一种蓝耳病蛋白工程疫苗的制备方法[0002]猪生殖和呼吸综合征(PorcineReporductive and Respiratory Syndrome, PRRS),又称蓝耳病(Blue ear diesase)是由动脉炎病毒科的猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRVS)引起的一种新的病毒性传染病，是一种以导致母猪发热、厌食、早产、流产、死胎等繁殖障碍及仔猪高死亡率和育成猪呼吸困难、发育迟缓为特征的新病。1987年该病首次报道于美国，随后在北美、欧洲及亚洲各国和地区迅速蔓延，目前已成为一种地方性流行病(DeaSetal，1991 ;殷震等，1985 ；LoulaT, 1991 ；ShimizuM etal.，1994 ；Lindhausff etal.，1991.)。1996年，我国郭宝清首次分离到病毒(北美型经典毒株)，证实我国也存在此病(郭宝清等，1996)，之后我国相继有20多个省份报道发生了该病的流行(Tian K G et al.，2007 ;田克恭等2008 ;金宁一，2008)，尤其是2006年下半年来，我国有25个省份发生了以高致病性猪蓝耳病病毒(HP-PRRSV)为主要病原的“猪高热病”。各地高致病性PRRSV变异株有以下特点:传播迅速，毒力增强，致病力相似；对中小养殖场和农户危害严重；分子特征一致，起源于同一祖先。对全国各地分离的高致病性猪蓝耳病病毒毒株，通过完整的ORFS和部分Nsp2基因序列比较分析发现来自不同猪场的HPPRRSV高度同源，而且在Nsp2基因上都有两个相同位点的缺失:Nsp2基因的第483位和535-563位氨基酸发生缺失(童光志等，2007 ;郝晓芳等，2007)。而与2005 年以前的PRRSV的Nsp2同源性仅为69.886.2%。新分离毒株的GP5基因相互之间也是高度同源(98.5% -100.0% )，与以前的PRRSV毒株相比变异也比较大，尤其是两个潜在的认为与病毒毒力相关的氨基酸(R13 — Q13and R151 — G151) (Madsenet al.,1998 ；Yang et al.，1998 ；Allende et al.，2000)。目前，对该病尚无有效的治疗方法，疫苗免疫虽然能在一定程度上减轻疫情的严重情况，仍在疫苗的选用上存在不少问题；蓝耳病在我国广泛的流行给养猪业带来了巨大的损失，因此研制有效控制该病的疫苗是当务之急。[0003]更加有效的PRRSV疫苗的开发存在三个主要问题:⑴对于免疫系统PRRSV可能诱导反相调节信号，在结构蛋白中存在极大的抗原变异性，因此，免疫保护并未完全搞清楚。⑵正如(I)所示，PRRSV异源二聚体GP5-M肯定是体液免疫和细胞免疫反应的主要诱导蛋白；(3)然而，次要结构蛋白对于PRRSV病毒粒子的感染性也是必要的(Wissink etal.，2005)，也可以起到保护作用，而且诱导T细胞保护反应表明其也具有有限的T细胞表位(Mateuand Diaz, 2008)。[0004]PRRSV包括3个主要结构蛋白GP5 (E)、GP6 (M)和GP7 (N)以及次要结构蛋白GP2、GP3、GP4。研究结果表明，GP2在病毒中含量少，免疫原性差并且在实际操作中难以分离提纯；GP3主要诱导机体细胞免疫；GP4、GP5 (E)和GP6 (M)均可诱导机体产生中和抗体，其中GP5有6个抗原决定簇，是诱导产生中和抗体的主要结构蛋白，病毒中和作用与抗GP5抗体效价呈显著相关性((Lopez and Osorio, 2004 ；Tong et al., 2009)，GP5还可诱导细胞凋亡。核衣壳蛋白(N)免疫原性强，但产生的抗体无中和活性，主要用于免疫诊断，是检测病毒抗体的良好抗原。Yoon等的研究发现，向猪体内被动输入高滴度中和抗体可以预防本病(Yoon KJ et al., 1996),而且母猪在输入高滴度中和抗体后可免于出现繁殖障碍(OsorioFAet al.，2002)。这说明，单体液免疫即可有效预防PRRSV。猪感染PRRSV后，最7d即可检测到特异性抗体。在整个感染期问，均能检测出结构蛋白和非结构蛋白(尤其是Nsp2)抗体(Meulenberg JJ et al., 1995 ；Nelson EA et al., 1994 ；01eksiewica MB et al., 2002 ；ffuWH et al.，2001)，有关PRRSV的免疫保护机制还没有完全阐明，体液免疫和细胞免疫均可发挥作用。[0005]GP3蛋白由0RF3编码的一种高度糖基化蛋白。GP3蛋白共有7个N-糖基化位点，且这些糖基化位点在不同分离株间非常保守(Gonin et al.，1998 ；Katz et al.，1995)。GP3在动脉炎病毒糖蛋白中的位置比较特殊，它的膜拓扑结构还在推测中，而且它在病毒粒子中的结构特征还存在争议(Hedges et al.，1999 ；ffieringa et al.，2002) XP3 是PRRSV各毒株间保守性最差的蛋白之一，GP3可能与诱导细胞免疫有关，对猪产生保护作用(Plana-Duranet al.，1997)。GP3在欧美型毒株间推导氨基酸的同源率为54%~60%而且多数变异发生在其N末端，但GP3的N端潜在的糖基化位点及疏水性仍是保守的。另外，与LV相比，北美型毒株的GP3中C端的推导氨基酸有12个残基的缺失。0RF3和0RF4的重叠区有一疏水的高变区，即GP4的N端存在这样一个高变区。据报道，LV的这个高变区含有一个推测的中和位点，其中由9个氨基酸构成的基元(59-67)构成了此中和位点的核心，此处的突变可造成GP4蛋白的抗原性发生改变(Meulenberg JJ et al.，1997)。[0006]基质蛋白(M)和GP5糖蛋白是囊膜的主要成分，M和GP5构成异二聚体。从欧洲LV株上还分离出囊膜糖蛋白GP3，但是在北美IAF-Klop株的GP3是一种可溶性蛋白且与囊膜结合能力较弱(Dea, Set al., 2000) 0 GP4蛋白的分子量为31~35KD，有4个糖基化位点，为N-糖基化蛋白，是病毒的主要结构蛋白之一。GP4蛋白有一个可以被单抗中和的抗原决定簇，它位于该蛋白胞外区第40~79位氨基酸之间。该区域在不同的PRRSV中高度可变，它可能和免疫选择相关。已证实LV病毒的GP4蛋白诱导的抗体具有中和作用(Meulenberget al.，1997)，说明这个蛋白质至少有部分暴露在病毒粒了的表面。虽然GP4蛋白具有中和表位，但GP4抗体的出现与血清的中和抗体效价似乎无相关性(Zhang etal.,1998)。Yoo等(2005)认为GP4在信号转导和介导脂质双层漂移中发挥作用。Meulenberg等在LV株的0RF4编码蛋白GP4中鉴定了一个中和区，表明该蛋白诱导的抗体具有中和作用，但是该表位在北美株和欧洲株之间并不保守。而且，针对GP4的单克隆抗体的中和活性不如GP5的单克隆抗体有效。LV株GP4蛋白的中和域为一亲水域，靠近N末端(AA40-79)，在欧美毒株之间是高度变异的。Kwang等同大肠杆菌表达PRRSV北美参考株的0RF4，免疫印迹试验表明，在美国和加拿大猪场中只有65%的PRRSV阳性血清与该重组GP4发生反应(GoninPetal, 1999 ；Kwang J etal.，1994)。然而，康复猪血清的病毒中和滴度与抗GP4的抗体无相关性。Zhang等用昆虫细胞表达北美毒株VR-2385的GP4蛋白，制备的4株单克隆抗体没有中和活性，它们都是针对构象依赖性表位(Zhang Y etal.，1998)。用抗GP4的中和性单克隆抗体研究表明，GP4蛋白暴露于病毒粒子的表面，可能与病毒、细胞之间的相互作用有关。[0007]GP5的生物学功能非常重要，主要在病毒感染、细胞结合及病毒吸附中起作用，也是淋巴细胞增生性应答的靶点。GP5蛋白含有多个中和表位(Pirzadeh B etal.，1997 ；PirzadehB etal.,1998 ；WeilandE et al.，1999 ；ZhangYetal.，1998)，用重组GP5蛋白制备的单克隆抗体具有中和活性，病毒中和作用与抗GP5抗体效价呈显著相关性。针对GP5的单克隆抗体的中和活性比针对其它蛋白如GP4蛋白的单克隆抗体更强(Weiland E et al, 1999)。研究表明，GP5蛋白至少包含两种类型的中和抗原决定簇，一些为线性决定簇(Pirzadeh B etal.1998)，还有一些为构象依赖性决定簇(Weiland E et al.，1999 ；Zhang Y etal.，1998)。人报道称，无论是自然感染还是实验感染，M蛋白的抗体却早于其他蛋白的抗体。由于该蛋白的保守性较好，所以其诊断学上具有重要意义(MengelingWLet al.,1995)。[0008]PRRS自发生以来给世界养猪业造成了巨大的危害。尽管弱毒疫苗和灭活苗被应用于控制病毒感染，但由于其本身内在的缺陷使得免疫效果都不十分理想。活疫苗只能保护同源病毒的攻击，而对异源毒株的保护效果较差(Mengeling W Let al., 2003 ；Meng X J,2000)。活疫苗只能改善部分的临床症状，而不能预防感染。另外，活疫苗还可能出现毒力返强的危险(Opriessnig T et al.,2002)。另一方面,灭活苗预防和控制疾病的效果更差。
[0009]发明概述
[0010]本发明根据不同结构蛋白在病毒感染中的作用，选择主要结构蛋白GP5和次要结构蛋白GP3、GP4的表位作为疫苗框架结构，通过柔性linker连接后再与Thelper表位串联，克隆入PRSETB载 体后转化大肠杆菌，经过发酵、纯化、乳化等工艺，获得具有理想免疫原性的重组蓝耳病蛋白工程疫苗。利用本发明制备的疫苗可以有效预防猪蓝耳病的感染。
[0011]本发明的目的之一在于提供了一种新的能用于预防蓝耳病的蛋白工程疫苗多肽及其疫苗组合物；本发明的目的之二在于提供了所述蛋白工程疫苗的构建及获得方法；本发明的目的之三在于提供了能够表达所述蓝耳病蛋白工程疫苗的基因工程菌株；本发明的目的之四在于提供了所述蓝耳病蛋白工程疫苗的制备方法；本发明的目的之五在于提供了所述蛋白工程疫苗在预防蓝耳病中的用途。
[0012]在第一方面，本发明提供了一种用于预防蓝耳病的蛋白工程疫苗多肽及其组合物。其含有对主要的结构蛋白GP5以及次要结构蛋白GP3、GP4筛选得到的抗原表位以及Thelper表位。所述的蛋白工程疫苗蛋白或多肽或药学上可接受的盐以及表达抗原表位所需要的载体。载体也可以包括单独编码各抗原表位的序列，串联可以通过遗传工程方法进行。所述疫苗也包括非免疫活性物质，即为各多肽的连接部分，不具有抗原表位的免疫原性，也不具有任何佐剂活性，主要有纯化标签、接头肽、化学修饰部分、N端信号肽和C端多聚腺苷酸等。所述药学上可接受的盐是指无毒性、刺激和变态反应，适用于人或动物组织的盐。非活性物质和药学上可接受的盐为本领域技术人员所熟知。
[0013]在第二方面，本发明提供了一种核苷酸分子，其编码本发明第一方面所述的蓝耳病蛋白工程疫苗多肽。本发明中核苷酸可以是RNA形式，DNA形式，通过人工合成方式合成多抗原表位串联序列，然后经过基因工程操作连接后克隆入载体，转化入大肠杆菌，筛选、发酵、纯化后获得蓝耳病蛋白工程疫苗多肽。在本发明中可以对该核酸进行常规的分子生物学操作，如:PCR、限制性内切酶酶切、连接等，核酸设计5’端和3’端均加入酶切位点。优选本发明中的核苷酸序列如下:[0014]GCAAAGTTCGTTGCAGCATGGACCCTGAAAGCAGCAGCAATCTCCGAGATCAAGGGTGTCATCGTCCACAAGATCGAGGGGATCGGTTCTGGTATAGGGCATGACCGATGTAGTGAGAACGATCATGACGAACTAGTTCACGACGGGGATAACGCCACCTTGCCTCGCCATGACAATATTGTCTTTCGGACATCAAAACCAACACCACCGCAGCATCAGGGTTCTGGTCCATGTTTCAGTTCGAGCCTTTCGGACATCAAAACCAACACCTCCGCAGCATCAGACTTCGTTGTCCTCCAGGACATCAGCTGCCTTAGGCATGGCGACTCGTCCCCTCCGACGGTTCGCAAAATCCCTCAGTGCCGCTCTGAGATGAGTGAAAAGGGATTCAAAGTGGTGTTCGGCAATGTGTCAGGCATCGTGGCTGTGTGCGTCAACTTTACCAGCTACGTCCAACACGTCAAGGAGTTTACCCAACGCTCCTTAGGTGGTGCCAACCCAAACAACAGCTCTTATTCACAGTTGATTTATAACCTGACACTATGTGAGCTGAATGGCACAGATTGGTTGGTGAAGAATTGCATGTCTTGGCGCTACTCATGTACCAGGTATACTAATTTTCTTTTAGACACCAAAGGCAAAATTTATCGTTGGCGATCACCCGTCATCATAGAGAAAGGGGGAAAAGTTGAGGTCGAGGGCCACCTCATCGACCTCAAGAGAGTTGTGCTTGATGGTTCCGCGGCTATCCCTGTAACCAAAATTTCAGCTGAGCGATGGGGTCATCCC
[0015]在第三方面，本发明提供了一种载体，其除了含有本发明第二方面所述的编码蓝耳病蛋白工程疫苗核苷酸分子，还含有与该核苷酸序列可操作的连接，在原核细胞表达(转录和翻译)所需的表达控制元件。最基本的表达控制元件包括启动子、转录终止子、增强子，选择性标记等，这些调控元件为本领域所熟知。在一优选实施方案中，所述表达载体为大肠杆菌表达载体。
[0016]在第四方面，本发明提供了一种宿主细胞，其含有本发明第三方面所述的载体。宿主细胞经转化或转染含有本发明所述编码蛋白的基因序列，而后经检测具有良好的的遗传和表达稳定性后，可用于发酵 表达生产所需的蓝耳病蛋白工程疫苗多肽。
[0017]在第五方面，本发明提供了一种蓝耳病蛋白工程疫苗的制备方法，其包括以下步骤:工程菌发酵表达蛋白工程疫苗多肽，经过粗纯化与精细纯化工艺以及后续乳化工艺，获得所需要的重组疫苗。其中涉及的方法包括但不限制于菌体破碎、包涵体洗涤、离心、变性、亲和层析、疏水层析、阴离子交换色谱、反相色谱、复性、乳化等。本发明中涉及的制备方法为本领域技术人员所熟知。
[0018]在第六方面，本发明提供了一种用于预防猪蓝耳病的重组蛋白工程疫苗，其包括本发明第一方面所述的多肽以及药学上可接受的载体。所述蛋白工程疫苗能够预防猪蓝耳病的爆发。本发明所述的药学上可接受的载体为免疫增强剂或免疫佐剂，优选免疫佐剂为进口白油佐剂。
[0019]在第七方面，本发明提供了第六方面所述的重组蓝耳病蛋白工程疫苗的应用。疫苗可以一定有效剂量肌肉注射，皮内或皮下注射或鼻内接种注射动物，能够诱导足够量的体液及细胞免疫提供抗病毒活性，保护动物免于蓝耳病流行毒株的攻击。此外，在本发明的实施方案中，通过对疫苗进行靶动物攻毒对比试验、实验室安全性试验等，表明本发明所述的重组蓝耳病蛋白工程疫苗是安全的(见实施例四)，能够保护动物免受蓝耳病病毒感染(见实施例五、六、七、八、九、十)。
[0020]另外，需要指出的是，在本申请的上下文的公开内容的基础上，本发明的其他具有实质性特点的方面对本领域的普通技术人来说是显而易见的。此外，本发明亦使用了公开文献，他们的全文内容均纳入本文进行参考。




[0022]实施例中所述的具体试验方法描述仅是示例性描述，用于详细阐述本发明，但并不构成对本发明范围的限制，依据本发明的许多变化为本领域的技术人员所熟知。
[0023]实施例一大肠杆菌表达载体与表达菌株的构建
[0024]将设计好的多肽编码核苷酸送上海英俊生物技术公司合成，核苷酸片段两端分别设计了 EcoRI (5’端)和HindIII (3’端)限制性酶切位点，把这片段合成后分别克隆到PMD18T载体上，序列测定证实插入基因片段与设计序列一致(见序列表)。将重组质粒分别命名为pMD18T-PRRSV(GP3 /4/5)。用相应的限制性内切酶将两种质粒进行酶切处理，大肠杆菌表达载体选用Invitrogen公司的pRSETB质粒,也使用相同的限制性内切酶处理,酶切条件:10μ I反应 体系，体系内加入2 μ I质粒，限制性内切酶为5个活性单位(NewEngland biolabs)，加入IOX缓冲液I μ 1，去离子水补齐，37°C酶切90min。酶切结束后加入I μ 1200mM EDTA终止反应。在I %琼脂糖凝胶电泳中，电泳30分钟。紫外灯下将2.88kbpRSETB质粒和796bp PRRSV (GP3 /4/5)片段切下，按照Qiagen公司凝胶回收试剂盒说明书进行胶回收。按照载体:片段=1: 2-3的比例将多表位核苷酸片段单独和表达载体混合，反应体系15 μ 1，由T4DNA连接酶进行连接，16°C连接过夜，获得重组质粒分别命名为pRSETB-PRRSV(GP3 /4/5)，(见图1)，转化感受态大肠杆菌 BL21 (DE3)pLysS。
[0025]转化:将pRSETB-PRRSV (GP3 /4/5)置冰上融化，加入2 μ I链接反应液，再次混匀，冰水浴30分钟，42°C 30秒，然后迅速放回冰浴1.5分钟，加入1ml LB培养液，37°C，静置培养I小时，4000g低温离心10秒钟弃上清，用200 μ ILB培养基重悬菌体；将菌液均匀涂布于含有100 μ g / mL氨苄青霉素的LB琼脂培养板上，倒置于37°C恒温箱中培养12-16小时，直至克隆形成。
[0026]鉴定:挑取平板上的单克隆至LB培养基中，37°C，180rpm震荡培养12小时，提取质粒，分别使用内切酶EcoRI和Hindi 11进行双酶切，可以切出相应蓝耳病疫苗基因大小片段的克隆为SOObp左右，可初步确定为阳性克隆(见图2);阳性克隆进行DNA序列测定进一步验证其正确性(见序列表)。
[0027]诱导表达。即将阳性克隆过夜培养，次日早上按1: 100转接，培养3小时后，加入0.5mM IPTG，继续培养3小时，制备样品；常规SDS-PAGE检测目的蛋白表达情况——在33.8KD(见图3)，见到特异性条带为正确克隆；取正确克隆，放大培养，SDS-PAGE证实表达正确后，使用常规Western-blot进一步证实其表达准确性(见图4);经过上述构建及鉴定程序后，可将挑选的阳性克隆作为工程菌进行原始种子库的建立，菌种命名pRSETB-PRRSV(GP3 / 4 / 5) / BL21(DE3，Plys)。
[0028]实施例二工程菌的发酵、纯化与乳化
[0029]发酵取生产菌种，接种于2ml LB液体培养基中(含100 μ g/ml氨苄青霉素)，37°C，180rpm振荡培养12小时活化菌种。再以1: 100的接种量接入摇瓶，37 °C振荡培养至0D600=3，可按10%比例接种入发酵罐。发酵用培养基为半合成培养基，用蒸馏水配制，其中不含有任何抗生素。校正溶氧和PH值电极，开启罐体搅拌，转数为300rpm，罐体在线灭菌，待罐内培养液温度降至37.(TC时，标定pH及溶氧(OD)零点。发酵温度为37.0 ± 0.1°C，溶氧控制在20%左右，pH控制在7.0，接种后培养菌体0D600=1.0~1.2时流加补料500ml，补料后I小时加入IPTG (终浓度为0.5mM)诱导表达，连续诱导6个小时后发酵结束，取样做SDS-PAGE检定表达情况。
[0030]纯化将收集到的菌体，用包含体洗液(1% Triton X-100，20mMTris_cl PH8.0)混悬后进行超声，2000W超声裂解I小时，4°C，12000rpm离心收集包含体，用4M盐酸胍，0.2%β -ME, 20mM Tris-cl (pH=8.00)混匀，室温搅拌4小时,8000rpm低温离心30min,弃去沉淀。变性蛋白1: 100稀释，复性液用Tris (PH8.0)缓冲体系，加入0.3M精氨酸，4°C搅拌复性24小时。复性液用pH=8.0的20mM磷酸缓冲液，0.5M氯化钠，20mM咪唑，平衡上亲和层析柱，用pH=8.0的20mM磷酸缓冲液，0.5M氯化钠，0.5M咪唑洗脱；即得重组蓝耳病蛋白工程疫苗半成品原液。做SDS-PAGE以及Western blot印记检定纯化产物是否为目标蛋白。
[0031]乳化将纯化的半成品用灭菌的PBS稀释至200μ8 / ml。取进口白矿物油佐剂DU0PRME(医药级)经121 °C，灭菌15分钟，备用。按油相:水相=50: 50的比例配制，先将油相加入乳化缸内，开动搅拌机以80-100r / min的速度缓慢搅拌，缓缓加入水相，加完后再搅拌2min,然后以5500r / min高速循环乳化9min,制成油包水单相疫苗。
[0032]实施例三重组蓝耳病蛋白工程疫苗安全性试验
[0033]I 材料
[0034]1.1疫苗:由宝麦德生物研发中心提供，批号为20120611、20120612、20120613。
[0035]1.2试验动物:18_22gBalb / C小白鼠购自北京华阜康。30日龄健康三元杂交仔猪由广东永顺制药提供。
[0036]2 方法
[0037]2.1疫苗对小白鼠的安全性
[0038]皮下注射18_22gBalb / C小白鼠，每只注射0.5ml，每批疫苗注射5只，共三个批次，注射15只小白鼠，同时设定2只阴性对照，连续观察10天，观测小白鼠的健康状况。
[0039]2.2疫苗对仔猪的安全性
[0040]选择30日龄健康三元杂交仔猪，每头耳后肌肉注射重组蓝耳病蛋白工程疫苗，每批次5头，共三个批次，注射15头仔猪，同时设立阴性对照2头，每头注射生理盐水乳化液2ml,临床观察1 4天。
[0041]3 结果[0042]3.1疫苗对小白鼠的安全性试验
[0043]结果如表1，免疫后，所有小鼠的食欲、精神和健康状况无异常，与对照组一致，无死亡发生，可见重组蓝耳病蛋白工程疫苗对小白鼠是安全的，见表1。
[0044]表1疫苗对小白鼠的安全性试验结果
[0045]