专利名称：融合蛋白及其用途、其抗疟疾疫苗和抗体的制作方法由蚊媒传播的疟疾是危及人类生命的最古老的疾病，已有数千年历史，但时至今日仍旧被世界卫生组织(WHO)列为全球最严重的三大传染病之一。据最新统计数据估计，全球约40%的世界人口，处于罹患疟疾的危险之中，而每年有5亿人受到疟原虫感染，约100万人死于恶性疟疾，其中大部分是五岁以下的儿童和孕妇。疟疾不仅对发展中国家人民生命健康造成严重危害，而且还严重阻碍了这些国家的社会经济发展。近几年来由于抗药性疟原虫虫株及抗杀虫剂蚊媒的产生及蔓延，传统防治疟疾的方法受到新的挑战，因此研制一种有效的疟疾疫苗是疟疾防治的重要替代途径，也是实现WHO提出的2010年疟疾发病率和死亡率下降50%的目标的主要手段。生活在频繁传播疫区的居民天然条件下能获得临床免疫力，这种免疫力不仅能抵抗临床症状而且能对抗重症疟疾，另外也可能转为带虫免疫状态；用减毒子孢子或一些重组蛋白质疫苗(如红细胞前期(红前期)的RTS，S)免疫哺乳动物、灵长类以及人类，也能诱导部分或全部抗虫免疫；这些观察都为恶性疟疾疫苗研发的可行性提供了有利的证据。 但是疟原虫的生活周期复杂，包括蚊体内繁殖期、红细胞前期、红细胞内期，各期均可表达大量不同抗原。因此，尽管目前已鉴定出约50个分别针对疟原虫不同的生活时期的抗原，有些作为疫苗已经进入不同阶段的临床试验，但迄今为止还未有可用的疟疾疫苗。其原因包括:人们对疟疾免疫保护的机制研究不够深入，无法为疫苗的研制提供充分理论依据；仍缺乏具有显著保护作用的候选抗原；缺乏有效的动物模型；疟原虫抗原本身存在多态性、多变性和虫株特异性等特点，使得现有候选疫苗保护人群的范围可能非常有限等。再加上疟疾疫苗的研制投入大(每个候选疫苗平均投入5亿美元)，周期长(10-12年)等因素，都可能延缓有效疫苗的出现。疟疾疫苗的研制按照保护人群的不同可分为不同类型:保护非疫区健康人不受感染的红细胞前期疫苗；保护疫区人群尤其是儿童抵抗感染、降低病死率的红内期疫苗；以及蚊媒传播阻断型疫苗。红细胞内期是恶性疟原虫致病和发病的唯一阶段，因此研制红内期疫苗就对降低病死率，减少并发症具有重大的现实意义。但到目前为止，所有单期单价疫苗的免疫效果都不理想。目前所公知的是，针对疟原虫具有抗原阶段性、高变异性、差异性和多态性的特点，选取针对恶性疟疾不同生活时期、诱导产生多种免疫反应类型的不同抗原或表位，构建亚单位疫苗或多表位疫苗，是解决上述技术问题的一种有效手段，这也已经成为疟疾疫苗研究的热点。对于红内期多表位疫苗的研制而言，最为理想的红内期疟疾疫苗应该能够模拟疫区人群所形成的天然免疫。通过选用来自多抗原的多个表位所产生的协同作用，激发免疫系统产生对疟原虫的免疫力，经降低虫载量达到降低病死率的效果。而在实际研究中，多个表位相互连接的组合顺序存在巨大的多样性，通过手工操作的办法难以获得具有最佳连接顺序的人工多表位抗原。在中国专利申请N0.200410080982.6中，公开了一种人工随机组合抗原——多表位人工抗原ES312 (本文中以M.RCAg-l/Exp.V-3表示)，其具有323个氨基酸，相对分子量为约65kDa。其针对参与抗疟原虫红内期感染的免疫类型，借鉴分子育种技术的随机重组原理，利用表位改组技术构建了多表位基因库，并用库免疫血清筛选出免疫原性最佳、稳定性最好的人工随机组合抗原一M.RCAg-1。初步研究证实，免疫近交系小鼠、新西兰白兔和恒河猴后可诱导产生很高的抗体水平，并诱发显著的⑶4+T细胞反应。在这个随机组合抗原中所包含的所有表位都能诱导产生很强的特异性抗体反应。在对来自中国海南、巴西和喀麦隆的恶性疟患者血清进行的检测中，血清抗体识别重组蛋白M.RCAg-1的阳性率与正常组有极显著性差异(P <0.001)，且血清抗体滴度与被检测者的年龄呈正相关。综上所述，M.RCAg-1蛋白质疫苗是一个极具潜力的候选疫苗，具有较好的开发前景。因此，对M.RCAg-1抗原进行进一步地优化重建，以提高蛋白的稳定性和针对恶性疟原虫的活性，则显得尤为重要。
为解决上述现有技术中存在的问题，本发明提供了一种其抑制疟原虫的活性得到显著提高的融合蛋白。具体而言，本发明提供:(I) 一种融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列从N端到C端依次含有SEQ IDN0.:7所示的氨基酸序列和SEQ ID N0.:5所示的氨基酸序列。 (2)根据(I)所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID N0.:I所示的氨基酸序列。(3) 一种用于编码根据⑴或(2)所述的融合蛋白的DNA。(4)根据(3)所述的DNA，其中，所述DNA的核苷酸序列为SEQ ID N0.:2所示的核苷酸序列。(5)根据(I)或(2)所述的融合蛋白在制备用于预防和/或治疗疟疾的药物中的用途。(6)根据(5)所述的用途，其中，所述的药物为抗疟疾疫苗。(7)根据(6)所述的用途，其中，所述的抗疟疾疫苗为抗红内期疟疾疫苗。(8) 一种抗疟疾疫苗，该抗疟疾疫苗含有⑴或⑵所述的融合蛋白。(9)根据(8)所述的抗疟疾疫苗，其中，所述抗疟疾疫苗还含有佐剂，所述佐剂为选自油包水型佐剂MontnidelSA720、MontnidelSA51、弗氏佐剂或氢氧化铝佐剂中的一种或几种。(10)根据⑶所述的抗疟疾疫苗，其中，所述融合蛋白的含量为10 100μ g/ml。(11)根据(9)所述的抗疟疾疫苗，其中，所述佐剂的含量为10 100 μ g/ml。(12)根据⑶所述的抗疟疾疫苗，其中，所述的抗疟疾疫苗为抗红内期疟疾疫苗。(13) 一种抗体或杂交瘤细胞或抗血清,所述的抗体或杂交瘤细胞或抗血清是以根据(I)或(2)所述的融合蛋白或根据(8)-(12)中任一项所述的疫苗为免疫原而制备得到的。(14)根据(13)所述的抗体或杂交瘤细胞或抗血清在制备用于预防和/或治疗疟疾的免疫制剂中的用途。本发明的融合蛋白及疫苗与现有技术相比具有以下优点和积极效果:本发明的融合蛋白(如重组蛋白M.RCAg-l/Exp.V_l)具有较强的免疫原性，理化性质稳定，能激发可持续、高滴度特异性抗体，小鼠免疫血清能识别恶性疟原虫天然抗原，能诱发显著的T细胞应答，并能较好抑制疟原虫体外生长，是极具潜力的候选疫苗，具有较好的开发前景。本发明的融合蛋白(如重组蛋白M.RCAg-l/Exp.V-1)与M.RCAg-l/Exp.V_2、M.RCAg-l/Exp.V-3两种多表位蛋白在动物模型体内的免疫原性相似(p > 0.05)，但蛋白免疫小鼠后却诱导了不同类型的T细胞反应。此外，上述三种蛋白的免疫血清IgG体外生长抑制率分别为93.9%，14.7%，54.3%，从上述结果可以看出，相对于M.RCAg-l/Exp.V_3，M.RCAg-l/Exp.V-1的体外抑虫活性得以大幅提高，即评价恶性疟疾红细胞内期疫苗有效性的标准-免疫兔血清抗体对体外培养的恶性疟原虫的生长抑制 (GIA)率，在目前没有疫苗体内评价模型的情况下，体外保护力实验就具有更为重要的意义。而利用生物信息学和色谱技术分析，可以发现从不同表达载体制备的重组蛋白在二级和三级结构上出现极大差异。


图1 为 M.RCAg-l/Exp.V_l、M.RCAg-l/Exp.V-2 和 M.RCAg-l/Exp.V-3 三种多表位蛋白的氨基酸序列比较示意图；图 2 为 M.RCAg-l/Exp.V_l、M.RCAg-l/Exp.V-2 和 M.RCAg-l/Exp.V-3 三种多表位蛋白的SDS-PAGE电泳图；其中M代表低分子量蛋白Marker ;1、2、3分别代表Μ.RCAg-1/Exp.V-U Μ.RCAg-l/Exp.V-2 和 M.RCAg-l/Exp.V-3 ；图3为圆二色谱法检测三种蛋白的光谱图；图 4 为 M.RCAg-1/Exp.V-1 (图 4A)、M.RCAg-l/Exp.V-2 (图4B)和M.RCAg-l/Exp.V-3 (图4C)三种多表位蛋白的结构预测模型图；图 5 为 M.RCAg-l/Exp.V_l、M.RCAg-l/Exp.V-2 和 M.RCAg-l/Exp.V-3 三种多表位蛋白的兔免疫血清对天然疟原虫蛋白的识别结果图；其中，左上为阴性对照；右下、左下、右上分别代表 M.RCAg-l/Exp.V-1、M.RCAg-l/Exp.V-2 和 M.RCAg-l/Exp.V-3 ；图6为ELISP0T检测小鼠脾淋巴细胞中IFN- Y和IL_4分泌细胞克隆数的图；图7为pDS-ex载体质粒的示意图。

的描述并参照附图对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
虽然目前对于某些传染性疾病多表位疫苗的研发已经取得了一定的进展，但影响多表位蛋白免疫效能的因素较多，如不同表位的个体特性，多表位间的排列方式或连接方式，乃至于表位间的侧翼序列等因素，而也包括稳定多表位蛋白结构的设计及构建时载体的选择等因素，这些都属于多表位蛋白肽链内因素，也即如何连接表位才能尽可能诱导出所连接表位最优的免疫反应，但多表位蛋白构建时肽链外因素对多表位蛋白有效性的影响却鲜有报道，其中多表位蛋白的融合表达对其免疫有效性的影响更是尚不明确。从理论上看，通过选择重要抗原的具有保护性和保守性的表位进行组合，有可能获得针对具有复杂抗原性病原体的高覆盖率。但在重组抗原分子中不同表位结构对蛋白免疫原性的影响是不同的，各表位间的相对位置，构象特征(可及性、柔性、二级结构等)及表位侧翼顺序等都与表位的功能都密切相关，而理想的疫苗分子应该包括一组合理组合与搭配的表位。本发明人通过表位改组的随机重组和菌落表达的免疫化学筛选方法，成功地获得了具有较高免疫原性和免疫反应多样性的多表位疫苗，已初步证实其中所有单个表位都能被递呈，多表位蛋白能够 在动物体内诱导出较强的细胞免疫和体液免疫反应。本发明是在对多表位疫苗蛋白M.RCAg-1高效表达载体的改造实验中偶然发现的。本发明人对M.RCAg-1重组蛋白进行优化重建，以获得高表达量的工程菌，并分析了不同的载体肽融合表达对多表位蛋白M.RCAg-1结构及免疫活性的影响，在研究中发现了部分载体系统对重组蛋白免疫有效性的影响，而且肽段可增强多表位疫苗M.RCAg-1的体外抑虫活性，体外免疫保护性有显著差异，与直接表达为不带载体融合肽的M.RCAg-1/Exp.V-3重组蛋白诱导产生的特异性抗体的50%左右的抑虫率相比，带有肠激酶(Enterokinase)酶切识别位点N端融合肽的M.RCAg-l/Exp.V-1蛋白能够几乎完全抑制疟原虫的生长，而带有前切割蛋白酶(PreScission protease)酶切识别位点的N端融合肽M.RCAg-l/Exp.V-2蛋白，其特异性抗体对疟原虫生长的抑制率却降低到15%左右。本发明为成功构建新一代多表位疟疾疫苗提供了有力的理论和实验依据。本发明的一个方面提供了一种融合蛋白，其中，所述融合蛋白的氨基酸序列从N端到C端依次含有SEQ ID N0.:7所示的氨基酸序列(其DNA序列如SEQ ID N0.:8所示)和SEQ ID N0.:5所示的氨基酸序列。优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID N0.:I所示的氨基酸序列。所述融合蛋白具有366个氨基酸，相对分子量为约70kDa。本发明的另一个方面提供了一种分离的用于编码所述的融合蛋白的DNA。优选地，所述DNA的核苷酸序列为SEQ ID N0.:2所示的核苷酸序列。本发明的另一个方面提供了所述的融合蛋白在制备用于预防和/或治疗疟疾的药物中的用途。优选地，所述的药物为疫苗。更优选的是，所述疫苗为红内期疟疾疫苗。本发明的另一个方面提供了一种抗疟疾疫苗，所述疫苗包含所述的融合蛋白。本发明的疫苗可含有佐剂，也可以不含有佐剂。本领域技术人员可以根据需要确定所述融合蛋白在本发明的疫苗中的含量。优选地，所述融合蛋白的含量为10 100 μ g/ml。优选地，本发明的疫苗中含有佐剂。佐剂可以为本领域公知的常用的佐剂，例如:油包水型佐剂MontnidelSA720、MontnidelSA51、弗氏佐剂或氢氧化铝佐剂中的一种或几种。更优选地，所述佐剂为MontnidelSA51。本领域技术人员可以根据需要确定佐剂在本发明的疫苗中的含量。优选地，所述佐剂的含量为10 100 μ g/ml。 优选地，每剂疫苗为0.1 Iml ;更优选地，每剂疫苗为0.2 0.4ml。 本发明的疫苗可以通过肌肉注射、皮下注射或腹腔注射的方式来施用。本发明的另一个方面提供了一种抗体或杂交瘤细胞或抗血清，所述的抗体或杂交瘤细胞或抗血清是以所述的融合蛋白或所述的疫苗为免疫原而制备得到的。可以根据本领域常用的方法，来制备抗体或杂交瘤细胞或抗血清。单克隆抗体是由淋巴细胞杂交瘤产生的、只针对复合抗原分子上某一单个抗原决定簇的特异性抗体。淋巴细胞杂交瘤是用人工方法使骨髓瘤细胞(纯系小鼠的腹水瘤型浆细胞)与已用抗原致敏并能分泌某种抗体的淋巴细胞(常用致敏动物的脾细胞，起作用的是其中的B细胞)融合而成的。用来使上述淋巴细胞致敏的抗原有人和动物的T细胞、B细胞、红细胞、肿瘤细胞、各种微生物或其他抗原物质等。用适当方法把杂交瘤细胞分离出来，进行单个细胞培养，使之大量繁殖，则在该培养液中增殖而形成的细胞克隆，只产生完全均一的、单一特异性的抗体，即单克隆抗体。本发明的另一个方面提供了所述的抗体或杂交瘤细胞或抗血清在制备用于预防和/或治疗疟疾的免疫制剂中的用途。本发明中的免疫制剂为人工主动或被动免疫制剂，人工主动免疫制剂是指用于预防接种的生物制品，接种后可使机体获得免疫力，可能为亚单位疫苗，基因工程疫苗以及DNA疫苗，人工被动免疫制剂是含有特异性抗体的免疫制剂，接种于人体后，可立即获得免疫力。根据本发明的一种实施方案，将M.RCAg-1基因克隆到含有不同载体标签或不含有载体标签的原核表达载体PDS-ex上，表达纯化得到M.RCAg-l/Exp.V_1、M.RCAg-1/Exp.V-2、M.RCAg-l/Exp.V-3三种多表位蛋白，其氨基酸序列分别如SEQ ID N0.:USEQ ID N0.:3 以及 SEQ ID N0.:5 所示；其 DNA 序列分别为 SEQ ID N0.:2、SEQ ID N0.:4 以及 SEQ IDN0.:6所示。图1 显示了 M.RCAg-l/Exp.V-1, M.RCAg-l/Exp.V-2 和 M.RCAg-l/Exp.V-3 三种多表位蛋白的氨基酸序列比较示意图，其中M.RCAg-l/Exp.V-1是在N端融合有带有肠激酶酶切识别位点的43个载体氨基酸的多表位蛋白，M.RCAg-l/Exp.V-2是在N端融合有带有前切割蛋白酶(PreScission Protease)酶切识别位点的43个载体氨基酸的多表位蛋白，M.RCAg-l/Exp.V-3是没有融合载体氨基酸的多表位蛋白。从图中可看出M.RCAg-1/Exp.V-1与M.RCAg-l/Exp.V-2这两种蛋白总的氨基酸数目相同，但M.RCAg-1蛋白基因序列N端融合有43个氨基酸的载体肽段中具有不同的蛋白酶酶切识别位点，所以两者有8个氨基酸种类的差别，而M.RCAg-l/Exp.V-3蛋白不带有任何融合肽段，与前二者有43个氨基酸数量的差别。当同一基因序列与不同的肽段融合表达后，其制备的重组蛋白诱导产生的免疫原性并无显著差异(P > 0.05)，但体外免疫保护性却有显著差异。M.RCAg-l/Exp.V-1与M.RCAg-l/Exp.V-2这两种蛋白总的氨基酸数目相同，因为目的序列之前具有不同的蛋白酶酶切位点，所以两者有8个氨基酸种类的差别，通过两者二级结构含量的比较，本发明人发现二者的二级结构差别迥异，而且蛋白免疫小鼠后诱导了不同类型的CD4+T细胞反应，M.RCAg-l/Exp.V-2诱导出以IL-4为主的Th2型细胞免疫反应，但M.RCAg-l/Exp.V-1却是诱发了以IFN- Y为主的Thl型细胞 免疫反应。研究表明Thl型CD4+T细胞免疫在抵抗疟疾时具有重要的免疫保护作用，M.RCAg-l/Exp.V-1蛋白免疫机体后产生以Thl为主的细胞反应类型，辅以适中的Th2反应类型，这种细胞免疫反应模式有利于抵抗红内期疟原虫的攻击，蛋白免疫机体后产生以Th2为主的细胞反应类型，这种细胞反应将更有利于抗体水平的提高，但降低的IFN-Y水平却直接导致了蛋白免疫血清抑虫效果的下降，这一点在体外GIA试验中得以证实。这表明，多表位蛋白分子的构象会受到某些特定氨基酸序列的影响，也即某些特定氨基酸影响了整个肽链的折叠。从以上结果可知，目的序列克隆入pDS-ex表达载体后，43个氨基酸的载体序列在多表位蛋白表达时，影响了蛋白分子的折叠，这一结果提示:M.RCAg-1构建在不同的表达载体后，由于载体肽段或其中某些特殊氨基酸的影响，表达蛋白二级结构发生改变，影响了其折叠和构象，进而影响了蛋白的免疫效能，而这种影响有可能是正面的也可能是负面的。有研究表明具有相似的长度和氨基酸的序列在改变部分氨基酸后可折叠为不同的蛋白结构，而这一现象在其它蛋白的研究中也被多次证实。本发明的实验结果已经显示出，多表位蛋白的免疫原性与免疫保护性不仅与多表位间的组合排列方式有关，且受组装后肽链外融合肽段的影响，可能增强或抑制多表位蛋白的生物活性，构建多表位蛋白时，应该充分地考虑到影响蛋白折叠的因素，才能达到预期的目的。以下通过例子的方式进一步解释或说明本发明内容，但这些例子不应被理解为对本发明保护范围的限制。以下实施例及试验例中所用的EcoR 1、Bgl I1、Nde 1、碱性磷酸酶、T4DNA连接酶可购自TAKARA公司；大肠杆菌BL21(DE3)可购自N0VEGEN公司；油包水型佐剂MontnidelSA720、MontnidelSA51可购自法国SEPPIC公司；弗氏佐剂可购自sigma公司；BAL B/c小鼠、新西兰大白兔可购自北京天坛生物股份有限公司；羊血清、HRP标记的羊抗鼠IgG抗体可购自北京中杉金桥生物技术有限公司；恶性疟原虫3D7株可购自美国TheMalaria Research and Reference Reagent Resource Center ;FITC 标记的羊抗兔 IgG 可购自BD公司；EZ-S印TM Mouse IX淋巴细胞分离液、RPM1-1640培养基、IFN-Y ELISP0T和IL-4 ELISP0T培养板可购自广州达科为生物技术有限公司；PHA刺激剂可购自广州达科为生物技术有限公司；小量质 粒抽提试剂盒可购自QIAGEN公司；E.coli BL21(DE3)可购自MERK公司；IPTG可购自invitorgen公司；正常人血细胞可购自北京红十字血液中心；DNA片段回收试剂盒可购自QIAGEN公司。SOC培养基可购自Amresco公司；RP_C培养液可购自美国ScienCell公司；Giemsa染液可购自德国AppliChem公司。以下实施例及试验例中所用的BCA法测定多表位蛋白的浓度，使用的是TheThermo Scientific Pierce BCA Protein Assay Reagent试剂盒,购自 Thermo ScientificPierce 公司。实施例1构建VR1012-312质粒和pDS-ex质粒按照中国专利申请N0.200410080982.6中公开的方法，构建VR1012-312质粒和pDS-ex质粒。具体如下:按照中国专利申请N0.200410080982.6中公开的方法获得基因片段m.rcag-Ι (即中国专利申请N0.200410080982.6中公开的ES312基因片段)，并将所得的基因片段m.rcag-Ι连接在pDS-ex质粒上(按照中国专利申请N0.200410080982.6中公开的方法，将原核表达载体pET-30a(+)(得自Novagen公司)利用PCR技术将Not I和Eag I酶切位点替换为Bgl II，前移Kpn I，并去除EcoRV、Bgl I1、Nsp V酶切位点，从而得到pDS-ex质粒)，其DNA序列如SEQ ID N0.: 10所示，其物理图谱为图7所示。实施例2 获得 M.RCAg-l/Exp.V-1 蛋白1.将实施例1得到的VR1012-312质粒和pDS-ex质粒分别进行EcoR I和BglII双酶切，从而使m.rcag-Ι连接入pDS_ex载体,从而构建得到重组质粒M.RCAg-1/pDS-ex。具体步骤如下所示:1)VR1012-312质粒和pDS-ex质粒的限制性内切酶酶切体系(以EcoR I和Bgl II为例)如下所示:



本发明提供了一种融合蛋白的用途、其抗疟疾疫苗和抗体。本发明的融合蛋白的氨基酸序列从N端到C端依次含有SEQ ID No.7所示的氨基酸序列和SEQ ID No.5所示的氨基酸序列。本发明的融合蛋白及疫苗具有以下优点和积极效果重组蛋白具有较强的免疫原性，理化性质稳定，能激发可持续、高滴度特异性抗体，小鼠免疫血清能识别恶性疟原虫天然抗原，能诱发显著的T细胞应答，并能较好抑制恶性疟原虫体外生长，是极具潜力的候选疫苗，具有较好的开发前景。