四价cd47-抗体恒定区融合蛋白用于治疗制作方法_T·胡贝尔专利（四价,cd,恒定）-早鸽网

四价cd47-抗体恒定区融合蛋白用于治疗制作方法

专利名称

四价cd47-抗体恒定区融合蛋白用于治疗制作方法
发明者

T·胡贝尔, F·科尔宾格, M·萨尔法蒂, K·韦尔岑巴赫
公开日

2013年2月20日
申请日期

2010年12月21日
优先权日

2009年12月22日
申请人

诺瓦提斯公司
文档编号

A61P11/06GK102939303SQ201080064426
关键字

四价 cd 恒定抗体蛋白融合
权利要求

1.一种可溶性蛋白，包含至少两个异源二聚体的复合物，其中每个异源二聚体基本上由以下组成(i)第一单价单链多肽，其包含与抗体的重链恒定区融合的哺乳动物结合分子的区域；和( )第二单价单链多肽，其包含与抗体的轻链恒定区融合的相同结合分子的区域2.一种可溶性蛋白，包含至少两个异源二聚体的复合物，其中每个异源二聚体基本上由以下组成(i)第一单价单链多肽，其包含与抗体的ChI恒定重链区融合的哺乳动物结合分子的区域；和( )第二单价单链多肽，其包含与抗体的Q恒定轻链区融合的相同结合分子的区域3.根据权利要求I或权利要求2所述的可溶性蛋白，其中所述哺乳动物结合分子的所述区域是相同的4.根据权利要求I至3中任一项所述的可溶性蛋白，其中所述哺乳动物结合分子是蛋白质、细胞因子、生长因子、激素、信号传导蛋白、炎性介质、低分子量化合物、配体、细胞表面受体或其片段5.根据权利要求4所述的可溶性蛋白，其中所述哺乳动物结合分子是单体的或同聚的细胞表面受体的胞外结构域6.根据权利要求5所述的可溶性蛋白，其中所述哺乳动物单体的或同聚的细胞表面受体包含IgSF结构域7.根据权利要求5或权利要求6所述的可溶性蛋白，其中哺乳动物单体的细胞表面受体的所述胞外结构域是CD47的胞外结构域8.一种可溶性蛋白，包含两个异源二聚体的复合物，其中每个异源二聚体基本上由以下组成(i)第一单价单链多肽，其包含在抗体的ChI恒定重链区的N端部分处融合的第一 SIRPa结合结构域，和( )第二单价单链多肽，其包含在抗体的Q恒定轻链区的N端部分处融合的第二 SIRPa结合结构域9.一种可溶性蛋白，包含两个异源二聚体的复合物，其中每个异源二聚体基本上由以下组成(i)第一单价单链多肽，其包含与抗体的重链恒定区融合的第一 SIRP a结合结构域;和( )第二单价单链多肽，其包含与抗体的轻链恒定区融合的第二 SIRP a结合结构域10.根据权利要求I至9中任一项所述的可溶性蛋白，其中所述第一和第二单价单链多肽分别与ChI恒定重链和Q恒定轻链的N端部分融合11.根据权利要求8至10中任一项所述的可溶性蛋白，其中所述第一和第二SIRPa结合结构域在彼此之间共有至少60、70、80、90、95、96、97、98或99%序列同一性12.根据权利要求7至11中任一项所述的可溶性蛋白，其以4μΜ或更小的KD与人 SIRPa结合，如BiaCORE测定法中所测量13.根据权利要求8至12中任一项所述的可溶性蛋白，其促进SIRPa+白细胞以2nM或更小EC5tl的黏附，如基于板的细胞黏附测定法中所测量14.根据权利要求8至13中任一项所述的可溶性蛋白，其抑制体外产生的单核细胞衍生性树状细胞的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) Cowan菌株粒子刺激的促炎细胞因子释放15.根据权利要求14所述的可溶性蛋白，其以O.2nM或更小的IC5tl抑制体外产生的单核细胞衍生性树状细胞中金黄色葡萄球菌Cowan菌株粒子刺激的促炎细胞因子释放，如树状细胞细胞因子释放测定法中所测量16.根据权利要求I至15中任一项所述的可溶性蛋白，其中每个异源二聚体的所述第一和第二单链多肽由二硫键共价地连接17.根据权利要求8至16中任一项所述的可溶性蛋白，其中每个异源二聚体具有在肽接头不存在下与相应恒定区融合的其第一和第二 SIRPa结合结构域18.根据权利要求8至16中任一项所述的可溶性蛋白，其中每个异源二聚体具有经肽接头与相应恒定区融合的其第一和第二 SIRPa结合结构域19.根据权利要求18所述的可溶性蛋白，其中所述肽接头由5-20个氨基酸组成20.根据权利要求18或权利要求19所述的可溶性蛋白，其中所述肽接头是甘氨酸和丝氨酸氨基酸的聚合物、优选地是(GGGGS)n，其中η是I和4之间的任何整数，优选地是221.根据权利要求I至20中任一项所述的可溶性蛋白，其基本上由两个异源二聚体组成，其中每个异源二聚体的所述第一单链多肽包含免疫球蛋白恒定部分的铰链区，并且所述至少两个异源二聚体是彼此通过所述铰链区处的二硫键稳定缔合的22.根据权利要求9至21中任一项所述的可溶性蛋白，其中抗体的C0I区、Ch2区和CH3 区衍生自人IgGl、gG2、或IgG4相应区域的沉默突变体，所述沉默突变体具有降低的ADCC效应子功能23.根据权利要求8至22中任一项所述的可溶性蛋白，其中至少一个SIRPa结合结构域选自(i)人CD47的胞外结构域；(ii)SEQID NO 4的多肽或保留SIRPa结合特性的SEQ ID NO 4的片段；和(iii)SEQID NO 4 的变体多肽，其与 SEQ ID NO 4 具有至少 60、70、80、90、95、96、97、 98或99%序列同一性并保留SIRP a结合特性24.根据权利要求8至23中任一项所述的可溶性蛋白，其中全部SIRPa结合结构域具有相同的氨基酸序列25.根据权利要求24所述的可溶性蛋白，其中SIRPa结合结构域的所述相同氨基酸序列选自 SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 21 和 SEQ ID NO 2326.一种包含两个异源二聚体的可溶性蛋白，其中所述异源二聚体包含(i)SEQ ID NO 5的第一单链多肽和SEQ ID NO 6的第二单链多肽；(ii)SEQID NO 18的第一单链多肽和SEQ ID NO 6的第二单链多肽；(iii)SEQID NO 19的第一单链多肽和SEQ ID NO 20的第二单链多肽；(iv)SEQ ID NO 12的第一单链多肽和SEQ ID NO 13的第二单链多肽；(V)SEQ ID NO 24的第一单链多肽和SEQ ID NO 25的第二单链多肽；(vi)SEQ ID NO 36的第一单链多肽和SEQ ID NO 37的第二单链多肽；(vii)SEQID NO 38的第一单链多肽和SEQ ID NO 39的第二单链多肽；(viii)SEQID NO 40的第一单链多肽和SEQ ID NO 41的第二单链多肽；(ix)SEQID NO 42的第一单链多肽和SEQ ID NO 43的第二单链多肽；(x)SEQID NO 44的第一单链多肽和SEQ ID NO 45的第二单链多肽；(xi)SEQID NO 46的第一单链多肽和SEQ ID NO 47的第二单链多肽；(xii)SEQID NO 48的第一单链多肽和SEQ ID NO 49的第二单链多肽；(xiii)SEQID NO 50的第一单链多肽和SEQ ID NO 51的第二单链多肽；(xiv)SEQID NO 52的第一单链多肽和SEQ ID NO 53的第二单链多肽；(Xv)SEQ ID NO 54的第一单链多肽和SEQ ID NO 55的第二单链多肽；(xvi)SEQID NO 56的第一单链多肽和SEQ ID NO 57的第二单链多肽；(xvii)SEQID NO 58的第一单链多肽和SEQ ID NO 20的第二单链多肽；或(xviii)SEQID NO 29的第一单链多肽和SEQ ID NO 20的第二单链多肽27.根据权利要求9至25中任一项所述的可溶性蛋白，包含与根据权利要求26所述的可溶性蛋白的相应第一和第二单链多肽具有至少60、70、80、90、95、96、97、98或99%序列同一性的所述第一单链和第二单链多肽序列28.根据权利要求9至25中任一项所述的可溶性蛋白，包含与根据权利要求26所述的可溶性蛋白的相应第一和第二单链多肽具有至少60、70、80、90、95、96、97、98或99%序列同一性的SIRPa结合结构域序列29.根据权利要求I至28中任一项所述的可溶性蛋白，包含(i)由SEQ ID NO 10的核苷酸序列编码的重链；和由SEQ ID NO 11的核苷酸序列编码的轻链，( )由SEQ ID NO 59的核苷酸序列编码的重链；和由SEQ ID NO 60的核苷酸序列编码的轻链，(iii)由SEQID NO 61的核苷酸序列编码的重链；和由SEQ ID NO 62的核苷酸序列编码的轻链，(iv)由SEQID NO 63的核苷酸序列编码的重链；和由选自SEQ IDNO 64的核苷酸序列编码的轻链，(V)由SEQ ID NO 65的核苷酸序列编码的重链；和由SEQ ID NO 66的核苷酸序列编码的轻链，(vi)由SEQID NO 67的核苷酸序列编码的重链；和由SEQ ID NO 68的核苷酸序列编码的轻链，(vii)由SEQID NO 69的核苷酸序列编码的重链；和由SEQ ID NO 70的核苷酸序列编码的轻链，(viii)由SEQID NO 71的核苷酸序列编码的重链；和由SEQ ID NO 72的核苷酸序列编码的轻链，(ix)由SEQID NO 73的核苷酸序列编码的重链；和由SEQ ID NO 74的核苷酸序列编码的轻链，(X)由SEQ ID NO 75的核苷酸序列编码的重链；和由SEQ ID NO 76的核苷酸序列编码的轻链，(xi)由SEQID NO 77的核苷酸序列编码的重链；和由SEQ ID NO 78的核苷酸序列编码的轻链，(xii)由SEQID NO 79的核苷酸序列编码的重链；和由SEQ ID NO 80的核苷酸序列编码的轻链，(xiii)由SEQID NO 81的核苷酸序列编码的重链；和由SEQ ID NO 82的核苷酸序列编码的轻链，(xiv)由SEQID NO 83的核苷酸序列编码的重链；和由SEQ ID NO 84的核苷酸序列编码的轻链，(XV)由SEQ ID NO 85的核苷酸序列编码的重链；和由SEQ ID NO 86的核苷酸序列编码的轻链，(xvi)由SEQID NO 87的核苷酸序列编码的重链；和由SEQ ID NO 60的核苷酸序列编码的轻链，或(xvii)由SEQID NO 88的核苷酸序列编码的重链；和由SEQ ID NO 60的核苷酸序列编码的轻链30.根据权利要求I至29中任一项所述的可溶性蛋白，用作药物或诊断工具31.根据权利要求30所述的可溶性蛋白，用于自身免疫病、急性和慢性炎性疾病的治疗或诊断32.根据权利要求31所述的可溶性蛋白，用于治疗选自Th2介导的气道炎症、过敏性疾病、哮喘、炎性肠病和关节炎的疾病33.根据权利要求30所述的可溶性蛋白，用于局部缺血性疾病、白血病或其他癌症的治疗34.根据权利要求30所述的可溶性蛋白，用于在有需求的受试者中增加造血干细胞植入35.一种药物组合物，包含与一种或多种可药用载体组合的根据权利要求1-29中任一项所述的可溶性蛋白36.根据权利要求35所述的药物组合物，额外地包含至少一种其他有效成分37.一种分离的核酸，其编码根据权利要求1-29中任一项所述的可溶性蛋白的一个异源二聚体的至少一条单链多肽38.一种克隆载体或表达载体，其包含选自以下的至少一个核酸SEQID N010 ；SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 59、SEQ ID NO 60、SEQ ID NO 61、SEQ ID NO 62、SEQ ID NO 63、SEQ ID NO 64、SEQ ID NO 65、SEQ ID NO 66、SEQ ID NO 67、SEQ ID NO 68、SEQ ID NO 69、 SEQID NO 70、SEQ ID NO 71、SEQ ID NO 72、SEQ ID NO 73、SEQ ID NO 74、SEQ ID NO 75、SEQ ID NO 76、SEQ ID NO 77、SEQ ID NO 78、SEQ ID NO 79、SEQ ID NO 80、SEQ ID NO 8USEQ ID NO 82、SEQID NO 83、SEQ ID NO 84、SEQ ID NO 85、SEQ ID NO 86、SEQ ID NO 87、和 SEQ ID NO 8839.一种适用于产生根据权利要求1-29中任一项所述的可溶性蛋白的重组宿主细胞，包含编码所述蛋白质的所述异源二聚体的所述第一和第二单链多肽和任选地分泌信号的核酸40.根据权利要求39所述的重组宿主细胞，包含稳定整合于基因组中的SEQID NO`10 ；SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 59、SEQ ID NO 60、SEQ ID NO 61、SEQ ID NO 62、SEQ ID NO 63,SEQ ID NO 64、SEQID NO 65、SEQ ID NO 66、SEQ ID NO 67、SEQ ID NO 68、SEQ ID NO 69、SEQ ID NO 70、SEQ ID NO 71、SEQ ID NO 72、SEQ ID NO 73、SEQ ID NO 74、SEQ ID NO 75,SEQ ID NO 76、SEQ ID NO 77、SEQID NO 78、SEQ ID NO 79、SEQ ID NO 80、SEQ ID NO 81、SEQ ID NO 82、SEQ ID NO 83、SEQ ID NO 84、SEQ ID NO 85、SEQ ID NO 86、 SEQ ID NO 87、和 SEQ ID NO 88 的核酸41.根据权利要求39或权利要求40所述的重组宿主细胞，其中所述宿主是哺乳动物细胞系42.一种用于产生根据权利要求I至29中任一项所述的可溶性蛋白的方法，包括在产生所述可溶性蛋白的适宜条件下培养根据权利要求39至41中任一项所述的宿主细胞和分离所述蛋白质

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专利名称：四价cd47-抗体恒定区融合蛋白用于治疗的制作方法四价CD47-抗体恒定区融合蛋白用于治疗本发明涉及用作药物的、特别地用于预防或治疗自身免疫病和炎性疾病(例如过敏性哮喘和炎性肠病)的可溶性SIRPa结合蛋白。本发明更具体地涉及包含至少两个双价异源二聚体的复合物的可溶性SIRPa结合蛋白，其中每个异源二聚体基本上由以下组成(i)第一单价单链多肽，其包含与抗体的重链恒定区的N端部分融合的第一 SIRPa结合结构域；和(ii)第二单价单链多肽，其包含与抗体的轻链恒定区的N端部分融合的第二 SIRPa结合结构域。本发明的一个具体实施方案进一步由图I显示。SIRPa (⑶172a)是由包括巨噬细胞、粒细胞和常规树状细胞(DC)的髓系细胞表达以及在神经元细胞上的免疫受体(van den Berg等人，2008, Trends in Immunol., 29(5) 203-6)。SIRPa 是 CD47 的低亲和力配体(Rebres 等人，2001, J. Biol. Chem.； 276(37) :34607-16 ;Hatherley 等人，2007 J. Biol. Chem. ；282(19) 14567-75 ；Hatherley 等人，2008 ；Mol.Cell ;31 (2) 266-77)，并且SIRP α与CD47的相互作用组成了基于黏附和双向信号传导控制的细胞通讯体系，所述细胞通讯体系调节免疫系统和神经元系统中的多种细胞功能。这些功能包括移行、细胞成熟、巨噬细胞吞噬作用和髓样树状细胞的细胞因子产生(van den Berg 等人，2008 Trends in Immunol. 29 (5) 203-6 ；Sarfati 2009, Curr. Drug. Targets,9(10) 852-50)。来自动物模型的数据表明SIRP α/⑶47相互作用可以有助于或甚至控制几种病症的发病机理，所述病症包括自身免疫病、炎性疾病(Okuzawa等人，2008，BBRC ；371 (3) 561-6 ;Tomizawa 等人，2007，J. Tmmunol ； 179 (2) :869_877);局部缺血性疾病(Isenberg 等人，2008, Arter. Thromb Vase. Biol. ,28(4) 615-21 ；Isenberg 2008, Am. J. Pathol., 173(4) : 1100-12)或肿瘤学相关疾病(Chan 等人，2009，PNAS，106 (33) : 14016-14021 ; Majeti等人，2009，Cell，138 (2) :286_99)。调节SIRP a/CD47途径因此可以是用于多种疾病的有希望的治疗性选项。已经建议使用针对⑶47、SIRPa或⑶47衍生的结合SIRP a的多肽的抗体作为治疗手段(W0 1998/40940、WO 2004/108923、W02007/133811、WO 2009/046541)。此外，结合SIRPa的CD47衍生的融合蛋白在疾病(如TNBS-结肠炎(Fortin等人，2009，J Exp Med.，206(9) :1995_2011)、朗格汉斯细胞移行(J. Immunol. 2004,172 =4091-4099)和关节炎(VLST Inc, 2008, Exp. Opin. Therap. Pat. , 18 (5) :555_561))的动物模型中是有效的。此外，提出SIRP α/0)47参与控制吞卩遼作用(van den Berg等人，2008, Trends in Immunol. ,29(5) :203_6)，并且声称通过SIRP α结合多肽进行干涉来增进NOD小鼠系中的人干细胞植入(W0 2009/046541)，表明含有⑶47胞外结构域(E⑶)的治疗剂用于人干细胞移植中的潜在益处。本发明提供了可溶性结合蛋白，它们包含第一和第二多肽链的异源二聚体，每种链包含与抗体恒定区序列融合的结合部分。这些可溶性蛋白用作治疗剂。本发明还提供用作治疗剂的改进的可溶性SIRP α结合蛋白。与现有技术的⑶47 蛋白融合物相比，如本发明中所定义的结合SIRPa的抗体样蛋白可以提供增加针对靶向的表达SIRPa的细胞的亲合力，同时维持优异的可发展性特征的手段。另外，不受任何理论约束，预期较高的亲合力导致较长的药物动力学半寿期，因而提供增强的治疗效能。这些新的研究结果提供了靶向表达SIRPa的细胞的新治疗工具并且代表治疗性前景，特别地对于多种自身免疫病和炎性疾病、癌症或干细胞移植而言是如此。
因此，在一个方面，本发明提供一种可溶性蛋白，它包含至少两个异源二聚体的复合物，其中每个异源二聚体基本上由以下组成toon] α)第一单价单链多肽，其包含与抗体的重链恒定区融合的哺乳动物结合分子的区域；和
(ii)第二单价单链多肽，其包含与抗体的轻链恒定区融合的相同结合分子的区域。
在另一个方面，本发明提供一种可溶性蛋白，它包含至少两个异源二聚体的复合物，其中每个异源二聚体基本上由以下组成
(i)第一单价单链多肽，其包含与抗体的ChI恒定重链区融合的哺乳动物结合分子的区域；和
(ii)第二单价单链多肽，其包含与抗体的(V〖亘定轻链区融合的相同结合分子的区域。
在优选的实施方案中，每种单链多肽是单价的，每个异源二聚体是二价的，并且每个复合物是至少四价的。本发明的异源二聚体和可溶性蛋白具有每条多肽链价态是I价。与现有技术的分子相比，本发明的可溶性蛋白具有增加的价态。通过在每种第一和第二单链多肽中并入相同的结合分子，每个异源二聚体的价态是两价，即，异源二聚体内部的每条链可以结合一个单独的结合配偶体或对相同的结合配偶体结合两次。这将与其中第一和第二多肽链的异源二聚体的价态是I价(即，同时需要两条链以结合这种结合配偶体)的现有技术分子(例如WO 01/46261中披露的那些)形成对比至这样的程度两个异源二聚体的复合物具有的价态是2价。因而，本发明的两个二价异源二聚体的复合物具有四价态(四价)，即，这个复合物可以结合多达四个结合配偶体，或对相同的结合配偶体结合多达四次。本发明的异源二聚体是双价，并且异源二聚体的复合物具有价态nx2，其中η是该复合物内部所包含的异源二聚体的数目。在优选的实施方案中，该复合物包含两个异源二聚体并且具有价态4。包含多于两个异源二聚体的复合物具有大于4的价态(例如6、8或10的价态)。本发明可溶性蛋白的增加的价态导致较高的亲合力，有利地影响半寿期和效能。
因此，在一个方面，本发明提供一种具有至少4价(或至少是四价)的可溶性蛋白，它包含至少两个异源二聚体的复合物，其中每个异源二聚体基本上由以下组成
(i)第一单价单链多肽，其包含与抗体的重链恒定区融合的哺乳动物结合分子的区域；和
(ii)第二单价单链多肽，其包含与抗体的轻链恒定区融合的相同哺乳动物结合分子的区域。
在另一个方面，本发明提供一种具有至少4价的可溶性蛋白，它包含至少两个异源二聚体的复合物，其中每个异源二聚体基本上由以下组成
(i)第一单价单链多肽，其包含与抗体的ChI恒定重链区融合的哺乳动物结合分子的区域；和
(ii)第二单价单链多肽，其包含与抗体的(V〖亘定轻链区融合的相同结合分子的区域。
在一个优选的方面，该结合分子的区域是相同的。因此，本发明提供一种具有至少 4价的可溶性蛋白，它包含至少两个异源二聚体的复合物，其中每个异源二聚体基本上由以下组成
(i)第一单价单链多肽，其包含与抗体的重链恒定区融合的哺乳动物结合分子的区域；和
(ii)第二单价单链多肽，其包含与抗体的轻链恒定区融合的相同哺乳动物结合分子的相同区域。
在另一个方面，本发明提供一种具有至少4价的可溶性蛋白，它包含至少两个异源二聚体的复合物，其中每个异源二聚体基本上由以下组成
(i)第一单价单链多肽，其包含与抗体的ChI恒定重链区融合的哺乳动物结合分子的区域；和
(ii)第二单价单链多肽，其包含与抗体的(V〖亘定轻链区融合的相同结合分子的相同区域。
在一个优选的实施方案中，哺乳动物结合分子的区域与抗体序列的N端部分(SP，与ChI区和Cl恒定区)融合。
在一个实施方案中，结合分子是细胞因子、生长因子、激素、信号传导蛋白、低分子量化合物(药物)、配体或细胞表面受体。优选地，该结合分子是哺乳动物单体的或同型聚合的细胞表面受体。结合分子的区域可以是完整分子或其可以保留该结合分子的生物学活性的部分或片段。结合分子的区域可以是胞外区域或结构域。在一个实施方案中，所述哺乳动物单体的或同型聚合的细胞表面受体包含免疫球蛋白超家族(IgSF)结构域，例如它包含⑶47的胞外结构域。
在一个优选的实施方案中，可溶性蛋白是一种抗体样蛋白(下文还称作并定义为 Fusobody)，其中抗体的两条臂的可变区由SIRPa结合结构域替换，从而提供多价的可溶性蛋白。
这种结合SIRP α的Fusobody的一个实例在图I中显示。
在一个实施方案中，本发明涉及分离的可溶性结合SIRPa的蛋白质或结合 SIRPa的Fusobody，其包含两个二价异源二聚体的四价复合物，其中每个异源二聚体基本上由以下组成
(i)第一单链多肽，其包含在抗体的恒SchI重链区的N端部分处融合的第一 SIRPa结合结构域；和，
(ii)第二单链多肽，其包含在抗体的恒定Q轻链区的N端部分处融合的第二 SIRPa结合结构域。
在优选的实施方案中，可溶性蛋白或结合SIRPa的Fusobody的每个异源二聚体的所述第一单链多肽还包含与所述ChI区融合的免疫球蛋白的Ch2和Ch3区，从而重构抗体的全长恒定重链。所述ChU Ch2和Ch3区可以衍生自人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4相应区域的野生型或突变变体，其具有沉默的效应子功能和/或减少的细胞杀伤性ADCC或CDC效应子功能，例如减少的ADCC效应子功能。
在一个实施方案中，所述可溶性蛋白或结合SIRPa的Fusobody与人SIRP α以 10 μ M或更小，例如4 μ M或更小，例如I μ M或更小，O. I μ M或更小的Kd结合，如表面等离子体共振法如BiaCORE测定法所测量。在一个实施方案中，可溶性蛋白或结合SIRPa的 Fusobody与人SIRP α以O. I至10 μ M范围内的Kd结合。
在另一个实施方案中，所述可溶性蛋白或结合SIRPa的Fusobody促进SIRP a + 白细胞如SIRPa +U937细胞以20nM或更小，例如2nM或更小，例如200pM和20nM之间的 EC50的黏附，如基于板的细胞黏附测定法中所测量。
在另一个实施方案中，所述可溶性蛋白或结合SIRP α的Fusobody抑制体外产生的单核细胞衍生性树状细胞中金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) Cowan菌株粒子刺激的促炎细胞因子释放。
例如，所述可溶性蛋白或结合SIRPa的Fusobody以2nM或更小、O. 2nM或更小、例如20pM和2nM之间的IC5tl抑制体外产生的单核细胞衍生性树状细胞中金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) Cowan菌株粒子刺激的促炎细胞因子释放,如树状细胞细胞因子释放测定法中所测量。
在另一个相关的实施方案中，每个异源二聚体的所述第一和第二单链多肽由二硫键共价地结合，例如使用相应ChI区和Q区的半胱氨酸残基之间的天然二硫键。
在一个实施方案中，第一和第二 SIRPa结合结构域可以经肽接头分别与ChI区和 Q区融合。在另一个实施方案中，第一和/或第二 SIRP α结合结构域在肽接头不存在下直接与相应的ChI区和Q区融合。
在一个优选实施方案中，所述可溶性蛋白或结合SIRPa的Fusobody基本上由两个异源二聚体组成，其中每个异源二聚体的所述第一单链多肽包含免疫球蛋白恒定部分的铰链区，并且这两个异源二聚体彼此通过半胱氨酸之间的二硫键在它们铰链区处稳定缔口 ο
在一个实施方案中，本发明的可溶性蛋白包含选自以下的至少一个SIRPa结合结构域
⑴人⑶47的胞外结构域；
(ii)SEQ ID NO 4的多肽或保留SIRPa结合特性的SEQ ID NO 4的片段；和
(iii)与 SEQ ID NO :4 具有至少 60、70、80、90、95、96、97、98 或 99%序列同一性并保留SIRP α结合特性的SEQ ID NO :4的变体多肽。
在一个具体实施方案中，全部SIRPa结合结构域具有相同的氨基酸序列。例如，全部 SIRP α 结合结构域由 SEQ ID NO 4 或 SEQ ID NO :3 或 SEQ ID NO :21 或 SEQ ID NO 23 或 SEQ ID NO 27 组成。
在一个具体实施方案中，本发明的所述可溶性蛋白或结合SIRP α的Fusobody包含两个异源二聚体，其中每个异源二聚体基本上由SEQ ID NO 5的第一单链多肽和SEQ ID NO 6的第二单链多肽组成。与抗体的重链和轻链相似，所述第一和第二单链多肽至少经一个二硫键稳定缔合。在相关的实施方案中，可溶性蛋白或结合SIRPa的Fusobody包含两个异源二聚体，其中每个异源二聚体的第一和第二单链多分别与相应SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6的第一和第二单链多肽具有至少60、70、80、90、95、96、97、98或99%序列同一性，同时保留如上文所述的结合SIRPa的Fusobody的有利功能特征。
具体而言，在一个具体实施方案中，这种可溶性蛋白或结合SIRPa的Fusobody与人SIRP α以10 μ M或更小、4 μ M或更小、或者2 μ M或更小、例如O. I μ M和10 μ M之间的Kd彡口口。
在一个具体实施方案中，本发明的结合SIRP α的Fusobody的四个SIRP α结合结构域是在序列上相同的。例如，所述结合SIRPa的Fusobody分别由SEQ ID NO :5和SEQ ID NO 6的第一和第二单链多肽组成。
本发明还涉及用作药物或诊断工具，例如用于自身免疫病和急性及慢性炎性病症的治疗或诊断中的此类可溶性蛋白或Fusobody、特别地是结合SIRPa的蛋白质或 Fusobody。具体而言，结合SIRPa的蛋白质或Fusobody用于治疗选自Th2介导的气道炎症、过敏性病症、哮喘、炎性肠病和关节炎的病症。
本发明的可溶性蛋白或Fusobody也可以在有需求的受试者中用于治疗或诊断局部缺血性病症、白血病或其他癌症或用于增加造血干细胞植入。
定义
为了可以更轻易地理解本发明，首先定义某些术语。额外的定义在遍及的详细描述中给出。
术语SIRPa指显示与⑶47整联蛋白缔合蛋白黏附的人信号调节蛋白α (也称为CD172a或SHPS-1)。ASIRPa包括SEQ ID NO :1，但是还包括而不限于任何天然多态性变体，例如，包括人SIRPa的单核苷酸多态性(SNP)或剪接变体。表I中描述了人类中在 SIRPa核苷酸序列中发现的剪接变体或SNP的实例。
表I :SIRPa蛋白的变体

本发明涉及用作药物的、特别地用于预防或治疗自身免疫病和炎性疾病(例如过敏性哮喘和炎性肠病)的可溶性SIRPα结合蛋白。本发明更具体地涉及包含两个异源二聚体的复合物的可溶性SIRPα结合蛋白，其中每个异源二聚体基本上由以下组成(i)第一单价单链多肽，其包含在抗体的重链恒定区的N端部分处融合的第一SIRPα结合结构域；和(ii)第二单价单链多肽，其包含在抗体的CL轻链恒定区的N端部分处融合的第二SIRPα结合结构域。本发明还涉及如

图1中所显示的可溶性结合SIRPα的抗体样蛋白。

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