，用无菌滤纸吸干表面水分；(2)愈伤组织诱导将(I)中处理好的黄檗叶片切成0. 5X0. 5 I. Ocm2的切块，黄檗茎段切成0. 5
I.Ocm长的切段接入诱导愈伤组织培养基中诱导愈伤组织，该诱导愈伤组织培养基为在I升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成
蔗糖30 g
_脂粉6.8 g
2，4_二氯苯氧乙酸 2.0 mg
6-(苄胺基)嘌呤1.0 mgpH为5. 8，配制好的诱导愈伤组织培养基分装在培养瓶中，每瓶25毫升，盖好瓶盖，在压力为0. I 0. 15MPa下灭菌30分钟，将培养瓶置于温度为22 26°C、光照强度为40 u mo I m_2 s—1的培养室中培养，每天光照12 14小时，培养15 20天，叶切块明显增厚，体积膨大，叶切块切口周围先形成黄檗愈伤组织，茎段切段两端先形成愈伤组织，然后整个切段形成黄檗愈伤组织。黄檗愈伤组织质地疏松，呈淡绿色，继续培养30 50天，黄檗愈伤组织褐化。实验结果表明，叶片的诱导率为93. 5%，茎段的诱导率为90. 8%。实施例2在本实施例的愈伤组织诱导培养步骤中，所用的诱导愈伤组织培养基为在I升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成
蔗糖20 g
琼脂粉5.8 g
2，4—二氯苯氧乙酸 1.0 mg
6—(苄胺基)嘌呤0.5 mg在本实施例中，其它培养步骤与实施例I相同。实施例3在本实施例的愈伤组织诱导培养步骤中，所用的诱导愈伤组织培养基为在I升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成蔗糖40 g
琼脂粉7.6 g
2，4—二氯苯氧乙酸 2.5 mg
6 —(苄胺基)嘌呤2.0 mg在本实施例中，其它培养步骤与实施例I相同。实施例4在本实施例的愈伤组织诱导培养步骤中，所用的诱导愈伤组织培养基为在I升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成
蔗糖20 g
琼脂粉7.6 g
2, 4—二氯苯氧乙酸 2.5 mg
6—(苄胺基)嘌呤2.0 mg在本实施例中，其它培养步骤与实施例I相同。实施例5在本实施例的愈伤组织诱导培养步骤中，所用的诱导愈伤组织培养基为在I升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成
蔗糖40 g
琼脂粉5.8 g
2，4_二氯苯氧乙酸2.5 mg
6 —(苄胺基)嘌呤2.0 mg 在本实施例中，其它培养步骤与实施例I相同。实施例6在本实施例的愈伤组织诱导培养步骤中，所用的诱导愈伤组织培养基为在I升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成蔗糖40 g
琼脂粉7 6 g
2，4_二氯苯氧乙酸0.5 mg
6—(苄胺基)嘌呤2.0 mg在本实施例中，其它培养步骤 与实施例I相同。实施例I在本实施例的愈伤组织诱导培养步骤中，所用的诱导愈伤组织培养基为在I升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成
蔗糖40 g
琼脂粉7.6 g
2，4—二氯苯氧乙酸2.5 mg
6-(苄胺基)嘌呤0.5 mg在本实施例中，其它培养步骤与实施例I相同。实施例8在本实施例的愈伤组织诱导培养步骤中，所用的诱导愈伤组织培养基为在I升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成
蔗糖20 g
琼脂粉5.8 g
2, 4—二氯苯氧乙酸2.5 mg
6—(苄胺基)嘌呤2.0 mg在本实施例中，其它培养步骤与实施例I相同。实施例9在本实施例的愈伤组织诱导培养步骤中，所用的诱导愈伤组织培养基为在I升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成蔗糖20 g
琼脂粉7.6 g
2，4一二氯苯氧乙酸0.5 mg
6—(苄胺基)嘌呤2.0 mg在本实施例中，其它培养步骤与实施例I相同。实施例10在本实施例的愈伤组织诱导培养步骤中，所用的诱导愈伤组织培养基为在I升MS·基本培养基中加入下述的原料及其配比制成
蔗糖20 g
琼脂粉I 6 g
2，4—二氯苯氧乙酸2.0 mg
6—(苄胺基)嘌呤0.5 mg在本实施例中，其它培养步骤与实施例I相同。实施例11在本实施例的愈伤组织诱导培养步骤中，所用的诱导愈伤组织培养基为在I升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成
蔗糖40 g
琼脂粉5 8 g
24_二氯苯氧乙酸0.5 mg
6—(苄胺基)嘌呤2.0 mg在本实施例中，其它培养步骤与实施例I相同。实施例12在本实施例的愈伤组织诱导培养步骤中，所用的诱导愈伤组织培养基为在I升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成蔗糖40 g
琼脂粉5.8 g
2，4_ 二氯苯氧乙酸 2.5 mg
6—(节胺基)嘌呤0.5 mg在本实施例中，其它培养步骤与实施例I相同。实施例13在本实施例的愈伤组织诱导培养步骤中，所用的诱导愈伤组织培养基为在I升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成
蔗糖40 g
琼脂粉7 6 g
24一二氯苯氧乙酸 1.0 mg
6—(苄胺基)嘌呤0.5 mg在本实施例中，其它培养步骤与实施例I相同。实施例14在本实施例的愈伤组织诱导培养步骤中，所用的诱导愈伤组织培养基为在I升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成
蔗糖20 g
_脂粉5.8 g
2，4_二氯苯氧乙酸1.0 mg
6-(苄胺基)嘌呤2.0 mg在本实施例中，其它培养步骤与实施例I相同。实施例15在本实施例的愈伤组织诱导培养步骤中，所用的诱导愈伤组织培养基为在I升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成蔗糖20 g
琼脂粉5 8 g
2，4—二氯苯氧乙酸 2.0 mg
6—(苄胺基)嘌呤0.5 mg在本实施例中，其它培养步骤与实 施例I相同。实施例16在本实施例的愈伤组织诱导培养步骤中，所用的诱导愈伤组织培养基为在I升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成
蔗糖20 g
琼脂粉7.6 g
2，4—二氯苯氧乙酸 LOmg
6—(苄胺基)嘌呤0.5 mg在本实施例中，其它培养步骤与实施例I相同。实施例17在本实施例的愈伤组织诱导培养步骤中，所用的诱导愈伤组织培养基为在I升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成
蔗糖40 g
琼脂粉5 8 g
24_ 二氯苯氧乙酸l.Omg
6—(苄胺基)嘌呤0.5 mg在本实施例中，其它培养步骤与实施例I相同。实施例18在以上实施例I 17，愈伤组织诱导工艺步骤中，将黄檗叶片切成I. OX I. Ocm2的切块，黄檗茎段切成I. Ocm长的切段接入诱导愈伤组织培养基中诱导愈伤组织，所用的诱导愈伤组织培养基与相应的实施例相同。为了验证本发明培养方法的可行性以及愈伤组织培养基的最佳配比，发明人进行了大量研究和实验室实验，并采用本发明实施例I的培养方法和诱导愈伤组织培养基在实验室诱导出的黄檗愈伤组织中小檗碱含量进行了对比实验，情况如下实验材料黄檗叶、黄檗枝、黄檗茎皮、小檗碱标准品、MS培养基、2，4 一二氯苯氧乙酸、6—(节胺基)嘌呤、琼脂粉、蔗糖、甲醇(分析纯)、无水乙醇(分析纯)、磷酸(分析纯)、乙腈(色谱纯)，2，4_二氯苯氧乙酸实验时名称为2，4-D，6-(苄胺基)嘌呤实验时名称为6-BA。材料提供单位黄檗叶、黄檗枝和黄檗茎皮由东北林业大学实验林场提供，MS基本培养基按照《植物组织培养》一书MS基本培养基配方由东北林业大学森林植物生态学教育部重点实验组培实验室配制，2，4_ 二氯苯氧乙酸和6-(苄胺基)嘌呤由Sigma公司生产，琼脂粉由北京奥博星生物技术责任有限公司生产，蔗糖、甲醇(分析纯)、无水乙醇(分析纯)市售，乙腈(色谱纯)由美国Tedia公司生产，小檗碱标准品购自中国药检所。实验仪器超净工作台、容量瓶、Waters高效液相色谱仪(Waters公司)，色谱柱、KQ-100DB超声波仪由江苏昆山超声仪器公司生产。实验方法与结果I、黄檗愈伤组织诱导实验将黄檗的叶片和茎段分别接种在I升MS基本培养基中加入蔗糖30g、琼脂粉6. 8g及不同种类和不同浓度激素的培养基上，30天后统计黄檗愈伤组织诱导率，实验结果见表
Io表I黄檗愈伤组织诱导率


一种含小檗碱的黄檗愈伤组织培养方法，包括(1)制备外植体；(2)愈伤组织诱导将(1)处理的黄檗叶片切成0.5×0.5～1.0cm2的块，黄檗茎段切成0.5～1.0cm长的段接入诱导愈伤组织培养基中诱导愈伤组织。该诱导愈伤组织培养基为在1升MS基本培养基中加入蔗糖20～40g，琼脂粉5.8～7.6g、2，4－二氯苯氧乙酸0.5～2.5mg，6－(苄胺基)嘌呤0.5～2.0mg，pH为5.8，配制好的诱导愈伤组织培养基分装地培养瓶中，每瓶25毫升，在压力为0.1～0.15MPa下灭菌25分钟，将培养瓶置于温度为22～26℃、光照强度为40μmol·m-2·s-1的温度中培养，每天光照12～14小时，培养15～20天，待黄檗愈伤组织形成叶后，继续培养30～50天，至黄檗愈伤组织褐化。