专利名称：一种Bt蛋白Cry70Ba1、其编码基因及应用的制作方法在人类生产过程中，虫害是造成农业生产损失及影响人类健康的重要因素，据FAO统计，全世界农业生产每年因虫害造成的经济损失高达14%，病害损失达12%，草害损失达11%。损失额高达1260亿美元，相当于中国农业总产值的一半，英国的4倍多。另外，蚊媒病在预防医学中占有重要位置，其中登革热和黄热病等蚊媒病传播力强、流行面广、发病率高、危害性大。据WHO统计，全世界每年感染登革热人数多达8000万，我国的海南省在1980和1986年曾经暴发过两次登革热，发病分别达到437469例和113589例。登革热和黄热病主要由埃及伊蚊传播。为了减少这些损失，多年来，对农作物害虫及蚊虫普遍采用化学防治手段进行防治，但由于化学农药的长期、大量使用，造成了对环境的污染，农副产品中农药残留量增加，给人类的生存和健康带来了危害。此外，化学农药在杀灭害虫的同时，也杀伤了天敌及其它有益物，破坏了生态平衡。与化学防治相比，生物防治具有安全、有效、持久的特点。并且避免了化学防治带来的一系列问题。因此，生物防治技术成了人们研究的热点。在生物杀虫剂中，苏云金芽孢杆菌是目前世界上用途最广、产量最大的一类微生物杀虫剂。苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种革兰氏阳性细菌，它的分布极为广泛，在芽孢形成的同时可形成具有杀虫活性的由蛋白质组成的伴胞晶体，又名杀虫晶体蛋白Qnsectididal crystalproteins,简称ICPs)，ICPs是由cry基因编码的，对敏感昆虫有强烈毒性，而对高等动物和人无毒性。近几十年来，Bt已广泛应用于控制多种鳞翅目、双翅目、鞘翅目等害虫。此外，Bt还对膜翅目、同翅目、直翅目、食毛目等多种害虫及植物病原线虫、螨类、原生动物有控害作用。目前在农田害虫、森林害虫及卫生害虫的防治中Bt已成为化学合成农药的有力替代品，Bt还是转基因抗虫工程植物重要的基因来源。自1981印f从菌株HD-I中克隆了第一个能表达杀虫活性的基因以来(Adang M. J 等’ Characterized full-length and truncatedplasmid clones of thecrystal protein of Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki HD-73 and theirtoxicity to Manduca sexta, Gene, 1985,36(3)』89 300.)，人们已经分离克隆了500多种编码杀虫晶体蛋白的基因，根据编码的氨基酸序列同源性它们被分别确定为不同的群、亚群、类和亚类(Crickmore N, Zeigler D R, Feitelson J，等 Revision ofthenomenclature for the Bacillus thuringiensis pesticidal crystal proteins.Microbiol Mol Biol Rev,1998,62 :807-813 ；http://www. biols. susx.ac. uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/)。一般而言，CryU Cry2 和 Cry9 等毒蛋白对鳞翅目害虫有效；其中研究的最多的是Cryl和Cry9类蛋白，它们编码的杀虫晶体蛋白分子量为130-140kD，许多基因目前已被广泛应用于植物的鳞翅目害虫的防治(Kozie，Μ. G.，Beland, G. L ， Bowman, C.，等 Field performance of elite transgenicmaize plantsexpressing an insecticidal protein derived from Bacillusthuringiensis.Bio/Technology, 1993，11 :194-200 ；Perlak，F. J.，Deaton，R. W.，Armstrong，T.A.，等 Insectresistant cotton plants.bio/technology,1990 ；8 :939-943 ；Van Frankenhuyzen,K.，Gringorten，L，and Gauhier，D. 1997. Cry9Cal toxin, a Bacillus thuringiensisinsecticidal crystalprotein with high activity against the spruce budworm(Choristoneurafnniferana). Appl. Environ, Microbviol. 63 :4132-4134 ； 王飞，2001，苏云金芽孢杆菌特异菌株生物学特性及cry9新基因的研究，硕士论文，南开大学)。苏云金芽胞杆菌以色列亚种(B. thuringiensis subsp. israelensis，简称Bti)产生的毒素蛋白对蚊虫具有很好杀虫活性，被广泛运用于蚊虫的防治(Goldberg L J，and Margalit J,1977. A bacterialspore demonstrating rapid larvicidal activityagainst Anopheles sergentii, Uranotaenia unguiculata, Culex univitattus, Aedesaegypit, and Culexpipiens. Mosqito News，37 :355-358)。同时，Cyt 蛋白具有溶细胞性，对某些Cry蛋白具有增效作用及延缓昆虫的抗性(Wu，D.，Johnson, J. J.，and Federici,B. Α. 1994.Synergism of mosquitocidal toxicity betweenCytA and CryIVD Proteinsusing inclusion sproduced from cloned genesof Bacillus thuringiensis. Mol.Microbiol. 13:965-972 ；ffirth, Μ. C. ， Georghiou, G. P. ， and Federeci, B.Α. 1997. CytAenables CryIVendotoxins of Bacillus thuringiensis to overcome high levels ofCryIVresistance in the mosquito, Culex quinquefasciatus. Proc. Natl. Acad. Sci. 94 10536-10540) 自上世纪初发现苏云金芽胞杆菌至今已有100多年的历史，在农作物和园艺植物害虫、森林害虫以及卫生害虫的防治方面得到广泛的应用，也起到良好的效果。但是，由于大规模和反复使用苏云金芽胞杆菌，许多昆虫种群已相继在不同程度上对杀虫晶体蛋白产生了抗性。以Bt杀虫晶体蛋白为基础的杀虫剂的使用已有50多年的历史，最初一直没有检测到昆虫对Bt的抗性，但是，上世纪80年中期开始，抗性问题不断在实验室及田间试验中得到证实(McGaughey，W. H. 1985. Insect resistance to the biologicalinsecticide Bacillus thuringiensis. Science. 229 :193-195)，原因主要是持续使用单品种及亚致剂量的Bt以及Bt转基因抗虫植物的应用造成昆虫种群长期受到杀虫剂的选择压力。1985年，McGaughey报道仓库谷物害虫印度谷螟(Plodiainterpunctella)在DipeKBt subsp. kurstaik HD-I的商品制剂)的选择压力下，繁殖15代后，抗性增加97倍；在高剂量选择压力下，抗性可增加250倍。1990年，在夏威夷首次证实大田中的小菜蛾对 Bt 杀虫剂产生了明显的抗性(Tabashnik, B. E.，Finson, N.，Groeters, F. R.，等 1994.Reversal of resistance to Bacillus thuringiensisin Plutella xylostella. Proc.Natl. Acad. Sci. USA. 91 :4120-4124)，上世纪90年代以来，在我国应用Bt杀虫剂时间较长的深圳、广州、上海等地，发现Bt杀虫剂对小菜蛾防治效果明显下降，意味着抗性已经形成(冯夏.1996.广东小菜蛾对苏云金杆菌的抗性研究.昆虫学报，39(3) =238-244 ；Hofte, H. , Van Rie, J. , Jansens, S. , Van Houtven, Α. ,Vanderbruggen, H. , and Vaeck,Μ.,1988. Monoclonal antibody analysis and insecticidal spectrum ofthree types oflepidopteran-specific insecticidal crystal proteins ofBacillus thuringiensis.Appl. Environ. Microbiol. 54 :2010-2017)。目前发现在实验室及田间至少有十几种昆虫对Bt及其杀虫晶体蛋白产生了抗性，用选择压力数学模型预测到，在Bt转基因抗虫植物选择压力的条件下，昆虫将会产生抗性Gchn印f，Ε.，Crickmore, N.，Van Pie, J.，^ 1998.Bacillus thuringiensis and its pesticidal Crystal proteins. Microbiol.Mol. Biol. Rev. 65(3) :775-806)。另外，有研究证明Bti在大田的使用中尚未发现抗性问IS (Regis L, 2000. The use of bacterial larvicides inmosquito and black flycontrol programs in Brazil. Mem. InstitutoOswaldo Cruz,95 :207-210.),但是岐虫对其抗性问题不断在实验室中得到证实，这种情况也可能会在大田中出现(Georghiou GP, and WirthM C,1997. Influence of exposure to single versus multiple toxinsofBacillus thuringiensis subsp. israelensis on development of resistance inthemosquito Culex quinquefasciatus(Diptera :Culicidae). Applied andEnvironmentalMicrobiology,63 :1095-1101.)。为避免抗性昆虫所造成的损失，寻找新的高毒力基因资源是解决这个问题的有效途径，这对我国的生物防治有着十分重要的意义。
本发明的目的是针对昆虫对Bt及其杀虫晶体蛋白产生抗性的问题，提供一种新的Bt蛋白Cry70Bal、其编码基因及应用。为了实现本发明目的，本发明的一种Bt蛋白Cry70Bal，其氨基酸序列为1) SEQID No. 1所示的氨基酸序列；或 SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。例如在非活性区段，将第766位的Gly替换为Ala，将第781位的Ala缺失，在第691位增加Leu，不影响蛋白的活性。本发明还提供编码上述蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ IDNo. 2所示。本发明从四川省沐川原始森林地区土壤中分离得到的苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)新菌株BtM(^8。该菌株已于2008年10月21日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址北京市朝阳区大屯路甲3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，保藏号为CGMCC No. 2719。通过对BtMC^S的毒力测试表明，BtMC^S对鳞翅目害虫、双翅目害虫等，均具有极高的毒力。从财1 ^8基因组及质粒测序结果中发现该菌株存在一个新的cry基因，进一步设计其全长基因引物，克隆得到cry70Bal基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，全长为2427bp,分析表明，GC含量为34. 2%，编码808个氨基酸组成的蛋白。经测定，其氨基酸序列如 SEQ ID No. 1 所示。在 softberry 网站采用 bacterial sigma7. Opromoter 程序对全序列进行预测表明，在基因编码区上游含有RNA聚合酶活化位点的序列，将其命名为cry70Bal。Cry70Bal蛋白的氨基酸组成如表1所示。表lCry70Bal蛋白的氨基酸组成本发明提供了一种新的Bt蛋白Cry70Ba1及其编码基因，所述蛋白具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，或该序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明的Cry70Ba1蛋白可以用于制备Bt杀虫剂，可将其编码基因转化棉花、玉米、水稻、蔬菜等农作物，使其具备相应的抗虫活性，从而降低农药的使用量，减少环境污染，具有重要的经济价值和应用前景。