抗cd20抗原的抗体l4h7及其应用的制作方法[0002]2008年世界卫生组织造血和淋巴组织肿瘤分类确定了超过25种具有广泛生物学和临床特征的B细胞淋巴瘤组织学亚型。美国癌症学会估计，2012年美国共有70130例B细胞淋巴瘤新病例被诊断，并且18940例患者将死于该病。在美国成人中，B细胞淋巴瘤占所有癌症的4%和癌症相关死亡的3%。在欧洲和北美，弥漫性大B细胞淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤(NHL)的最常见类型(占大约30%的病例)，被视为一种需要立即治疗的侵袭性癌症。滤泡性淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤的第二最常见组织学类型(占大约25%-30%的病例)。[0003]传统上，淋巴分化过程都是通过组织学分析辨别出在淋巴细胞发生特定阶段表达的细胞表面标志物来鉴定。CD20抗原是一种B细胞特异性分化抗原，在成熟B细胞和超过95%B细胞非霍奇金淋巴瘤表达，但不在早期B细胞祖细胞或晚期成熟浆细胞表达。CD20抗原由297个氨基酸残基组成，分子量为33kD，在膜上比较暴露，容易接近，与单克隆抗体结合后无显著内化及脱落，也不会因为与抗体的结合而发生抗原调变，故成为治疗B细胞淋巴瘤的理想靶点。[0004]利妥昔单抗(Rituximab)是一种可识别人类⑶20抗原的嵌合性单克隆抗体(整合了人类免疫球蛋白Gl重链和鼠免疫球蛋白可变区)。1997年11月利妥昔单抗获得美国食品和药物管理局批准用于治疗淋巴瘤的抗体。1998年，欧盟也批准利妥昔单抗上市，商品名为MabThera。利妥昔单抗在 复发性、惰性非霍奇金淋巴瘤病例中有显著治疗效果，开创了单克隆抗体治疗癌症的时代。
[0005]本发明的目的是提供一种抗⑶20抗原的抗体L4H7及其应用。[0006]本发明提供的抗⑶20抗原，命名为L4H7抗体，是一种IgG，其轻链由轻链可变区和轻链恒定区组成，其重链由重链可变区、铰链区和重链恒定区组成；所述轻链可变区中的⑶R1、⑶R2和⑶R3依次为序列表的序列I自N末端第61-79位氨基酸残基、第89-102位氨基酸残基和第112-123位氨基酸残基；所述重链可变区中的⑶R1XDR2和⑶R3依次为序列表的序列3自N末端第50-67位氨基酸残基、第81-96位氨基酸残基和第102-119位氨基酸残基。[0007]所述轻链具体可为如下(a)或(b): (a)序列表的序列I自N末端第21_234位氨基酸残基组成的蛋白质；(b)序列表的序列I所不的蛋白质；
[0008]所述重链具体可为如下(C)或(d): (C)序列表的序列3自N末端第20-470位氨基酸残基组成的蛋白质；(d)序列表的序列3所不的蛋白质。
[0009]本发明还保护编码所述L4H7抗体的基因，其特征在于:
[0010]编码所述轻链的基因为如下(I)或(2)或(3):[0011](I)序列表的序列2自5’末端第80-721位核苷酸所示的DNA分子；
[0012](2)序列表的序列2自5’末端第20-724位核苷酸所示的DNA分子；
[0013](3)序列表的序列2所示的DNA分子；
[0014]编码所述重链的基因为如下(4)或(5)或(6):
[0015](4)序列表的序列5自5’末端第58-1410位核苷酸所不的DNA分子；
[0016](5)序列表的序列5所示的DNA分子；
[0017](6)序列表的序列4所示的DNA分子。
[0018]本发明还保护所述L4H7抗体在制备用于杀伤B细胞淋巴瘤细胞的药物中的应用。所述B细胞淋巴瘤细胞为表达CD20抗原的B细胞淋巴瘤细胞。所述B细胞淋巴瘤细胞具体可为Daudi细胞。
[0019]本发明还保护一种用于杀伤B细胞淋巴瘤细胞的药物，其活性成分为所述L4H7抗体。所述B细胞淋巴瘤细胞为表达CD20抗原的B细胞淋巴瘤细胞。所述B细胞淋巴瘤细胞具体可为Daudi细胞。
[0020]本发 明还保护所述L4H7抗体在制备用于B细胞淋巴瘤治疗药物中的应用。
[0021]本发明对于B细胞淋巴瘤的治疗具有重大应用价值。



[0022]图1为实施例2中的洗脱曲线。
[0023]图2为实施例2中的10%SDS_PAGE图谱。
[0024]图3为实施例4中的ADCC的结果。
[0025]图4为实施例4中的⑶C的结果。

[0026]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0027]pcDNA-3.3 载体(线性质粒):1nvitrogen 公司，目录号 K8300-01。pOptiVEC 载体(线性质粒)Jnvitrogen 公司，目录号 12744-017)。CH0-DG44 细胞 Jnvitrogen 公司，目录号 A13737-01。0ptiPR0?SFM 培养液:Invitrogen 公司，目录号 12309-050。月旨质体(FreeStyle?MAX Reagent):1nvitrogen 公司，目录号 16447-100。CD DG44Medium:Invitrogen 公司，目录号 12610-010。CD 0ptiCH0?Medium:Invitrogen 公司，目录号12681-011。利妥昔单抗(溶液形式；100mg/10ml,无色透明液体；IgG,其轻链如序列表的序列6所示,其重链如序列表的序列7所示):德国RocheDiagnostics GmbH,产品批号H0119,查询序列号:10000661731142)。
[0028]利妥昔单抗具有30%左右的鼠源蛋白，长期使用会引起鼠抗人抗体反应而无法使用。因此，寻求更为有效的抗CD20抗原的抗体用于B淋巴瘤的治疗显得尤为迫切。发明人基于大量摸索、分析、验证，进行计算机建模和人源化改造，设计了一种抗CD20抗原的抗体(命名为L4H7抗体)。L4H7抗体为IgG，其轻链(命名为轻链L4)如序列表的序列I所示，其重链(命名为重链H7)如序列表的序列3所示。
[0029]序列表的序列I中，自N末端第1-20位氨基酸残基组成前导肽，第21-131位氨基酸残基组成轻链可变区VL (其中，第61-79位氨基酸残基组成⑶R1、第89-102位氨基酸残基组成⑶R1、第112-123位氨基酸残基组成⑶R3)，第132-234位氨基酸残基组成轻链恒定区CL。
[0030]序列表的序列3中，自N末端第1-19位氨基酸残基组成前导肽，第20-140位氨基酸残基组成重链可变区VH (其中，第50-67位氨基酸残基组成⑶R1、第81-96位氨基酸残基组成⑶R2、第102-119位氨基酸残基组成⑶R3)，第141-238位氨基酸残基组成重链恒定区CHl，第239-253 位氨基酸残基组成铰链区Hinge，第254-364位氨基酸残基组成重链恒定区CH2，第365-470位氨基酸残基组成重链恒定区CH3。
[0031]实施例1、构建重组质粒
[0032]1、将序列表的序列2所示的DNA分子插入pcDNA-3.3载体，得到重组质粒pcDNA_3.3_L40
[0033]序列表的序列2所示的DNA分子自5’末端第20_79位核苷酸编码前导肽，第80-412位核苷酸编码VL，第413-721位核苷酸编码CL，第722-724位核苷酸为终止密码子。
[0034]2、将序列表的序列4所示的DNA分子插入pOptiVEC载体，得到重组质粒p0ptiVEC-H7o
[0035]序列表的序列4所示的DNA分子自5’末端第14_70位核苷酸编码前导肽，第71-433位核苷酸编码VH，第434-727位核苷酸编码CHl区域编码CH1，第728-1115位核苷酸为内含子，第1116-1160位核苷酸编码Hinge，第1161-1278位核苷酸为内含子，第1279-1611位核苷酸编码CH2，第1612-1708位核苷酸为内含子，第1709-2026位核苷酸编码CH3，第2027-2029位核苷酸为终止密码子。即去除内含子后，序列表的序列4中的编码区如序列表的序列5所示。
[0036]实施例2、制备L4H7抗体
[0037]1、取 10 μ g 重组质粒 pcDNA-3.3-L4 和 10 μ g 重组质粒 p0ptiVEC_H7，用OptiPROTMSFM培养液定容至500 μ 1，室温放置5min。
[0038]2、取20 μ I的脂质体，用0ptiPR0?SFM培养液定容至500 μ 1，室温放置5min。
[0039]3、将步骤I的溶液和步骤2的溶液混匀，室温放置20分钟。
[0040]4、在带通气滤膜的125ml细胞培养瓶(瓶中装有20ml培养基)中接种CH0-DG44细胞(约I X IO6个细胞/瓶)，培养至细胞密度为80-90%时，800rpm离心4min，吸弃培养上清，每瓶加入4ml新鲜⑶DG44Medium重悬。
[0041 ] 5、将步骤3得到的溶液逐滴加入完成步骤4的细胞培养瓶中，混匀，在含8%C02的摇床中37°C、150rpm振荡培养5天(先培养6_8小时，然后800rpm离心4min，吸弃上清，重新加入30ml新鲜的CD 0ptiCH0?Medium后继续培养)，12000rpm离心15min，收集上清液，调pH至6.0-7.0，然后用0.45 μ m滤膜过滤，收集滤液。
[0042]6、取步骤5得到的滤液,采用rProtein A Sepharose4B亲和层析柱进行纯化。
[0043]rProtein A Sepharose4B亲和层析柱(法玛西亚公司，XK16柱子):柱体积为40毫升，内径为16晕米。
[0044]结合缓冲液(pH7.0):含0.15M NaCl的20mM磷酸盐缓冲液。[0045]洗脱缓冲液(ρΗ3.0):0.1M柠檬酸缓冲液。
[0046]流速:l_3ml/min。
[0047]过程:(I)用400ml结合缓冲液平衡柱子；(2)上样；(3)用400ml结合缓冲液洗涤柱子；(4)用200ml洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，洗脱曲线见图1，收集保留体积为32-80ml的过柱后溶液。
[0048]7、取步骤6得到的过柱后溶液，用Tris水溶液(pH9.0)调pH至7.0，然后使用截留分子量为30kd的超滤管(Millipore公司)进行浓缩，得到的溶液即为含L4H7抗体的溶液，命名为L4H7溶液。L4H7溶液的10%SDS_PAGE图谱见图2。
[0049]8、用pcDNA-3.3载体代替重组质粒pcDNA-3.3-L4，用pOptiVEC载体代替重组质粒p0ptiVEC-H7，依次进行步骤I至6，洗脱过程中不显示任何洗脱峰。
[0050]实施例3、亲和力检测
[0051]委托北京科诺信诚科技有限公司完成，简要流程如下:利用Fortebio仪器，将生物素化的⑶20抗原表位(⑶20抗原表位的氨基酸序列为:CEPANPSEKNSPSTQYCYSIQ)固相化到Skptavidin芯片上，分别流过5个不同浓度的待测抗体溶液(用pH7.2,0.01M的PBS缓冲液稀释实施例1制备的L4H7溶液或利妥昔单抗，得到不同浓度的待测抗体溶液，各个待测抗体溶液中的蛋白质浓度分别为0、25、50、75或lOOnmol/L)，检测结合(Kon)和解离(Koff)数值,从而计算亲和力(Kd)。
[0052]利妥昔单抗的亲和力(Kd)为6.48X 101，L4H7抗体的亲和力(Kd)为
1.91X10_9M。
[0053]实施例4、细胞实验
[0054]ADCC (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用)和⑶C (complement dependent cytotoxicity,补体依赖的细胞毒性作用)是抗体药物发挥靶向性消灭靶细胞的重要作用方式。这两种作用机制在抗体药物研发过程可应用于在体外研究、评价、筛选高性能的抗体药物，具有非常重要的意义。ADCC是指表达IgG Fe受体的效应细胞(NK细胞、巨噬细胞和中性粒细胞等)通过与已结合在肿瘤细胞表面的IgG抗体的Fe段结合，而杀伤这些靶细胞的作用。CDC是通过特异性抗体与细胞膜表面相应抗原结合，形成复合物而激活补体经典途径，所形成的攻膜复合物对靶细胞发挥裂解效应。Daudi细胞(人淋巴瘤细胞系):ATCC目录号CCL-213，经流式细胞术检测(用于检测CD20抗原的标记抗体为购自BD公司产品目录号为556632的FITC Mouse Ant1-Human⑶20)，⑶20抗原表达率为92%。DIO细胞膜绿色荧光探针:北京中生瑞泰科技公司，目录号60011。PI 染液:Sigma 公司，目录号 P4170-250MG。
[0055]一、确定利妥昔单抗的最佳用量
[0056]将利妥昔单抗与Daudi细胞37°C作用30分钟(反应体系为高糖DMEM培养基；利妥昔单抗在反应体系中的浓度分别为10 μ g/ml、20 μ g/ml、30 μ g/ml、40 μ g/ml或50 μ g/ml,以蛋白浓度计；Daudi细胞在反应体系中的浓度为I X 106/ml)，然后采用流式细胞术检测Daudi细胞上的CD20抗原表达，以其接近零表达时的利妥昔单抗浓度为最合适的作用浓度。
[0057]利妥昔单抗最合适的体外作用浓度为30 μ g/ml。
[0058]二、ADCC[0059]1、采用Ficoll-Hapaque分离外周血淋巴细胞(PBL)。
[0060]2、用DIO细胞膜绿色荧光探针标记Daudi细胞(按DIO细胞膜绿色荧光探针的说明书操作)，得到DIO标记的细胞。
[0061]3、取步骤2得到的DIO标记的细胞，与待测抗体在37°C培养箱中孵育30min (反应体系为高糖DMEM培养基；待测抗体为实施例1制备的L4H7溶液或利妥昔单抗，待测抗体在反应体系中的浓度为30 μ g/ml，以蛋白浓度计；细胞在反应体系中的浓度为I X 106/ml)，然后收集细胞，用PH7.2,0.01M的PBS缓冲液洗涤2遍。
[0062]4、取步骤3得到的细胞(靶细胞)，与步骤I得到的PBL (效应细胞)在37°C培养箱中孵育4小时(反应体系为高糖DMEM培养基；靶细胞在反应体系中的浓度为lX104/ml ;效应细胞在反应体系中的浓度分别为IX 106/ml、5X 105/ml或2.5X 105/ml，即靶效比分别为1:100、1:50或1:25)，然后加入PI染液并通过流式细胞术检测。
[0063]每个处理设置三个重复样本，结果取平均值。
[0064]DIO标记的完整细胞显示绿色。在效应细胞的作用下，靶细胞破碎，PI进入细胞核并染色，显示红色。靶细胞裂解率=红色细胞数量+ (红色细胞数量+绿色细胞数量)X 100%O
[0065]结果见图3。结果表明，在靶效比相等的情况下，加入L4H7抗体的靶细胞裂解率高于加入利妥昔单抗的靶细胞裂解率，即L4H7抗体的作用效果优于利妥昔单抗，可以更加显著的促进靶细胞裂解。
[0066]三、CDC
[0067]1、用DIO细胞膜绿色荧光探针标记Daudi细胞(按DIO细胞膜绿色荧光探针的说明书操作)，得到DIO标记的细胞。
[0068]2、取健康人血清，灭活，得到灭活血清。
[0069]3、取步骤I得到的DIO标记的细胞、与待测抗体(实施例1制备的L4H7溶液或利妥昔单抗)和步骤2得到的灭活血清在37°C培养箱中孵育4小时(反应体系为高糖DMEM培养基；祀细胞在反应体系中的浓度为lX106/ml ;待测抗体在反应体系中的浓度为30 μ g/ml,以蛋白浓度计；灭活血清在反应体系中的体积百分浓度分别为20%、10% ;设置不加入灭活血清的对照组，用0%血清浓度表示)，然后收集细胞，用pH7.2、0.01M的PBS缓冲液洗涤2遍。
[0070]4、取步骤I得到的DIO标记的细胞、与待测抗体(实施例1制备的L4H7溶液或利妥昔单抗)和健康人血清在37°C培养箱中孵育4小时(反应体系为高糖DMEM培养基；靶细胞在反应体系中的浓度为IXlOfVml ;待测抗体在反应体系中的浓度为30 μ g/ml，以蛋白浓度计；健康人血清在反应体系中的体积百分浓度分别为20%、10% ;设置不加入健康人血清的对照组，用0%血清浓度表示)，然后收集细胞，用pH7.2,0.01M的PBS缓冲液洗涤2遍。
[0071]5、取步骤3或步骤4得到的细胞，用pH7.2,0.01M的PBS缓冲液重悬，得到细胞浓度为lX105/ml的细胞悬液，然后加入PI染液并通过流式细胞术检测。
[0072]每个处理设置三个重复样本，结果取平均值。
[0073] DIO标记的完整细胞显示绿色。在效应细胞的作用下，靶细胞破碎，PI进入细胞核并染色，显示红色。靶细胞裂解率=红色细胞数量+ (红色细胞数量+绿色细胞数量)X 100%O[0074]结果见图4。结果表明，在加入健康人血清的情况下，加入L4H7抗体的靶细胞裂解率高于加入利妥昔单抗的靶细胞裂解率，即L4H7抗体的作用效果优于利妥昔单抗，可以更加显著的促进靶细胞裂解。
[0075]综上所述，L4H7抗体具有良好的抗Daudi细胞(表达⑶20抗原的B细胞淋巴瘤细胞)生长作用 ，有望成为一种用于临床治疗的抗体药物。