一种DNA分子及毕赤酵母重组质粒和高效表达耐辐射球菌PprI蛋白的毕赤酵母重组菌的制作方法【技术领域】[0001]本发明涉及生物【技术领域】，具体涉及一种DNA分子及毕赤酵母重组质粒和高效表达耐福射球菌PprI蛋白 的毕赤酵母重组菌。[0002]在核事故、核恐怖以及核战争等核突发事件中，电离辐射可引起人体严重的急性放射损伤(acute radiation injury, ARI)。福射损伤的救治与防护关系到原子能的和平利用与国家核安全，因此，该领域研究已成为世界各国政府和学者高度关注与重点投入的研究领域。[0003]耐福射球菌(Deinococcus radiodurans, DR)是迄今在地球上发现的福射抗性最强的原核细菌，该菌极强的抗辐射能力与其本身具有完善而高效的DNA修复系统有关，多种DNA修复基因及其蛋白质对其特异的辐射抗性起着至关重要的作用。White等人于1999年首次公布了 DR菌的基因序列，其中促DNA修复多效蛋白诱导因子(inducer ofpleiotropic proteins promoting DNA repair, pprl)是耐福射球菌中一种具有重要调控作用的辐射抗性基因，它含有987bp，编码328个AA，其产物PprI蛋白质是由DR_0167编码，分子量为37KD。近年研究表明，pprl基因是耐辐射球菌控制DNA修复和保护途径的总开关基因，耐辐射球菌受照后PprI蛋白通过多种信号通路调控210多种基因的上调表达，其中包括21中与DNA修复和复制相关的基因【H Lu，H Chen, G Xu, et al.DNARepair, 2012，11 (2): 139-145】。耐辐射球菌发现50余年来，世界各国学者对耐辐射球菌基因、蛋白质功能及其机理开展了深入细致的研究。然而，迄今为止，这些研究只局限于原核细胞内，即耐辐射球菌自身或大肠杆菌。[0004]申请号为200910003512.2的中国专利首次构建了一种耐辐射球菌pprl基因的真核表达重组质粒pCMV-HA-pprl，将其转入人胚肾293T细胞和受照哺乳动物体内，成功表达了 PprI蛋白质，对动物致死性急性放射损伤具有非常显著的防治作用，表明PprI蛋白质有望成为用于急性放射损伤防治的一种新的生物制剂。然而，该专利真核表达重组质粒pCMV-HA-pprl通过人体细胞工程目前尚难以获得高效大量表达和纯化的PprI蛋白质。[0005]应用原核表达系统大肠杆菌可高效表达和纯化PprI蛋白【张永芹，周辉，陈洁，杨占山.辐射研究与辐射工艺学报，2011，29 (2):117-122.】，然而，该种技术存在许多缺陷:1.表达的蛋白质没有经过糖基化等翻译后修饰，导致活性降低；2.表达的蛋白质以包涵体形式存在，变性提取时也会导致蛋白质活性降低；3.大肠杆菌本身内毒素和有毒蛋白可混杂在目的蛋白产物中，导致应用受限。[0006]酵母是基因工程常用的真核表达系统之一，其中巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)是以甲醇为唯一碳源的酵母工程菌的一种。该酵母具有如下优点，1.该酵母遗传操作简单，基因组高度稳定，可高水平表达外源基因；2.能进行蛋白质翻译后的修饰行为，如糖基化，二硫键形成，信号肽切除等；3.表达载体不含酵母复制原点，外源基因同源重组到酵母细胞染色体中稳定存在，整合后的外源基因随酵母的生长可稳定传代。[0007]如果能够通过真核表达系统毕赤酵母表达纯化耐辐射球菌PprI蛋白，那么现有技术中通过人体细胞或原核表达系统大肠杆菌表达纯化PprI蛋白的缺陷将会得到改善或解决。但是，耐辐射球菌属于原核生物，其与真核生物毕赤酵母在种系进化上存在巨大差异，例如基因和蛋白质组成与功能、蛋白质氨基酸密码子偏爱性等方面显著不同。所以，若直接将耐辐射球菌PPrI基因通过基因工程构建到毕赤酵母表达系统中，预实验研究证实不可能并且也不利于高效表达耐辐射球菌PprI蛋白，按照本领域一般的基因改造技术很难成功解决这一难题。
[0008]因此，本发明提供一种通过真核表达系统毕赤酵母成功表达纯化耐辐射球菌(Deinococcus radiodurans Rl) PprI蛋白的技术,为进一步研究该蛋白质的功能、机制和应用奠定了厚实的基础，填补了国际辐射损伤和防护领域尚无原核抗放蛋白质的空白，使我国在辐射防护剂原创蛋白质药物的研究跻身国际先进行列。


[0009]有鉴于此，本发明的目的是提供一种新合成的DNA分子，使得所述DNA分子能够通过巴斯德毕赤酵母成功高效表达和纯化PprI蛋白。
[0010]此外，本发明还提供同样能够实现发明目的的包含所述DNA分子的重组质粒和高效表达耐福射球菌PprI蛋白的毕赤酵母重组菌。
[0011]为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案:
[0012]一种DNA分子,其包含SEQ ID NO:1所不核苷酸序列。
[0013]本发明在保持PprI蛋白质氨基酸序列不变的前提下，对耐辐射球菌(Deinococcus radiodurans Rl)pprl 基因(DR_0167,Gene ID: 1798483)开放阅读框(OpenReading Frame, 0RF)序列进行优化改造,编码合成新的pprl基因，即SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，为区别原有pprl基因，将SEQ ID NO:1所示核苷酸序列命名为P1-pprI基因。
[0014]本发明所述包含SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的DNA分子是指在SEQ ID NO:1所示核苷酸序列之外可以增加一些便于分离纯化蛋白诸如6XHis标签序列等序列，本领域技术人员能够利用现有技术将这些不影响P1-PPrI基因正常表达的序列与P1-pprI基因序列连接到一起，这对于技术人员来说是能够实现的。
[0015]此外，本领域技术人员可以根据实际要插入的质粒的酶切位点在所述DNA分子的两端增加相对应的酶切位点，也可以选择其他合适的标签序列，不仅限于本发明提到的6XHis标签序列，这些选择在本发明提供了关键的P1-pprI基因序列后均可以依靠现有技术实现，同样未超出本发明的核心技术范畴。
[0016]作为优选,SEQ ID NO:1所示核苷酸序列由SEQ ID NO:2_41所示核苷酸序列的引物通过Overlapping PCR扩增得到。本发明利用SEQ IDN0:2_41所示核苷酸序列的一系列互相重叠(OVERLAP)引物(以下简称p-1至p-40)的重叠部分进行互补退火形成模板DNA，再通过Overlapping PCR方法合成得到SEQ ID NO:1所示核苷酸序列。Overlapping PCR扩增示意图参见图1。
[0017]作为优选，上述制备方法可分别用SEQ ID N0:2-17所示核苷酸序列的引物(p-1至p-16)、SEQ ID N0:16-29所示核苷酸序列的引物(p-15至p-28)以及SEQ ID NO: 28-41所示核苷酸序列的引物(P-27至p-40)合成得到三个片段，进而再用SEQ ID N0:2所示核苷酸序列的引物(P-1)和SEQ ID N0:41所示核苷酸序列的引物(p-40)扩增形成整个DNA分子。
[0018]作为优选，所述Overlapping PCR方法合成的条件为:98 °C 30s，58 °C 30s，72°C lmin，共25个循环，最后72°C 7min。反应体系为:
[0019]
p-1 (10 μιηο1/1)I μL
ρ-η (IO μιηο1/1)I μL
ρ-2 至 ρ- (η-1)(I μιηο1/1)各 1.5 μL
5 xPrimeSTAR? Buffer10 μL
dNTPs (2.5 mmol/1)4 μ!
PrimeSTAR? HS DNA Polymerase0.5 μL
CldH2O加至总体积50 μL
[0020]作为优选，本发明所述DNA分子包含SEQ ID NO:1所示核苷酸序列和6XHis标签序列，所述6XHis标签序列位于SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的5’端，其制备方法如下:
[0021]以包含SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的DNA分子为模板，利用带有6 XHis标签序列的SEQ ID NO: 42所示核苷酸序列的引物和SEQ IDNO: 41所示核苷酸序列的引物进行PCR扩增，得到包含SEQ ID NO:1所示核苷酸序列和6XHis标签序列的DNA分子。
[0022]所述PCR 扩增条件为:95°C 5min，94°C 30s,50°C 30s,72°C 90s，共进行 30 次循环，最后 72°C 10min，4°C保温。
[0023]同时，本发明还提供一种毕赤酵母重组质粒，由毕赤酵母表达质粒插入包含SEQID NO:1所示核苷酸序列的DNA分子获得。
[0024]作为优选，所述毕赤酵母重组质粒由pHBM-905A质粒在Cpo I和Not I酶切位点间插入包含SEQ ID NO:1所示核苷酸序列和6XHis标签序列组成的DNA分子获得，所述6XHis标签序列位于SEQ IDN0:1所示核苷酸序列的5’端。本发明所述毕赤酵母重组质粒构建示意图参见图2。
[0025]此外，本发明还提供一种毕赤酵母重组工程菌，由本发明任意一种毕赤酵母重组质粒转化到毕赤酵母感受态细胞中获得。
[0026]作为优选，所述毕赤酵母重组工程菌由毕赤酵母重组质粒经Sal I酶切线性化后，电转化到毕赤酵母GS115感受态细胞中获得。
[0027]经凝胶电泳检测和测序，本发明所述毕赤酵母重组质粒能够成功扩增出大小和序列与SEQ ID NO:1所示核苷酸序列一致的片段,利用SDS-PAGE电泳、Western blotting和质谱检测，证实其编码的氨基酸序列与耐辐射球菌的PprI蛋白序列一致，相对分子质量为43KD。同时，所述毕 赤酵母重组工程菌经过甲醇诱导表达，在诱导24h即可检出PprI蛋白分泌表达的条带。作为优选，在诱导蛋白表达时甲醇终浓度为1%，温度30°C，pH6.0，诱导120h时目的蛋白表达量最高，为0.35mg/ml。以上检测试验结果表明，本发明所提供的DNA分子、毕赤酵母重组质粒以及毕赤酵母重组工程菌能够成功地在毕赤酵母中分泌表达PprI蛋白，也就证明其能够应用于制备毕赤酵母重组质粒、毕赤酵母重组工程菌以及抗辐射损伤药物中。
[0028]由以上技术方案可知，本发明在保持PprI蛋白质氨基酸序列不变的前提下，对耐福射球菌pprl基因序列进行优化改造，编码合成了新的pprl基因，能够成功构建毕赤酵母重组质粒和毕赤酵母重组工程菌，并分泌表达PprI蛋白，为进一步利用酵母发酵系统大量高效制备抗辐射损伤蛋白质药物奠定了坚实的基础。



[0029]图1所示为Overlapping PCR扩增示意图；
[0030]图2所示为毕赤酵母重组质粒构建示意图；
[0031] 图3所示为所述DNA分子琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道A-B为片段1、片段2 ;泳道C-J为片段3 ;泳道K-O为全长P1-pprI基因，箭头所指处为DNA分子量标准条带的大小(bp)；
[0032]图4所示为引入6 XHis标签序列的所述DNA分子琼脂糖凝胶电泳图，其中I为PCR扩增产物，M为Maker ；
[0033]图5所示为大肠杆菌重组子P1-pprI基因的PCR验证琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道A为阴性对照，即不加转化后的大肠杆菌模板；泳道B-L为以转化后的大肠杆菌为模板的PCR产物；泳道N为以P1-pprI的基因为模板的PCR产物(阳性对照)；
[0034]图6所示为大肠杆菌重组子质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道I为PHBM905A质粒(阴性对照)，该质粒的多克隆位点填充片段为1200bp ;泳道2_12为图5中B-L对应的单菌落的质粒；
[0035]图7所示为pHBM-P1-pprl及其Sal I酶切图，其中泳道A为重组质粒pHBM-P1-pprl ;泳道B-D为重组质粒pHBM-P1-pprl经Sal I酶切图；
[0036]图8所示为pHBM-P1-pprl毕赤酵母转化子PCR验证琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道I为pHBM905A质粒为模板的PCR产物(阴性对照);泳道2为重组质粒pHBM-P1-pprl为模板的PCR产物(阳性对照)；泳道3-16为pHBM-P1-pprl毕赤酵母转化子为模板的PCR产物；
[0037]图9所示为pHBM-P1-pprl毕赤酵母转化子PprI蛋白的诱导表达SDS-PAGE图，其中泳道对照为PHBM905A毕赤酵母转化子培养上清液作为阴性对照；泳道1_7为分别诱导1-7天的pHBM-P1-pprl毕赤酵母转化子培养上清液，每个泳道上样量为30ul (相当于24ul培养上清液)；泳道M为Maker ；
[0038]图10所不为pHBM-P1-pprl毕赤酵母转化子Western Blot检测，其中I为第一个阳性毕赤酵母转化子诱导2天的发酵上清；2为第二个阳性毕赤酵母转化子诱导2天的发酵上清；3为第一个阳性毕赤酵母转化子诱导I天的发酵上清；M为Maker，上样量为每泳道16ul发酵上清；
[0039]图11所示为pHBM-P1-pprl毕赤酵母转化子Ultraflex II T0F/T0F质谱仪的肽质量指纹图谱(PMF)。

[0040]本发明公开了一种DNA分子及毕赤酵母重组质粒和高效表达耐辐射球菌PprI蛋白的毕赤酵母重组菌，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的DNA分子、赤酵母重组质粒和毕赤酵母重组菌已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0041]实施例中所用试验材料如下:
[0042]1、菌株与质粒
[0043]大肠杆菌菌株E.coli XL10-G0LD和巴斯德毕赤酵母菌株(Pichia pastoris)GSl 15购自Invitrogen公司，毕赤酵母表达载体pHBM_905A (8923bp)由湖北大学马立新教授惠赠(马立新，赵西选，陈晚苹，李晔星，付玲，姚永兰。一种离体高效构建多拷贝毕赤酵母表达载体的 方法。专利申请号:201210591987.X)，质粒图谱参见图2。
[0044]2、试剂和培养基
[0045]Taq DNA聚合酶、限制性内切酶、T4DNA连接酶等均为大连宝生物工程公司产品。质粒DNA提取试剂盒和DNA片段凝胶回收试剂盒均为杭州爱思进生物技术公司产品。DNA分子量标准购自北京赛百盛公司。蛋白分子量标准购自Bio-Rad公司。酵母基础氮源(YNB)为DIFCO公司产品。鼠源ant1-His tag抗体为SIGMA公司产品。HRP交联的兔抗鼠抗体为Invitrogen公司产品。ECL化学发光试剂盒购自Millipore公司。其他试剂均为国产化学纯或分析纯产品。
[0046]大肠杆菌培养基:LB:1%蛋白胨，0.5%酵母提取物，l%NaCl, pH7.0。
[0047]酵母培养基:YPD平板(每100mL双蒸水溶液含酵母提取物lg、蛋白胨2g、葡萄糖2g、琼脂粉2g)，BMGY (每100mL双蒸水溶液含酵母提取物lg、蛋白胨2g、YNB1.34g、甘油lml), BMMY (每100mL双蒸水溶液含酵母提取物lg、蛋白胨2g、葡萄糖2g、甲醇lml)，购自上海根生生物科技公司。
[0048]下面结合实施例，进一步阐述本发明。
[0049]实施例1:本发明所述DNA分子的优化和合成
[0050]本发明在保持PprI蛋白质氨基酸序列不变的前提下，对耐辐射球菌(Deinococcus radiodurans Rl)pprl 基因(DR_0167,Gene ID: 1798483)开放阅读框(OpenReading Frame, 0RF)序列进行优化改造,编码合成了新的pprl基因一P1-pprI基因，即SEQID NO:1所示核苷酸序列，以期高效表达目的蛋白。
[0051]1、合成方法
[0052]本发明根据人工设计的P1-pprI基因，设计并合成了 SEQ IDNO:2-41所示核苷酸序列的一系列互相重叠(OVERLAP)引物,通过Overlapping PCR合成得到包含SEQ ID NO:1所示核苷酸序列并带有Cpo I限制性内切酶位点和Not I限制性内切酶位点(便于后续重组质粒的构建)的DNA分子。具体方法如下:
[0053]分别用SEQ ID NO: 2_17所述核苷酸序列的引物(p-Ι至p_16，404bp)、SEQ IDNO: 16-29所述核苷酸序列的引物(p-15至p-28，370bp)以及SEQ ID NO: 28-41所述核苷酸序列的引物(p-27至p-40,330bp)进行Overlapping PCR合成得到三个片段,依次为片段
1、片段2和片段3。
[0054]三个片段合成后，以这三个片段为模板，用SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的引物(p-1)和SEQ ID N0:41所示核苷酸序列的引物(p-40)扩增形成整个DNA分子。
[0055]经琼脂糖凝胶电泳检测，所述DNA分子大小与预期一致，琼脂糖凝胶电泳图参见图3。
[0056]其中，OverlappingPCR 方法合成的条件为:98°C 30s, 58°C 30s, 72°C lmin，共 25个循环，最后72°C 7min。反应体系为(50 μ I):
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