专利名称：HER－2/neu融合蛋白的制作方法尽管投入了大量人力物力，癌症仍然是主要死因之一。例如，癌症是35-74岁妇女中的头号死因。乳房癌是妇女中最常见的癌症，而且其发病率正在上升。据估计，9名妇女中就有1名可能被诊断为乳房癌。乳房癌的标准治疗方法主要围绕手术、放射和化疗相结合。这些疗法对某些癌症具有显著疗效。然而，如果诊断滞后，乳房癌将是最难治愈的。所以需要可早期诊断和治疗的方法。癌症的共同特征之一是细胞不受控制的生长。癌细胞似乎发生了转变，由其正常表型转变为可自主生长的恶性表型。体细胞基因的扩增和过度表达被认为是引起细胞恶变共同的最初行为。由致癌基因编码的恶性表型特征通过细胞分裂传递给恶变细胞的后代。至今，已鉴定了至少40个在癌细胞中活动，并引起或参与恶变的致癌基因。已根据这些基因产物(例如致癌基因表达的蛋白质)的推定功能或位置对这些致癌基因进行了分类。据信，在某些方面，致癌基因正常细胞生理学所必需的。例如，HER-2/neu致癌基因似乎是受体样糖蛋白类酪氨酸激酶家族的一员，与表皮生长因子受体(EGFR)具有高度的相同性。据推测，HER-2/neu在细胞生长和/或分化中起着一定作用。似乎，HER-2/neu通过一种正常基因产物的增加或下调所致的定量机制诱导了恶变。p185糖蛋白是HER-2/neu致癌基因的产物。在乳房癌、卵巢癌、结肠癌、肺癌和前列腺癌等多种癌症中，HER-2/neu基因发生扩增，p185过度表达。p185与恶变相关，被发现存在于卵巢、前列腺、结肠和肺等部位发生的50-60％导管原位癌，20-40％侵袭性乳房癌和腺癌实质性组分中。HER-2/neu表达不仅与恶性表型密切相关，而且与恶变发展相关。HER-2/neu的过度表达与乳房癌和卵巢癌的预后不良相关。p185是一种跨膜蛋白质，估计其分子量约185KD，长约1255个氨基酸。p185有一个645氨基酸的胞外域(ECD)，其氨基酸序列与EGFR具有至少40％相同性，一个高度疏水的跨膜域，和一个约580氨基酸的羧基末端胞内域(ICD)，与EGFR具有至少80％相同性。目前需要一种针对HER-2/neu相关恶变的抗癌疫苗，以及可激发或增强对HER-2/neu基因免疫应答的组合物和方法。本发明就针对了这些及其它重要目的。发明概述本发明提供了HER-2/neu p185融合蛋白，编码该蛋白的核酸分子，包含该编码聚核苷酸的病毒载体，用于免疫温血动物从而抵抗HER-2/neu相关性恶变。可将本发明的融合蛋白或核酸分子制成组合物，还包含药学上认可的的载体或稀释剂，例如水包油乳液，还可含有一种或多种其它活性成分，例如免疫刺激物，例如SBAS-2，3D-MPL，QS21或3D-MPL联合QS21。本发明的组合物可以是疫苗的形式，或以此形式使用。可将所述的融合蛋白、核酸分子、病毒载体、药物组合物和/或疫苗一次性给予(例如，给予具有癌症发生和复发高度危险性的个体，或怀疑患有癌症的人)，或定期给予(例如，给予具有癌症发生和复发高度危险性的个体，或怀疑患有癌症的人)。本发明的化合物或组合物可用于包括人在内的温血动物，用于治疗一种或多种已经存在的肿瘤，或预防肿瘤的发生或复发。
本发明还提供了一种通过激发或增强对HER-2/neu蛋白质免疫应答从而抑制或预防患者体内癌症发展的方法，包括给予患者以上所述的药物组合物或疫苗。所述患者可以是，例如，乳房癌、卵巢癌、结肠癌、肺癌或前列腺癌患者，本发明方法可用于治疗这些患者，或者预防性治疗具有以上癌症危发性的患者。实施方式之一中，所述的给予药物组合物或疫苗包括用本发明核酸分子体外转染温血动物的细胞，或用含本发明核酸分子的病毒载体体外感染温血动物的细胞，然后将转染或感染后的细胞回输给患者。
本发明还提供了一种去除生物样品中肿瘤细胞的方法，包括将生物样品与HER-2/neu融合蛋白特异性T细胞接触，所述接触步骤的条件和时间足以消除样品中表达该蛋白质的细胞。在相关的内容中，还提供了抑制患者体内癌症发展的方法，包括将如上处理的生物样品给予患者。
另一实施方式中，提供了激发和/或扩增HER-2/neu融合蛋白特异性T细胞的方法，包括将T细胞与一种或多种以下物质接触(i)上述融合蛋白；(ii)编码该融合蛋白的聚核苷酸，和/或(iii)表达该融合蛋白的抗原呈递细胞，接触的条件和时间足以激发和/或扩增T细胞。还提供了如上所述制备的分离的T细胞群。继而，本发明还提供了将有效量如上所述制备的T细胞群给予患者来抑制其体内癌症发展的方法。
另一实施方式中，本发明还提供了抑制患者体内癌症发展的方法，其步骤包括(a)将分离自患者的CD4+/CD8+T细胞与一种或多种以下物质共培养(i)HER-2/neu融合蛋白；(ii)编码该融合蛋白的聚核苷酸；(iii)表达该融合蛋白的抗原呈递细胞；和(b)给予患者有效量的增殖T细胞，由此抑制患者体内癌症的发展。在给予患者前，可以，但非必须，继续增殖细胞的克隆。
最后，本发明还提供了制造HER-2/neu融合蛋白的方法，其步骤包括(a)在细胞内引入表达载体，该载体包含编码HER-2/neu融合蛋白的聚核苷酸，(b)培养转染后的细胞；和(c)纯化表达产生的蛋白质。在一优选实施方式中，所述细胞是CHO细胞。另一优选实施方式中，对所述细胞进行无血清悬浮培养。另一实施方式中，所表达的蛋白质分两步纯化Q琼脂糖高效柱上的离子交换层析，和苯基琼脂糖6快速低取代柱上的疏水性层析。
通过以下详细描述和附图，本发明的以上及其它内容将是显而易见的。本发明分别参考了在此引用的各参考文献的全部内容。
附图简述

图1是pFLAGCMV-1/ICD表达质粒的图谱，其大小为6.7kb。
图2是pFLAGCMV-1/KD表达质粒的图谱，其大小为5.7kb。
图3是pFLAGCMV-1/PD表达质粒的图谱，其大小为5.7kb。
图4显示，HER-2/neu的磷酸化区分泌进入培养基，HER-2/neu的胞内域和激酶区不分泌进入培养基，参见实施方式3。
图5是表达载体pcDNA3.1/hygro/ECD-PD的图谱，大小为8.3kb。
图6显示HEK-293和CHO细胞内ECD-PD融合蛋白的表达结果，显示融合蛋白分泌进入培养基，参见实施方式4。
图7显示人HER-2/neu蛋白质的全长氨基酸序列(SEQ ID NO1)。
图8显示大鼠HER-2/neu蛋白质的全长氨基酸序列(SEQ ID NO2)。激酶区是其中的氨基酸721-998。
图9显示HER-2/neu蛋白质胞外域的氨基酸序列(SEQ ID NO3)。
图10显示人HER-2/neu蛋白质磷酸化区(PD)的氨基酸序列(SEQ ID NO4)。
图11显示人HER-2/neu蛋白质磷酸化区中一优选部分的氨基酸序列(ΔPD)(SEQ ID NO5)。
图12显示包含人HER-2/neu蛋白质的胞外域(ECD)和磷酸化区(PD)的融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO6)。
图13显示包含人HER-2/neu蛋白质的胞外域(ECD)和磷酸化区中优选部分(ΔPD)的融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO7)。
图14显示大鼠HER-2/neu蛋白质胞外域(ECD)的氨基酸序列(SEQ ID NO8)。
图15显示编码人HER-2/neu蛋白质的DNA分子的全长核苷酸序列(SEQ IDNO9)。该全长核苷酸序列可参见WO96/30514，本发明全面参考了其内容。
图16显示编码大鼠HER-2/neu蛋白质的DNA分子的全长核苷酸序列(SEQID NO10)。该全长核苷酸序列可参见Bargmann等(1986)，自然，319226-30，和GENBANK/X03362，本发明全面参考了其内容。
图17是ELISA试验结果半抗原与哺乳动物细胞或大肠杆菌细胞内产生的不同ECD-PD融合蛋白结合。大肠杆菌产生的融合蛋白与C-或N-末端6×组氨酸尾(分别记为C-His尾和N-His尾)同框。
图18是无血清条件下悬浮培养，CHO-K1细胞和毕赤氏酵母细胞内HER-2/neu ECD-PD融合蛋白表达的比较。
图19显示小鼠HER-2/neu的核苷酸序列。
图20显示小鼠HER-2/neu的氨基酸序列。

的描述前言本发明涉及能够调节(以激发或增强为佳)对HER-2/neu致癌基因表达的蛋白质产物的免疫力，包括作用于温血动物体内的如下恶变，其中，扩增的HER-2/neu基因及相关恶变不需要肿瘤上存在该基因的蛋白质表达产物。例如，该基因的过度表达可能涉及肿瘤形成的引发和早期阶段，但此后，该蛋白质的表达减少或消失。本发明可用于激发或增强有效的免疫应答，从而将HER-2/neu阳性肿瘤转变为HER-2/neu阴性，避免HER-2/neu阳性肿瘤的形成，并引起已有HER-2/neu阳性肿瘤的消退。
以下是本发明中的缩写“ECD”表示胞外域，“ICD”表示胞内域，“PD”表示胞内域中的磷酸化区(即，被磷酸化的区域)，“ΔPD”表示磷酸化区内的一个片段，“KD”表示胞内域中的激酶区。HER-2/neu基因表达的产物在此称为“HER-2/neu蛋白质”，又称“p185”或“c-erbB2”。定义“HER-2/neu ECD-ICD融合蛋白”，即“ECD-ICD”或“ECD-ICD融合蛋白”，指包含HER-2/neu蛋白质胞外域(或其片段)和胞内域(或其片段)的融合蛋白(或其片段)。在此，ECD-ICD融合蛋白不包括HER-2/neu跨膜域的实质性部分，最好完全不包括HER-2/neu跨膜域。
“HER-2/neu ECD-PD融合蛋白”，即“ECD-PD”或“ECD-PD融合蛋白”，或“HER-2/neu ECD-ΔPD融合蛋白”，即“ECD-ΔPD”或“ECD-ΔPD融合蛋白”，指包含HER-2/neu蛋白质胞外域(或其片段)和磷酸化区(或其片段，如ΔPD)的融合蛋白(或其片段)。ECD-PD和ECD-ΔPD不包括HER-2/neu跨膜域的实质性部分，最好完全不包括HER-2/neu跨膜域。
“HER-2/neu ECD-ICD融合蛋白”和“HER-2/neu ECD-PD融合蛋白”及相关的术语应理解为包括其片段、类似物和功能相当物(统称为“变异体”)，例如有一处或多处氨基酸插入、缺失或取代的那些，在本发明优选实施方式中，它们或者(i)比HER-2/neu蛋白质更强地激发或增强免疫应答，或(ii)基本上不影响HER-2/neu蛋白质激发或增强免疫应答(例如，变异体激发辅助T细胞或细胞毒T细胞应答，或激发抗体的产生)。具体的非限定性变异体实例包括HER-2/neuECD-ICD融合蛋白和HER-2/neu ECD-PD融合蛋白的片段、类似物和功能相当物。变异体可以“基本上相同”或“基本上相似”于含有天然多肽组分、并保留了激发免疫应答的能力的融合蛋白。
“融合蛋白”指至少由两段多肽共价连接而成的蛋白质，其中，一段多肽来自一种蛋白质序列或区域，另一段则来自另一蛋白质序列或区域。这些多肽可以直接连接，也可以通过共价接头(例如氨基酸接头(如聚甘氨酸接头)，化合物接头(例如碳酸水合物接头)，脂质接头，脂肪酸接头，或聚醚接头(例如PEG等)连接(参见Hermanson，生物偶联技术(1996))。形成融合蛋白的多肽一般以C末端与N末端相连，但也可能C末端与C末端相连，N末端与N末端相连，或N末端与C末端相连。融合蛋白中多肽的顺序可以任意。“融合蛋白”还包括修饰变异体，多态变异体，等位基因变异体，突变体，构成融合蛋白的多肽的亚序列和种间类似物。融合蛋白的制备可通过将一种蛋白质序列的氨基酸链与另一蛋白质序列的氨基酸链共价连接，例如通过制备连续编码该融合蛋白的重组聚核苷酸。融合蛋白可包含来自相同或不同物种的2、3、4或更多种不同氨基酸链。一个融合蛋白内的不同氨基酸链可以直接拼接在一起，也可以通过化学连接基团或氨基酸连接基团间接拼接在一起。融合蛋白还可以包含本发明所述的其它组分。
“蛋白质”在此与“多肽”和“肽”同义。
“核酸”指脱氧核糖核酸或核糖核酸，以及它们聚合物的单链或双链形式。它还包括如下含有已知核苷酸类似物或修饰骨架残基和连键的核酸合成的，天然的，非天然的，与所参照的核酸具有相似结合特性的，与之具有相同代谢方式的。此类类似物的例子包括但不限于硫代磷酸酯，磷酰胺，磷酸甲酯，手性磷酸甲酯，2-O-甲基核糖核苷酸，肽-核酸(PNAs)。
除非另作说明，一段特定的核酸序列还暗含其保守性修饰的变异体(例如简并性密码子的取代)和互补序列，以及明确列出的序列。具体地说，获得简并密码子取代可通过生成多段如下序列其中，用混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代一个或多个(或全部)选定密码子的第三位(Batzer等(1991)，核酸研究，195081；Ohtsuka等(1985)，生物化学杂志，2602605-2608；Rossolini等(1994)，分子细胞探针，891-98)。在此，核酸与基因，cDNA，mRNA，寡核苷酸和聚核苷酸同义。
在严谨条件下，含本发明融合蛋白的聚核苷酸序列可与编码该融合蛋白中各多肽的核苷酸序列杂交。因此，编码融合多肽内各多肽的聚核苷酸序列包括保守性修饰的变异体，多态变异体，等位基因变异体，突变体，亚序列和种间类似物。
“序列相同性百分比”通过在一个比较窗内比较最适排列的两段序列来测定，其中，为了获得两序列的最适排列，聚核苷酸序列比较窗内的部分与参比序列(没有增加或缺失)对比时可以有增加或缺失(例如空格)。百分比的计算为确定两序列中核酸碱基或氨基酸残基相同的位置数，得出匹配位数，将其除以比较窗内的总位数，再乘以100，得出序列相同性百分比。
聚核苷酸序列“基本相同”表示具有至少25％序列相同性。相同性百分比也可能在25-100％之间。较好的实施方式是，用本发明所述的方法，与参比序列相比的相同性为至少25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，99％，或更高；较好的方法是后文所述采用标准参数的BLAST。本领域技术人员知道，考虑密码子简并性，氨基酸相似性，读码框位置等因素，可对这些数值适当调整，从而确定两核苷酸序列所编码蛋白质的相同性。就此而言，氨基酸序列“基本相同”指序列相同性至少40％，以40-100％为佳，更好的是至少60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或99％。“基本相似”的多肽其序列共同性如前所述，但不相同残基的位置上可以是保守性氨基酸取代。保守性氨基酸取代指具有相似侧链的残基之间的可互换性。例如，具有脂肪族侧链的氨基酸组是甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的氨基酸组是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的氨基酸组是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的氨基酸组是苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的氨基酸组是赖氨酸，精氨酸和组氨酸；具有含硫侧链的氨基酸组是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守性氨基酸取代是缬氨酸-赖氨酸-异亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸-赖氨酸-精氨酸，丙氨酸-缬氨酸，天冬氨酸-谷氨酸，天冬酰胺-谷氨酰胺。
对比序列的最适排列可按照Smith和Waterman(1981)，Add.APL.Math.2482所述的局部相同性算法，Needleman和Wunsch(1970)分子生物学杂志，48443所述的相同性排列算法，Pearson和lipman(1988)美国科学院院报852444所述的相似性研究方法，以及这些算法的计算机化形式(Wisconsin基因软件包中的GAP，BESTFIT，BLAST，FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group(GCG)，575 Science Dr.Madison，WI)来进行，或通过目测。
适合用于测定序列相同性或相似性的较好的算法例是BLAST和BLAST 2.0算法，分别参见Altschul等(1977)，核酸研究253389-3402和Alschul等(1990)，分子生物学杂志215403-410。采用本文所述的参数使用BLAST和BLAST2.0，测定本发明核酸和蛋白质的序列相同性百分比。BLAST软件通过国家生物技术信息中心(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)向公众开放。用参数M(匹配残基对的得分；总是＞0)和N(错配碱基对的罚分；总是＜0)计算核苷酸序列的累计分值。用计分矩阵来计算氨基酸序列的累计分值。在以下时刻终止各方向上的计分延续当累计排列分值由所得最大值下降达X时；当累计分值因一个或多个负分残基排列累积而趋于0或0以下；当达到其中之一序列的末端时。BLAST算法参数W，T和X决定排列对比的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)采用其默认值字符长度(W)11，期望值(E)10，M＝5，N＝-4，并对两条链都进行比较。对于氨基酸序列，采用BLASTP程序，采用其默认值字符长度(W)3，期望值(E)10，以及BLOSUM62计分矩阵(参见Henikoff和Henikoff(1989)美国科学院院报8910915)排列(B)50，期望值(E)10，M＝5，N＝-4，对两条链都进行比较。
如果在中等严谨条件下，最好是高度严谨条件下，两分子能够彼此杂交，或与第三种核酸杂交，也表明它们基本相同。严谨条件视序列而异，而且不同环境下也不同。序列越长，特异性杂交的温度越高。有关核酸杂交的全面论述可参见Tiissen，“生物活性和分子生物学技术-与核酸探针的杂交”中“有关杂交原理和核酸试验策略的综述”(1993)。通常，严谨条件的选择应是比特定序列在确定离子强度和pH下熔点Tm低约5-10℃。Tm即(确定离子强度和pH下)50％的靶序列与优选匹配探针杂交的温度。通常，严谨条件应选择pH7.0至8.3时，盐浓度低于1.0M钠离子(通常为0.01-1.0M钠离子或其它盐浓度)，短探针(例如10-50个核苷酸)的温度约30℃，长探针(例如超过50个核苷酸)的温度约60℃。也可以加入甲酰胺之类去稳定剂来获得严谨条件。对于选择性或特异性杂交来说，阳性信号为背景杂交的2倍以上，是其10倍以上则更好。
严谨条件的例子如50％甲酰胺，5×SSC和1％SDS，42℃培养；或5×SSC，1％SDS，65℃培养，并以0.2×SSC和0.1％SDS在65℃洗涤。
为了实现本发明的目的，合适的“中等严谨条件”包括，例如在5×SSC，0.5％SDS，1.0mM EDTA(pH8.0)溶液中预洗，在50-65℃，5×SSC中杂交过夜，然后用2×、0.5×和0.25×SSC(含0.1％SDS)65℃洗涤2次，每次20分钟。这些杂交DNA序列也属于本发明范围之内。
“T细胞增殖”在此包括T细胞的繁殖，以及引起其繁殖的T细胞刺激，即，引起有丝分裂的事件和有丝分裂本身。检测T细胞增殖的方法如后文所述。本发明的融合蛋白A.HER-2/neu蛋白质的胞内域和胞外域根据以上所述对HER-2/neu的研究结果，将HER-2/neu蛋白质选作抗癌疫苗的目标。该方法的主要困难之一在于难以分离到足量的HER-2/neu蛋白。解决该问题的一种代偿是在哺乳动物细胞内分别表达ECD和ICD。ECD是高水平表达的分泌蛋白质，从1L小鼠细胞培养物中可纯化得到约20mg ECD蛋白。然而，ICD的表达水平很低，从1L HEK-293细胞仅可纯化得到约0.2mg ICD蛋白。此外，所得的ICD蛋白在细胞裂解物中很不稳定，会对纯化造成许多预想不到的问题。
如上所述，HER-2/neu是一种癌基因自身蛋白质，对自身蛋白质的免疫耐受性会抑制免疫应答。对特定蛋白质不同部分的免疫耐受性水平可能取决于所表达的蛋白质部分是在细胞膜内还是膜外。ECD在细胞表面，是分泌蛋白。相反，ICD及其部分位于细胞内，不是分泌蛋白。ECD易与机体的免疫系统接触，而ICD及其部分与机体的免疫系统则相对隔离。因此，对HER-2/neu蛋白ECD的免疫耐受性高于对ICD部分的耐受性。因此，对本发明的疫苗来说，与ECD蛋白和ECD肽相比，ICD蛋白和ICD肽，其变异体，包括PD部分和PD肽可诱导更高水平的免疫应答。
虽然ICD及其变异体的免疫原性高于ECD及其变异体，但对ECD及其变异体的抗体仍是有益的，也可能是必要的。ECD位于细胞表面，而ICD及其部分不是分泌蛋白，隐蔽在细胞内。因此，对ECD的抗体应答具有更高的治疗价值，因而为本发明所优选。ECD本身的免疫原性不高。因为ICD(包括PD和ΔPD)的免疫原性高于ECD，ECD-ICD融合蛋白和/或ECD-PD融合蛋白的免疫原性高于单独的ECD。ECD-ICD融合蛋白和/或ECD-PD融合蛋白也许可比单独ECD更有效地诱导抗ECD的抗体，因而为本发明所优选。
本发明中，将ECD或其变异体与ICD或其变异体(以PD或其变异体为佳)组合、连接或融合(直接或通过接头)。ECD提供的结构构型诱导能与细胞表面HER-2/neu蛋白质反应的抗体，ICD或PD则提高ECD的免疫原性。与单独ECD相比，以上组合诱导对ECD免疫应答的效率有出人意料的提高。
可将ECD或其部分与ICD或其变异体(包括ICD的部分或PD或其变异体(包括PD的部分，例如ΔPD))组合。本发明的ECD最好是人、大鼠或小鼠的ECD。人ECD参见图9，SEQ ID NO3。大鼠ECD参见图14，SEQ ID NO8。
本发明的ICD最好是人、大鼠或小鼠的ICD。人ECD参见图7，SEQ ID NO1，包括其中Lys676-Val1255。大鼠ECD参见图8，SEQ ID NO2，包括其中的Lys677至Val1256。
本发明的PD最好是人、大鼠或小鼠的PD。人PD参见图10，SEQ ID NO4。人PD可以是人ΔPD，参见图11，SEQ ID NO5。大鼠PD参见图8，SEQ ID NO2，包括其中的Gln991至Val1256。大鼠PD可以是大鼠ΔPD，参见图8，SEQ IDNO2，包括其中的Gln991至Arg1049。
实施方式之一中，人ECD可与以下所述之一融合(i)人ICD或大鼠ICD，或(ii)人PD或ΔPD，或大鼠PD或ΔPD。另一实施方式中，大鼠ECD可与以下所述之一融合(i)人ICD或大鼠ICD，或(ii)人PD或ΔPD，或大鼠PD或ΔPD。
HER-2/neu PD长268氨基酸，位于胞内，可以被蛋白质酪氨酸激酶磷酸化。该区域与其它酪氨酸激酶受体的相应区域没有相同性。因此，该区域的特异性和独特性使其特别适合作为肿瘤疫苗。然而，该区域难以在细菌或哺乳动物相比内单独表达。例如，生成的PD很不稳定，不适合大规模生成。实施方式之一中，本发明通过将该胞内域全部或部分或其磷酸化区与HER-2/neu胞外域的全部或部分融合解决了该问题。本发明ECD-ICD融合蛋白和ECD-PD融合蛋白是可溶蛋白，分泌蛋白，可稳定存在于培养基。该系统可提供大量的胞内域或磷酸化区用于癌症疫苗的开发，尤其是乳房癌疫苗的开发，可用于抵抗以HER-2/neu表达为特征的各种抗癌疫苗。除了可提高胞内域或磷酸化区或其变异体的表达之外，作为与胞外域或其变异体所成的融合蛋白，ECD-ICD和ECD-PD融合蛋白提供了更好的疫苗制剂。
通过在PD的N末端引入一段分泌信号，可将PD改造成分泌蛋白质，成为可溶性、分泌型重组蛋白。因为重组蛋白可在培养基内积累，所以最好有分泌过程。因为该蛋白质不与胞内蛋白质偶联，所以蛋白质裂解有限。应可更方便、更经济地纯化该蛋白质。
如实施方式3所述，用pFLAGCMV-1表达质粒(Kodak)来确定HER-2/neu胞内域的哪个区域可分泌。表达的蛋白质是融合蛋白，在其N末端有一段前胰蛋白酶原(preprotrypsin)分泌信号和FLAG-标签。用这样的构建物转染HEK-293细胞，用FLAG-标签M2抗体作为探针，通过Western印迹法检测细胞和培养液中的FLAG-标签融合蛋白。图4中的结果证明全长ICD或KD都不分泌，但PD是可溶性和分泌型的，可在培养液中检测到。该结果表明，全长ICD或KD不分泌，即不能穿越细胞膜。
如实施方式4所述，ECD有一段分泌信号序列，可表达为分泌蛋白，可作为PD的融合伴侣。在HEK-293细胞内表达ECD-PD融合蛋白。用HER-2/neu ECD特异性抗体通过ELISA试验，再用HEK-2/neu PD特异性抗体通过Western印迹检测可溶性ECD-PD融合蛋白的分泌。如图6所示，HEK-293表达可溶性的ECD-PD，并分泌进入培养液。
B.本发明融合蛋白的免疫原性在优选实施方式之一中，本发明涉及基于HER-2/neu基因蛋白质表达产物特定部分的融合蛋白(例如，HER-2/neu ECD-ICD融合蛋白或HER-2/neu ECD-PD融合蛋白)，它能激发抗体应答，并可被胸腺依赖性淋巴细胞(T细胞)识别。因此，可用自身的免疫T细胞应答预防或治疗HER-2/neu正在或已经过度表达的癌症。另一方面，本发明涉及指导ECD-ICD融合蛋白，或ECD-PD融合蛋白，或其变异体表达的核酸分子的免疫用途，其可单独使用或在表达载体中使用。
通常，在被特定抗原激发时，CD4+T细胞群被认为通过释放淋巴因子起着辅助或诱导细胞的作用；然而，CD4+细胞的一个亚群具细胞毒T淋巴细胞的作用(CTL)。类似的，CD8+T细胞的作用被认为是裂解抗原靶细胞；然而，在许多场合，它们可以分泌淋巴因子，起到辅助细胞或DTH作用。尽管功能可能有所重叠，但表型CD4和CD8都与识别I类或II类MHC抗原相结合的肽相关。识别I类或II类MHC中的抗原使得CD4+和CD8+T细胞对不同条件下呈递的不同抗原或相同抗原作出反应。免疫原性肽与II类MHC抗原的结合最常发生于被抗原呈递细胞所摄取的抗原。
如本发明所述，作为HER-2/neu致癌基因蛋白质表达产物的ECD-ICD融合蛋白或ECD-PD融合蛋白可被T细胞识别。循环中的HER-2/neu ECD-ICD融合蛋白或HER-2/neu ECD-PD融合蛋白被降解成肽片段。ECD-ICD融合蛋白或ECD-PD融合蛋白的肽片段可与主组织相容性复合物(MHC)抗原结合。通过在细胞表面展示与HMC抗原结合的肽，并由宿主的T细胞识别肽加自身MHC抗原，则HER-2/neu ECD-ICD或HER-2/neu ECD-PD融合蛋白(包括癌细胞上表达的那些)将对T细胞具有免疫原性。T细胞受体的精确特异性使得各T细胞能辨别相差仅一个氨基酸残基的蛋白质片段。
在对ECD-ICD融合蛋白或ECD-PD融合蛋白的肽片段的免疫应答中，所表达的T细胞受体与肽-MHC复合物具有高结合亲和力的T细胞将与肽-MHC复合物结合，于是被激活、诱导而增殖。在首次遭遇某肽时，少量免疫T细胞会分泌淋巴因子，增殖，并分化为效应和记忆T细胞。体内将发生初次免疫应答，但在体外难以检测到。当记忆T细胞再次遇上同一抗原时，就会引起更快、更强的免疫应答。第二次应答在体内和体外都会发生。通过以下测定即可测定体外反应测定T细胞群再次接触抗原时的增殖程度，细胞因子产生的程度，或溶胞活性。T细胞群在对特定抗原的应答中显著增殖，被认为表明曾经接触过该抗原，或曾以该抗原初免疫过。
C.本发明的融合蛋白实施方式之一中，本发明的化合物包含HER-2/neu ECD-ICD融合蛋白或其变异体，或编码该ECD-ICD融合蛋白的聚核苷酸。较好的是，所述核酸分子是DNA分子。在本发明的HER-2/neu ECD-ICD融合蛋白中，ECD和ICD多肽组分可直接融合，或通过接头(例如氨基酸接头或其它化学接头)融合。一优选实施方式中，本发明的ECD-ICD融合蛋白包含完整或部分HER-2/neu ECD与完整或部分HER-2/neu ICD的融合。
另一实施方式中，可通过依次去除ECD羧基末端1-100氨基酸中任一区段来改变ECD-ICD融合蛋白中ECD的大小，最好是去除约100个氨基酸。类似的，可通过依次去除ICD的N末端和/或C末端1-100氨基酸中任一区段来改变ECD-ICD融合蛋白中ICD的大小。得到的变异体可用文献或本发明所述的合适的筛选方法，根据它们的抗原性和/或免疫原性进行筛选，然后用于本发明。
另一实施方式中，本发明的化合物包含HER-2/neu ECD-PD融合蛋白，或其变异体，或编码该ECD-PD融合蛋白的核酸分子。实施方式之一中，HER-2/neuECD与HER-2/neu ΔPD融合。较好的是，该核酸分子是DNA分子。在本发明的HER-2/neu ECD-PD融合蛋白中，ECD，PD或ΔPD组分可直接融合，或通过接头(例如氨基酸接头或其它化学接头)融合。优选实施方式之一中，本发明的ECD-PD融合蛋白中的HER-2/neu ECD与HER-2/neu PD或ΔPD直接融合。本发明中，优选的本发明融合蛋白是HER-2/neu PD融合蛋白。
另一实施方式中，可通过依次去除ECD羧基末端1-100氨基酸中任一区段来改变ECD-PD融合蛋白中ECD的大小，最好是去除约100个氨基酸。类似的，可通过依次去除PD的N末端和/或C末端1-100氨基酸中任一区段来改变ECD-PD融合蛋白中PD的大小。其它变异体可用文献或本发明所述的合适的筛选方法，根据它们的抗原性和/或免疫原性进行筛选，然后用于本发明。
表1显示，去除ECD羧基末端的100个氨基酸对ECD-PD融合蛋白的表达水平和稳定性没有影响。
表1ECD截短—PD小结

ECD-ICD融合蛋白和ECD-PD融合蛋白的变异体还包括天然ECD-ICD融合蛋白和ECD-PD融合蛋白的各种结构形式。因为存在可离子化的氨基和羧基，HER-2/neu ECD-ICD或ECD-PD融合蛋白可以是酸式盐或碱式盐的形式，或者是中性形式。各氨基酸残基还可以通过氧化或还原来修饰。
本发明范围内的其它变异体包括如下ECD-ICD融合蛋白或ECD-PD融合蛋白其中天然HER-2/neu ECD-ICD或天然HER-2/neu ECD-PD蛋白质的一级氨基酸结构通过与其它肽或多肽或化学基团(例如糖基，脂类，磷酸，乙酰基等)共价偶联或聚集而被修饰。共价衍生物可以通过将特定官能团与氨基酸侧链或N末端或C末端连接来制备。
本发明还包括糖基化或没有糖基化的HER-2/neu ECD-ICD融合蛋白和HER-2/neu ECD-PD融合蛋白。酵母或哺乳动物表达系统中表达的ECD-ID融合蛋白或ECD-PD融合蛋白，因为表达系统的缘故，在分子量和糖基化方式上可能与天然分子相似或略有不同。编码多肽的DNA在大肠杆菌等细菌内表达通常得到非糖基化的分子。真核蛋白质N糖基化位点的特征是三联氨基酸Asn-A1-Z，其中A1可以是除Pro之外的任意氨基酸，Z是Ser或Thr。具有非活化N糖基化位点的HER-2/neu ECD-ICD或ECD-PD融合蛋白的变异体可用本领域熟知的技术来制备，例如寡核苷酸合成和连接，或定点诱变技术，这些都属于本发明范围之内。或者，也可以将N连接的糖基化位点加入HER-2/neu ECD-ICD或ECD-PD融合蛋白中。
本发明的ECD-ICD融合蛋白(包括其变异体)包括人和非人源多肽所有可能的组合。非人多肽包括来自各种动物的多肽，例如大鼠，小鼠，豚鼠，马，牛，猪，羊，狗等。实施方式之一中，ECD-ICD融合蛋白包括(i)人ECD-人ICD融合蛋白，例如图9(SEQ ID NO3)的人ECD与图7(SEQID NO1)氨基酸序列(包括Lys676-Val1255)的人ICD直接或通过化学和/或氨基酸接头连接而成的融合蛋白，或其变异体；(ii)大鼠ECD-大鼠ICD融合蛋白，例如图14(SEQ ID NO8)的大鼠ECD与图8(SEQ ID NO2)所示氨基酸序列(包括Lys677-Val1256)的大鼠ICD直接或通过化学和/或氨基酸接头连接而成的融合蛋白，或其变异体；(iii)人ECD-大鼠ICD融合蛋白，例如图9(SEQ ID NO3)的人ECD与图8(SEQ ID NO2)所示氨基酸序列(包括Lys677-Val1256)的大鼠ICD直接或通过化学和/或氨基酸接头连接而成的融合蛋白，或其变异体；(iv)大鼠ECD-人ICD融合蛋白，例如图14(SEQ ID NO8)的大鼠ECD与图7(SEQ ID NO1)所示氨基酸序列(包括Lys676-Val1255)的人ICD直接或通过化学和/或氨基酸接头连接而成的融合蛋白，或其变异体。
本发明ECD-ICD融合蛋白的各种变异体都属于本发明的实施方式。实施方式之一中，这样的变异体与天然HER-2/neu ECD-ICD蛋白基本相同或基本相似，并保留了激发免疫应答的能力。编码ECD蛋白质的人DNA序列可参见图15(SEQID NO9)，包括核苷酸1-1959。编码ICD蛋白的人DNA序列可参见图15(SEQ IDNO9)，包括核苷酸2026-3765。不难测定各种序列修饰对于HER-2/neu ECD-ICD蛋白质引起免疫应答能力的影响，例如，可通过采用本文所述的方法分析突变HER-2/neu ECD-ICD蛋白质诱导T细胞应答的能力，或通过分析突变HER-2/neuECD-ICD蛋白质产生抗体的能力。
本发明ECD-PD融合蛋白(包括变异体)包括人和非人源多肽所有可能的组合。非人多肽包括来自各种动物的多肽，例如大鼠，小鼠，豚鼠，马，牛，猪，羊，狗等。实施方式之一中，ECD-PD融合蛋白包括(i)人ECD-人PD融合蛋白，如图12(SEQ ID NO6)所示或其变异体，例如图9(SEQ ID NO3)的人ECD与图10(SEQ ID NO4)所示的人PD直接或通过化学和/或氨基酸接头连接而成的融合蛋白，或其变异体；(ii)大鼠ECD-大鼠PD融合蛋白，例如图14(SEQ ID NO8)的大鼠ECD与包括图8(SEQ ID NO2)所示氨基酸序列Gln 991-Val1256的大鼠PD直接或通过化学和/或氨基酸接头连接而成的融合蛋白，或其变异体；(iii)人ECD-大鼠PD融合蛋白，例如图9(SEQ ID NO3)的人ECD与图8(SEQID NO2)所示氨基酸序列(包括Gln 991-Val1256)的大鼠PD直接或通过化学和/或氨基酸接头连接而成的融合蛋白，或其变异体；(iv)大鼠ECD-人PD融合蛋白，例如图14(SEQ ID NO8)的大鼠ECD与图10(SEQ ID NO4)所示的人PD直接或通过化学和/或氨基酸接头连接而成的融合蛋白，或其变异体。
本发明ECD-PD融合蛋白的各种变异体都属于本发明的实施方式。实施方式之一中，这样的变异体与天然HER-2/neu ECD-PD蛋白基本相同或基本相似，并保留了激发免疫应答的能力。编码ECD蛋白质的人DNA序列可参见图15(SEQ IDNO9)，包括核苷酸1-1959。编码PD蛋白的人DNA序列可参见图15(SEQ IDNO9)，包括核苷酸2986-3765。不难测定各种序列修饰对于HER-2/neu ECD-PD蛋白质产生免疫应答的能力的影响，例如，可通过采用本文所述的方法分析突变HER-2/neu ECD-PD蛋白质诱导T细胞应答的能力，或通过分析突变HER-2/neuECD-PD蛋白质产生抗体的能力。
另一实施方式中，本发明ECD-PD融合蛋白是ECD-ΔPD融合蛋白(包括变异体)包括人和非人源多肽所有可能的组合。非人多肽包括来自各种动物的多肽，例如大鼠，小鼠，豚鼠，马，牛，猪，羊，狗等。实施方式之一中，ECD-PD融合蛋白包括(i)人ECD-人ΔPD融合蛋白，如图13(SEQ ID NO7)所示或其变异体，例如图9(SEQ ID NO3)的人ECD与图11(SEQ ID NO5)所示的人ΔPD直接或通过化学和/或氨基酸接头连接而成的融合蛋白，或其变异体；(ii)大鼠ECD-大鼠ΔPD融合蛋白，例如图14(SEQ ID NO8)的大鼠ECD与包括图8(SEQ ID NO2)所示氨基酸序列Gln991-Arg1049的大鼠PD直接或通过化学和/或氨基酸接头连接而成的融合蛋白，或其变异体；(iii)人ECD-大鼠ΔPD融合蛋白，例如图9(SEQ ID NO3)的人ECD与图8(SEQ ID NO2)所示氨基酸序列(包括Gln991-Arg1049)的大鼠ΔPD直接或通过化学和/或氨基酸接头连接而成的融合蛋白，或其变异体；(iv)大鼠ECD-人ΔPD融合蛋白，例如图14(SEQ ID NO8)的大鼠ECD与图11(SEQ ID NO5)所示的人ΔPD直接或通过化学和/或氨基酸接头连接而成的融合蛋白，或其变异体。
本发明ECD-ΔPD融合蛋白的各种变异体都属于本发明的实施方式。实施方式之一中，这样的变异体与天然HER-2/neu ECD-ΔPD蛋白基本相同或基本相似，并保留了激发免疫应答的能力。编码ECD蛋白质的人DNA序列可参见图15(SEQID NO9)，包括核苷酸1-1959。编码ΔPD蛋白的人DNA序列可参见图15(SEQ IDNO9)，包括核苷酸2968-3144。不难测定各种序列修饰对于HER-2/neu ECD-ΔPD蛋白质产生免疫应答的能力的影响，例如，可通过采用本文所述的方法分析突变HER-2/neu ECD-ΔPD蛋白质诱导T细胞应答的能力，或通过分析突变HER-2/neuECD-ΔPD蛋白质产生抗体的能力。
本发明的优选实施方式中，本发明的HER-2/neu ECD-PD融合蛋白是ECD-ΔPD蛋白。
在某

中，本发明的融合蛋白包含某种融合伴侣，例如免疫融合伴侣或表达增强者。例如，融合伴侣可协助提供T辅助细胞表位(免疫融合伴侣)，最好是人可识别的T辅助细胞表位，或者协助以高于重组融合蛋白的得率表达融合蛋白(表达增强者)。某些优选的融合伴侣既是免疫融合伴侣，又是表达增强伴侣。也可选择其它融合伴侣来提高融合蛋白的溶解度，或使得融合蛋白针对于特定的胞内区室。还可以选择具有亲和尾的融合伴侣，用来协助融合蛋白的纯化。
本发明还提供了包含本文所述融合多肽与一种不相关免疫原性蛋白共同构成的融合蛋白。较好的是，所述的免疫原性蛋白能够激发回忆反应。此类蛋白质包括破伤风蛋白，结核蛋白和肝炎蛋白(参见Stoute等(1997)，新英格兰医学杂志，33686-91)。
其它实施方式中，由蛋白质D，一种革兰氏阴性流感嗜血杆菌B(WO91/18926)的表面蛋白获得了一种免疫融合伴侣。较好的是，蛋白质D衍生物约包含该蛋白质的前三分之一(例如，N末端的前100-110个氨基酸)，而且，蛋白质D衍生物可以脂化。在优选实施方式中，在N末端连接脂蛋白D融合伴侣的前109个残基，为融合蛋白增加例外的外源性T细胞表位，并提高其在大肠杆菌中的表达水平(因此作为表达增强者)。脂质尾可优化融合蛋白向抗原呈递细胞的呈递。其它融合伴侣包括流感病毒的非结构蛋白，NS1(血凝素)。通常采用N末端前81个氨基酸，但也可以使用包含T辅助细胞表位的其它片段。
在另一实施方式中，免疫融合伴侣是LYTA蛋白或其部分(以C末端部分为佳)。LYTA来自可合成N-乙酰基-L-丙氨酸酰胺酶(又称LYTA酰胺酶)(由LytA基因编码)的肺炎链球菌(参见，基因43265-292，1986)。LYTA是一种自溶酶，特异性降解肽聚糖骨架中的某些键。LYTA的C末端区负责与胆碱或DEAE等胆碱类似物的亲和力。这一特性已被用来开发用于表达融合蛋白的大肠杆菌C-LYTA表达质粒(参见，生物技术10795-798，1992)。在一优选实施方式中，可在融合蛋白内加入一LYTA重复段。该重复段被发现位于C末端，从第178位残基开始。一段特别好的重复段包含残基188-305。
在一优选实施方式中，本发明的融合蛋白还包含一个融合伴侣。优选的融合伴侣包括但不限于Ra12或LeIF。特别是，本发明提供了用Ra12或LeIF序列作为融合伴侣提高重组融合多肽稳定性和表达量，或者突破耐受性的材料和方法。
Ra12是结核分支杆菌MTB32A编码序列的一段C末端14kD片段，它能够高水平的自身表达，并在纯化过程中保持可溶形式。LeIF是与真核核糖体蛋白质eIF类似的利什曼原虫抗原，它能够激发Th1和/或CTL免疫应答(参见，例如美国专利5,876,966，5,876,735，5,879,687)。本发明利用Ra12和LeIF多肽的这些特性提供了为了稳定而高水平表达除HER-2/neu融合多肽之外还含Ra12和LeIF多肽的融合多肽的重组核酸分子，表达载体，宿主细胞和方法。编码含Ra12和LeIF多肽的融合多肽的和有意义融合多肽的重组核酸分子可通过传统基因工程技术来构建。最好，构建成的重组核酸分子中，融合伴侣聚核苷酸位于选定融合蛋白序列的5＇端。或者，也可将融合伴侣聚核苷酸序列置于有意义融合蛋白聚核苷酸序列的3＇端，或者将融合蛋白的聚核苷酸插入融合伴侣聚核苷酸序列内的某一位点。此外，本文所述的各种编码融合伴侣或其部分或其变异体的合适的聚核苷酸都可用来构建本发明的重组融合核酸。
本发明编码融合伴侣多肽的核酸可以用各种本领域已知的方法来制备。这些方法例如合适序列的克隆和限制性酶切，或者用Narang等(1979)酶学方法6890-99所述的磷酸三酯法，Brown等(1979)酶学方法68109-151所述的磷酸二酯法；Beaucage等(1981)Tetra Lett.，221859-1862所述的二乙基亚磷酰胺法和美国专利4,458,066所述的固相支持法直接化学合成。
编码包含融合伴侣多肽和选定融合蛋白的融合多肽的重组核酸可用各种本领域的已知方法来制备。如前所述，构建而成的核酸分子中，融合伴侣聚核苷酸宜位于编码有意义融合蛋白的聚核苷酸序列的5＇端。还可以对融合伴侣和融合蛋白聚核苷酸序列进行修饰，促进其融合和表达。
重组核酸分子还可以包含其它核苷酸序列，例如有助于纯化的亲和性尾的编码序列。
D.本发明融合蛋白的变异体CD4+T细胞一般识别位于肿瘤细胞外的抗原。相反，在一般情况下，只有位于胞质溶胶中并由靶分子自己合成的蛋白质才会与I类MHC的结合，细胞外的蛋白质不在此列。这种情况的例外是外源多肽与高浓度的位于胞外的一类特定I类结合基序结合。因此，CD4+和CD8+T细胞在功能上存在很大差异，各自识别不同的抗原，反映抗原通常所在的位置不同。
另一种进行氨基酸取代来产生本发明变异体的方法是鉴定并替换T细胞基序中可能结合II类MHC分子(对CD4+T细胞应答)或I类MHC分子(对CD8+T细胞应答)的氨基酸。具有理论上可能结合II类分子的基序的(HER-2/neu ECD-ICD或ECD-PD融合蛋白的)肽节段可通过计算机分析来鉴定。例如，可用蛋白质序列分析软件包“T位点”，其中有数个设计用来鉴别可能性T细胞识别位点的计算机程序(Feller等(1991)，自然，349720-721)。可用两种检索程序(1)Margalit所述的AMPHI程序(Feller等(1991)，自然，349720-721；Margalit等(1987)，免疫学杂志，1382213-2229)根据α螺旋周期和两亲性来鉴定表位基序；(2)Rothbard和Taylor程序根据电荷和极性来鉴定表位基序(Rotherbard等(1988)EMBO，793-100)。兼具两种基序的节段最适合与II类MHC分子的结合。CD8+T细胞可识别与I类MHC分子结合的肽。Parker等(1994)免疫学杂志152163已认定，结合特定MHC分子的肽具有共同的可识别的基序。通过对取自一种培养细胞系的HLA-A2.1分子的肽Edman降解，鉴定了一段结合HLA-A2.1槽区的肽基序(表2，摘自Falk等(1991)，自然，351290-296)。根据该方法的鉴定，HLA-A2.1结合性肽一般长9个氨基酸，优势锚残基位于2位(L)和9位(V)。常见的强结合性残基是2(M)，4(E，K)，6(V)和8(K)。鉴定到的该基序代表了许多结合肽的普遍基序。
表2HLA-A2.1限制性基序

目前鉴定的衍生肽基序并不特别严谨。有些HLA-A2.1结合性肽不兼具两个优势锚残基，而且优势锚残基两侧的氨基酸对结合或不结合起着重要作用。并非所有具有所述基序的肽都能结合，有些没有该基序的肽也能结合。然而，所述基序足可鉴定出能够结合的肽。需要指出的是，所有MHC和各自的基序在2位和9位的两个优势锚氨基酸之间有6个氨基酸。
在鉴定了HER-2/neu ECD-ICD或ECD-PD融合蛋白内的肽基序后，就可进行保守性或非保守性的氨基酸取代。后一种取代是为了产生更有效和/或交叉反应性更广泛的ECD-ICD或ECD-PD融合蛋白或多肽。更有效蛋白质或肽的一个例子是它能够以更高的亲和力与天然蛋白质或多肽的同样的MHC分子结合，但不影响T细胞对天然蛋白质或多肽的特异性识别。交叉反应性更广泛的多肽的一个实例是它能够比天然多肽诱导更广泛的免疫交叉反应(即结合更多种的MHC分子)。同理，位于肽的基序之间并具有间隔功能的一个或多个氨基酸(例如与MHC分子或T细胞受体不反应)可以被保守性或非保守性取代。对本领域技术人员来说显而易见的是，可用多种试验来测定含有一个或多个氨基酸取代的多肽是利于或不利的免疫应答，从而鉴定其激发T细胞识别的能力。
本发明所述的变异体还可以包含其它修饰，包括氨基酸缺失或增加，如前所述，这些修饰对于所需的多肽的免疫特性的影响必须最小。知道，可以使用HER-2/neu ECD-ICD或ECD-PD融合蛋白非天然延伸形式或截短形式，只要所需的免疫特性与全长天然HER-2/neu ECD-ICD或ECD-PD融合蛋白基本相当。为了避免在复性时形成不正确的分子间二硫键，可将半胱氨酸残基去除或取代。其它诱变方法包括修饰相邻碱性氨基酸残基以增强其在酵母系统内的表达，该系统中存在KEX2蛋白酶活性。本发明融合蛋白的制备A.编码融合蛋白的聚核苷酸本发明涉及分离或纯化的聚核苷酸，它编码HER-2/neu融合蛋白。根据本发明，任何编码融合蛋白氨基酸序列的核苷酸都可用来产生重组分子，指导融合蛋白的表达。
为了克隆全长编码序列或类似变异体以产生HER-2/neu融合聚核苷酸，可用标记DNA探针(根据HER-2/neu核酸或其互补序列的任一部分设计而成)筛选基因组或cDNA库，鉴定出融合蛋白各组分的编码序列。HER-2/neu核苷酸可以是任意合适的哺乳动物的，例如大鼠，小鼠，马，牛，猪，羊，狗等。
实施方式之一中，HER-2/neu序列是人、大鼠或小鼠的序列。小鼠HER-2/neu序列可参见图19(SEQ ID NO11)。可由小鼠的脑RNA扩增得到小鼠HER-2/neu，所用的引物是5＇引物CCTAGGAGCTGGCGGCCTGGTGCCGTTG(SEQ IDNO12)和3＇引物GGCCTTCTGGTTCATACTGGCACATCCAGGC(SEQ IDNO13)。小鼠HER-2/neu氨基酸序列参见图20(SEQ ID NO14)。小鼠HER-2/neu氨基酸序列的一种变异可参见Nagata等，免疫学杂志，1591336-1343(1997)。
可在合适的表达文库中筛选表达全长HER-2/neu蛋白质的克隆来分离这样的克隆。文库的建立和筛选可按照本领域的常用方法进行，例如Sambrook等，分子克隆实验室手册，Cold Spring Harbor Laboratories，Cold Spring HarborNY(1989)。简而言之，将噬菌体表达库接种在平板上，然后转移到滤膜上。将滤膜与检测剂共培养。本发明中，“检测剂”即各种能与HER-2/neu蛋白结合，然后可用各种已知方法测定的化合物。典型的检测剂具有与报道基团偶联的“结合剂”，例如A蛋白，G蛋白，IgG或凝集素。优选的报道基团包括酶，底物，辅因子，抑制剂，染料，放射性核素，发光基团，荧光基团和生物素。更好的报道基团是辣根过氧化物酶，它可通过与底物，例如四甲基联苯胺或2，2＇-偶氮-二(3-乙基苯并噻唑啉磺酸共培养来检测。用已知技术分离出含表达HER-2/neu蛋白质的基因组或cDNA序列的噬菌斑，并纯化。合适的方法可参见Sambrook等，分子克隆实验室手册，Cold Spring Harbor Laboratories，Cold Spring HarborNY(1989)。
也可以用两段简并性寡核苷酸引物，通过聚合酶链反应(PCR)来分离编码序列，所述引物的设计以本发明所述的编码序列为基础。也可以用其它已知的扩增方法来克隆所需的核酸。可用的体外扩增方法包括PCR，连接酶链反应(LCR)，Qβ-复制酶扩增及其它RNA聚合酶介导的技术，可参见Sambrook和Ausubel所述，以及美国专利4,683,202；PCR方法方法及应用指南(Innis等编辑，1990)；Amheim&Levinson C&EN pp.36-47(1990年10月1日)；NIH研究杂志381-94(1991)；Kwoh等(1989)美国科学院院报861173；Guatelli等(1990)美国科学院院报871874；Lomell等(1989)临床化学杂志351826；Landegren等(1988)科学2411077-1080；Van Brunt(1990)生物技术8291-294；Wu等(1989)基因4560；以及，Barringer等(1990)基因89117。克隆体外扩增的核酸的改良方法参见Wallace等的美国专利5,426,039。适合用于扩增本发明核酸的引物可根据本文所述的序列来设计。
根据本发明，本发明的聚核苷酸编码融合蛋白、其片段、或其功能相当物，可用它来产生重组核酸分子，从而在合适宿主细胞内引起融合蛋白、其片段、或其功能相当物的表达。可通过对编码序列的分子操作来改变聚核苷酸编码的融合多肽产物。
由于密码子固有的简并性，也可用编码级别相同或功能相当的氨基酸序列的其它DNA序列来实施本发明，以表达该融合多肽。这样的DNA序列包括，能够在中低或高度严谨条件下与后文所述编码序列或其互补序列杂交的那些。
可用于本发明的改变后的核苷酸序列含有不同核苷酸残基的缺失、增加和取代，于是得到一段编码相同或功能相当基因产物的序列。该基因产物本身可以含有氨基酸残基的缺失、增加或取代，引起沉默突变，从而得到功能相当的抗原性表位。可以根据有关残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性、和/或两亲性特征的相似性来制造此类保守性氨基酸取代。例如，负电荷氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；正电荷氨基酸包括赖氨酸，组氨酸和精氨酸；具有无电荷极性头部，且疏水性近似的氨基酸包括甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸和酪氨酸；具有非极性头部的氨基酸包括丙氨酸，缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，甲硫氨酸和色氨酸。
为了不同的目的可通过基因工程改造本发明的核苷酸序列，从而改变融合蛋白的编码序列，所述的目的包括但不限于改善基因产物的加工和表达。例如，可用已知技术(例如引入或去除限制酶位点)引入突变，从而改变糖基化方式，磷酸化作用，创建和/或破坏翻译、启动、和/或终止序列，或在编码区内制造变异，从而促进此后的体外修饰。本领域有许多可在给定核酸构建物内进行改变的方法。此类方法包括，例如，定点诱变，用简并寡核苷酸进行的PCR扩增，含核酸的细胞与诱变剂接触或接受辐照，化学合成所需的寡核苷酸(例如，结合连接反应和/或克隆，形成大核酸分子)，以及其它众所周知的技术(参见Giliman等(1979)，基因881-97，Hutchinson等(1978)生物化学杂志2536551；Roberts等(1987)自然328731-734)。较好的是，所述的操作不破坏融合多肽的免疫原性。
本发明实施方式之一中，可用本领域熟知的方法全部或部分合成融合蛋白的编码序列(参见，Caruthers等(1980)，核酸研究7215-233；Gre等(1980)核酸研究9(10)2331；Matteucci等(1980)，Tetrahedron Letter21719(1980)；和Chow等(1981)核酸研究9(12)2807-2817。
B.多肽的合成或者，可用化学合成完整或部分氨基酸序列的方法合成融合多肽本身。例如，可用固相技术合成肽，例如Merrifield固相合成法，其中，将氨基酸依次加到延伸链上(参见Merrifield(1963)美国化学协会杂志852149-2146)。已可购买到自动多肽合成设备，例如Perkin Elmer Biosystems，Inc.(Foster City，CA)的产品，一般按照制造者的说明进行操作。然后可从树脂上切下合成的肽，通过例如制备性高效液相层析进行纯化(参见，Greighton，蛋白质结构和分子原理，50-60(198))。合成融合多肽的组成可通过氨基酸分析或测序来检验(例如，Edman降解法；参见Greighton，蛋白质，结构和分子原理，pp.34-49(1983))。
此外，可在序列内引入非经典氨基酸或化学氨基酸类似物作取代或增加。非经典氨基酸包括但不限于，普通氨基酸的D异构型，α-氨基异丁酸，4-氨基丁酸，Abu，2-氨基丁酸，γ-Abu，ε-Ahx，6-氨基己酸，Aib，2-氨基异丁酸，3-氨基丙酸，鸟氨酸，正亮氨酸，正缬氨酸，羟基脯氨酸，肌氨酸，瓜氨酸，半胱磺酸，叔丁基甘氨酸，叔丁基丙氨酸，苯基甘氨酸，环己基丙氨酸，β-丙氨酸，氟氨基酸，β-甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸，Nα-甲基氨基酸等，以及其它氨基酸类似物。此外，氨基酸可以是D型(右旋)也可以是L型(左旋)。
C.连接基团实施方式之一中，融合蛋白的多肽，例如ECD与ICD，或ECD与PD，通过连接基团连接。连接基团可以是化学交联剂，包括例如琥珀酰亚氨基-(N-马来酰亚氨基甲基)-环己烷-1-羧酸酯(SMCC)。连接基团还可以是附加的氨基酸序列，包括例如聚甘氨酸连接基团。
在一种特殊的实施方式中，融合蛋白中各多肽的编码序列可以按照任意顺序，通过肽键直接在氨基或羧基末端相连。
也可以用一段氨基酸接头序列将第一和第二多肽组分隔开足够的距离，从而确保各自能够折叠成各自的二级和三级结构。可用本领域已熟知的方法将此类氨基酸接头序列加入该融合蛋白。可根据以下因素选择合适的肽接头序列(1)能够形成柔性延展构型；(2)其二级结构不会与第一和第二多肽上的功能性表位相互作用；(3)没有可能与多肽功能性表位相互作用的疏水性或带电残基。优选的肽接头序列含有Gly，Asn和Ser残基。接头序列中也可采用其它近中性氨基酸，例如Thr和Ala。可用作接头的氨基酸序列可参见，Maratea等(1986)基因4039-46；Murphy等(1986)美国科学院院报838258-8262；美国专利4,935,233和4,751,180。接头序列一般长约1-50氨基酸。当第一和第二多肽具有非必须N末端氨基酸区时可以不用接头序列，因为该区可将功能性区域间隔开来，避免立体干扰。
其它化学接头包括糖类接头，脂类接头，脂肪酸接头，聚醚接头，例如PEC等(参见，Hermanson，生物偶联技术(1996))。
D.其它多肽如上所述，融合蛋白可以与一段或多段其它多肽连接。例如，融合多肽可以与该融合蛋白的一种或两种多肽的一份或多份拷贝相连。或者，可将融合蛋白与一段异源多肽(例如前述Ra12或LeIF)相连。还可将该融合多肽与一段亲和尾融合，从而简便表达后的纯化。例如，由此尾编码的多组氨酸可允许用金属螯合物亲和层析法来纯化融合多肽。其它亲和尾分子的例子包括例如，Strep-尾，PinPoint，麦芽糖结合蛋白，谷胱甘肽S转移酶等(参见，Glick&Pasternak，分子生物技术原理和重组DNA的应用(第2版，1999))。
实施方式之一中，融合多肽还可以与一脂类部分相连，例如分枝菌酸，lipoaribdomanin(LAMs)或海藻糖衍生物。
如前所述，实施方式之一中，这样的融合蛋白是通过编码该融合蛋白的核酸分子重组表达产生的。可用已知方法，将编码所需氨基酸序列的核酸序列彼此连接，置于正确的读码框内，表达该产物，由此得到融合产物。或者，可通过蛋白质合成来制造这样的产物，例如，用肽合成仪。还可以在该融合聚核苷酸中加入例如细胞因子或佐剂等其它分子的编码序列。
E.序列的修饰可如下鉴定保留了激发免疫应答能力的本发明融合蛋白的变异体按以上所述一项或多项内容修饰该序列，然后测定所得融合蛋白激发免疫应答(例如T细胞应答或抗体应答)的能力。例如，一般可如下进行所述的试验将T细胞与修饰后的融合蛋白接触，并分析应答反应。还可以分离构成融合蛋白的各多肽的天然变异体例如，用编码各多肽或其变异体的DNA序列筛选合适的cDNA或基因组库。
引入上述序列修饰可采用标准重组技术或通过修饰融合蛋白的自动合成。例如，将突变引入特定基因座可通过合成一段含突变序列的寡核苷酸，其两侧为能将该区连入天然序列的限制酶位点。连接后，所得的构建序列就编码一个具有所需氨基酸插入、取代或缺失的类似物。
或者，还可用寡核苷酸指导的定点诱变来产生特定密码子被取代、缺失或插入的基因。产生以上改变的方法可参见Walder等(1986)基因42133；Bauer等(1985)基因3773；Graik(1985)生物技术，一月12-19；Smith等，基因工程原理和方法，Plenum Press(1981)；和美国专利4,518,584和4,737,462。
当然，为表达HER-2/neu蛋白质而构建的核苷酸序列内的突变必须保持编码序列的读码框，而且，不宜形成可杂交形成mRNA二级结构(例如环区或发卡区)的互补区，这些二级结构会阻碍mRNA的翻译。虽然突变的位点可以预定，但上述突变的性质却不一定能预计。例如，为了挑选一个给定位点上具有最佳特性的突变，可以对目标密码子进行随机诱变，对表达的突变HER-2/neu融合蛋白筛选所需活性。并非所有编码HER-2/neu融合蛋白的核苷酸序列内的突变都会表达在最终产物中。例如，可用核苷酸取代来增强表达，主要是避免转录mRNA内二级环结构的形成(参见，欧洲专利申请75,444A)，或者用来提供更可能被选定宿主翻译的密码子，例如用于大肠杆菌表达的常用大肠杆菌偏爱密码子。
F.表达载体本发明HER-2/neu融合蛋白，其变异体宜通过重组DNA方法来产生。这样的方法包括将编码HER-2/neu融合蛋白的DNA序列插入重组表达载体，然后在有利表达的条件下，在重组的细菌、哺乳动物细胞，真菌或昆虫细胞表达系统内表达该DNA序列，而且，最好分泌该融合蛋白。本发明编码HER-2/neu融合蛋白的DNA序列可用cDNA片段与短寡核苷酸接头拼接而成，或由一系列寡核苷酸拼接而成，从而得到能够插入重组表达载体，并以一个重组转录单位表达的合成基因。
重组表达载体中，编码HER-2/neu融合蛋白的DNA序列与来自哺乳动物、真菌、细菌、病毒或昆虫基因的合适转录或翻译调控元件操作性连接。所述的调控元件包括转录启动子，任选的控制转录的操纵序列，编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列，和控制转录和翻译终止的序列。还可以含有复制起点和协助转化子鉴别的选择标记。
当DNA区域彼此功能性相关时，需将它们操作性连接。例如，如果需要表达参与多肽分泌的前导肽，则可将信号肽(分泌前导序列)的DNA与多肽的DNA操作性相连；如果一个启动子可控制序列的转录，则可将其与编码区操作性相连；如果一个核糖体结合位点可促进翻译，则可将其与编码序列操作性相连。“操作性相连”一般表示毗邻相连，对分泌性前导序列而言还必需在读码框内相连。用于微生物内表达的编码HER-2/neu融合蛋白的DNA序列最好不含内含子，内含子会提前终止DNA向mRNA的转录。
用于细菌的表达载体可含有市售质粒的选择标记和细菌复制起点，所述的市售质粒含有熟知的克隆载体pBR322(ATCC37017)中的各种遗传元件。这些市售质粒例如pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)，pGEM 1(PromegaBiotec，Madison，WI)，pET28b(Novagen)和pPDM(pET28b的修饰型，Corixa)。将这些pBR322“骨架”的组件与合适的启动子和待表达的结构序列组合。pBR322是一种来自大肠杆菌的质粒(Bolivar等(1977)基因295)，常用其转化大肠杆菌。pBR322具有氨苄青霉素和链霉素抗性，因此可方便地鉴定出转化细胞。重组微生物表达载体的常用启动子包括β-内酰胺酶(青霉素酶)和乳糖启动子系统(Chang等(1978)，自然275615；和Goeddel等(1979)自然281544；色氨酸(trp)启动子系统(Goeddle等1980，核酸研究84057)和欧洲专利申请36,776)和tac启动子(Maniatis，分子克隆实验室手册，Cold Spring Harbor laboratory，p.142(1982))。一种特别有用的细菌表达系统采用噬菌体λPL启动子和cI857ts热敏阻抑蛋白。可向美国典型培养物保藏中心获取的含λPL启动子的质粒载体包括大肠杆菌JMB9(ATCC37092)内的pHUB2，和大肠杆菌RR1(ATCC53082)内的pPLc28。
适合酵母载体的合适启动子包括醇氧化酶、金属硫蛋白、3-磷酸甘油酸激酶的启动子(Hitzeman等(1980)，生物化学杂志2552073)或其它糖酵解酶(Hess等(1968)，J.Adv.Enzyme Reg.7149；和Holland等(1978)生物化学，174900)，例如烯醇化酶，甘油醛-3-磷酸脱氢酶，己糖激酶，丙酮酸脱羧酶，果糖磷酸激酶，葡萄糖-6-磷酸异构酶，3-磷酸甘油酸变位酶，丙酮酸激酶，丙糖磷酸异构酶，葡萄糖磷酸异构酶和葡糖激酶。有关酵母表达的合适载体和启动子可参见欧洲专利申请73,657。
可将用于在大肠杆菌内选择和复制的pBR322的DNA序列(Ampr基因和复制起点)与包含葡萄糖可抑制性ADH2启动子和α-因子分泌前导序列的酵母DNA序列组装成适用的酵母载体。有关ADH2启动子可参见Russel等(1982)，生物化学杂志2582674和Beier等(1982)自然300724。酵母α-因子前导序列引起异源蛋白质的分泌，可将其插入启动子与需表达的结构基因之间(参见Kurjan等(1982)，细胞30933；和Bitter等(1984)美国科学院院报815330)。可对该前导序列进行修饰，从而在3＇端包含一个或多个有用的限制酶位点，从而利于该前导序列与异源基因的融合。
可在表达载体中使用病毒来源的转录和翻译调控序列来转化脊椎动物细胞。例如，常用的是多瘤病毒、腺病毒2、猴病毒40(SV40)和人巨细胞病毒的启动子和增强子。可用SV40病毒基因组的DNA序列，例如SV40复制起点，早期和晚期启动子，增强子，剪接和聚腺苷酸化位点提供表达异源DNA序列所需的其它遗传元件。特别有用的是早期和晚期启动子，因为，两者都很容易从病毒中得到，其形式为另含SV40复制起点的片段(Fiers等(1978)自然273113)。也可以使用更大或更小的SV40片段，只要含有病毒复制起点中从Hind III到BglII之间的约250bp序列。此外，凡与所选的宿主细胞相容的病毒基因组启动子，调控和/或信号序列均可使用。可按照Okayama等(1983)分子细胞生物学3280所述构建此类载体。
可按照Cosman等(1986)分子免疫学23935所述，构建在C127小鼠乳房上皮细胞内稳定高水平表达哺乳动物受体cDNA的系统。适合表达本发明融合蛋白的一种真核载体是pCD406(McMahan等(1991)，EMBO杂志102821，其中有SV40，人免疫缺陷病毒(HIV)和埃博病毒(EBV)的调控序列)。载体还包括pDC409和pDC410，它们都来自pDC406。pDC410以编码SV40大型T抗原的序列取代了pDC406中的EBV复制起点。pCD409与pDC406的区别在于缺失多克隆位点外的BglII位点，使得多克隆位点内的BglII位点成为唯一。任意其它启动子，只要能够在CMV启动子、SV40早期启动子、SV