专利名称：人抗TNF-α抗体的稳定高蛋白质浓度制剂的制作方法人抗TNF-α抗体的稳定高蛋白质浓度制剂相关申请本申请要求于2009年5月4日提交的美国临时申请号61/175，380的优先权，其完整内容引入本文作为参考。背景已知制剂必须是经济上和治疗上成功的众多所需性质，例如稳定性、用于施用的适合性、浓度，治疗用蛋白质例如抗体的制剂通常是挑战。在制造、贮存和递送过程中，治疗用蛋白质已知经历物理和化学降解。这些不稳定性可以减少蛋白质的效力且增加在患者中的不利事件的危险，并且因此，显著影响管理机构批准(参见例如，Wang，等人(2007) J Pharm Sci 96:1)。因此，稳定蛋白质制剂是治疗用蛋白质成功必需的。为了是有效的，许多治疗用蛋白质需要高剂量的施用，这优选以高浓度制剂进行配制。高蛋白质浓度制剂是希望的，因为它们可以影响药物对受试者的施用方式(例如静脉内与皮下比较)和频率。尽管高蛋白质浓度制剂的利益，但配制高浓度治疗用蛋白质仍提出了众多挑战。 例如，增加蛋白质浓度经常负面影响蛋白质聚集、可溶性、稳定性和粘度(参见例如，Shire, 等人(2004) J Pharm Sci 93:1390)。其为关于高蛋白质溶液的非常通常挑战的粘度增加可以对制剂的施用具有负面后果，例如感觉疼痛和烧伤综合征以及在制备、加工、灌装封装 (fill-finish)和药物递送设备选择中的局限性(参见例如，Shire，等人(2004) J Pharm Sci 93:1390)。即使对于具有常见结构特征的治疗用蛋白质例如抗体，迄今为止批准的制剂也具有改变的成分和浓度范围。例如，抗⑶20抗体抗体Rituxan配制用于以10 mg/mL 的浓度静脉内施用，而抗RSV抗体Synagis配制用于以100 mg/mL的浓度肌内施用。因此， 可以用于治疗目的的高蛋白质制剂尤其是抗体制剂仍是挑战。因此，存在关于提供给药和管理优点的稳定、高浓度蛋白质制剂的需要。发明概述本发明至少部分基于人抗TNF-α抗体或其抗原结合片段例如阿达木单抗 (adalimumab)的新高浓度制剂的发现。给定抗体的高浓度，本发明的制剂提供了许多令人惊讶的特征。例如，尽管蛋白质的高浓度，本发明的制剂在延长的时间段期间仍维持物理和化学稳定性，并且具有适合于皮下施用的粘度。本发明的制剂至少部分在下述令人惊讶的发现上确立人抗TNF-α抗体或其抗原结合部分在高浓度(例如100 mg/mL)可以保持稳定，并且保持不聚集同时维持适合于注射(例如皮下施用)的粘度。本发明的制剂也是令人惊讶的，这是因为高浓度(例如100 mg/mL)的人抗TNF-α抗体或其抗原结合部分在广泛ρΗ 范围例如约PH 5.2 -约ρΗ 6.0内可以保持溶解，并且保持不聚集和化学稳定的(例如无氧化或脱酰胺作用)。这些有利特征无需NaCl作为稳定剂而达到，并且伴随糖醇赋形剂中的增加。本发明的一个方面提供了包含超过40 mg多元醇和至少约100 mg/mL人抗TNF-a 抗体或其抗原结合部分的液体药物制剂。本发明的另一个方面提供了包含超过20 mg多元醇和至少约100 mg/mL人抗TNF-α抗体或其抗原结合部分的液体药物制剂。在一个实施方案中，本发明的制剂不含有 NaCl。本发明的特征还在于具有约5. 0 - 6. 4的ρΗ且包含至少约100抗体或其抗原结合部分的液体药物制剂，其中所述制剂不含有NaCl，并且在标准M小时搅拌应力(stir-stress)测定后或在作为液体长期贮存M个月后具有小于60 NTU的浊度。本发明进一步提供了具有约5. 0 - 6. 4的ρΗ且包含至少约100抗体或其抗原结合部分的液体药物制剂，其中所述制剂不含有NaCl，并且在标准48小时搅拌应力测定后具有小于100 NTU的浊度。本发明的另一个方面包括具有约5. 0 - 6. 4的ρΗ且包含至少约100 mg/mL人抗 TNF-α抗体或其抗原结合部分的液体药物制剂，其中所述制剂不含有NaCl，并且在5°C、 25°C或40°C 3个月贮存后具有小于40 NTU的浊度。本发明还提供了液体药物制剂，其包含至少约100 mg/mL人抗TNF-α抗体或其抗原结合部分；超过约20 mg/mL多元醇；0. 1-2. 0 mg/mL表面活性剂；约1. 15-1. 45 mg/mL柠檬酸* H2O ；约 0. 2-0. 4 mg/mL 脱水柠檬酸钠；约 1. 35-1. 75 mg/mL Na2HPO4* 2 H2O ；约 0. 75-0. 95 mg/mL NaH2PO4* 2 H2O,其中所述制剂具有约4. 7 - 6. 5的pH，并且不包含NaCl。本发明的制剂适合于皮下施用。因此，本发明还包括包含人TNFa抗体或其抗原结合部分的本发明的制剂用于治疗与受试者中的有害TNFa活性相关的病症的用途。在一个实施方案中，本发明的制剂具有一定浓度的人TNFa抗体或其抗原结合部分和约3. 1 - 3. 3 mPas*s的粘度。在一个实施方案中，本发明的制剂包含超过20 mg多元醇。可以包括在本发明的制剂中的另外量的多元醇是超过30 mg多元醇。可替代地，超过40 mg多元醇可以在本发明的制剂中使用，包括但不限于40-45 mg或约42 mg。在一个实施方案中，在本发明的制剂中使用的多元醇是糖醇，例如但不限于甘露糖醇或山梨糖醇。在一个实施方案中，制剂包含约40-45 mg/mL甘露糖醇或山梨糖醇。本领域已知的各种表面活性剂可以在本发明的制剂中使用。在一个实施方案中， 表面活性剂是聚山梨醇酯80。在进一步的实施方案中，约0. 1-2.0 mg/mL聚山梨醇酯80在本发明的制剂中使用。在本发明的一个实施方案中，制剂包含约1. 30-1. 31 mg/mL柠檬酸* H2O0在本发明的另一个实施方案中，制剂包含约0. 30-0. 31 mg/mL脱水柠檬酸钠。在本发明的另外一个实施方案中，制剂包含约1. 50-1. 56 mg/mL Na2HPO4* 2 H2O0在本发明的进一步实施方案中，制剂包含约0.83-0. 89 mg/mL NaH2PO4* 2 H2O0在另一个实施方案中，本发明的制剂的ρΗ范围为约4. 8 -约6. 4。例如，本发明的制剂的PH可以范围为约5.0 -约5.4 (例如约5. 2)或可以范围为约5. 8 -约6. 4 (例如约6.0)。本发明的制剂的优点是它提供了抗体的高浓度而无增加的蛋白质聚集，所述蛋白质聚集通常伴随增加的蛋白质浓度而发生。在一个实施方案中，本发明的制剂具有小于约的聚集蛋白质。作为本发明的部分还预期的是具有至少约50 mg/mL浓度的人抗TNF α抗体或其抗原结合部分的本文描述的制剂。在一个实施方案中，人抗体或其抗原结合部分包含轻链和重链，所述轻链包括包含如SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列的⑶R3结构域，且所述重链包括包含如SEQ ID NO 4 所示的氨基酸序列的CDR3结构域。在本发明的一个实施方案中，抗体具有包含SEQ ID NO :3，或通过在位置1、4、5、7 或8上的单个丙氨酸取代，或通过在位置1、3、4、6、7、8和/或9上的1 - 5个保守氨基酸取代由SEQ ID NO :3修饰的氨基酸序列的轻链⑶R3结构域，并且具有包含SEQ ID NO 4, 或通过在位置2、3、4、5、6、8、9、10或11上的单个丙氨酸取代，或通过在位置2、3、4、5、6、8、9、10、11和/或12上的1- 5个保守氨基酸取代由SEQ ID NO :4修饰的氨基酸序列的重链⑶R3结构域。本发明的抗体可以具有某些功能特征。例如，人抗体或其抗原结合部分可以以1 χ10、或更少的Kd与人TNFα解离，以1 χ ΙΟ、—1或更少的K。ff速率常数与人TNF α解离， 两者都通过表面等离振子共振进行测定，和/或在标准体外测定中以1 χ 10_7M或更少的IC5tl中和人TNF α细胞毒性。在一个实施方案中，人抗体或其抗原结合部分是人IgGl κ抗体。在本发明的一个实施方案中，人抗体或其抗原结合部分的轻链进一步包括包含如 SEQ ID NO :5所示的氨基酸序列的⑶R2结构域，和包含如SEQ ID NO :7所示的氨基酸序列的⑶Rl结构域，和/或人抗体的重链包括包含如SEQ ID NO 6所示的氨基酸序列的⑶R2 结构域，和包含如SEQ ID NO :8所示的氨基酸序列的⑶Rl结构域。在另一个实施方案中， 人抗体或其抗原结合部分的轻链包含如SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列，并且人抗体的重链包含如SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列。在本发明中还包括的是具有这样的氨基酸序列的人抗体或其抗原结合部分，所述氨基酸序列与本文所述的SEQ ID NOs至少80%、85%、 90%,95%,96%,97%,98%^； 99%等同。在本发明的另外一个实施方案中，人抗体或其抗原结合部分是阿达木单抗。附图简述


图1是描述在包含0. 1% Solutol的溶液中高分子量(hmw)蛋白质样品的存在的曲线图。根据MALS (灰线)，聚集体摩尔质量最高几乎等于109g/mol，占总蛋白的2. 6% (UV280, 黑线)。在40°C贮存12周。图2A和2B是描述在40°C贮存过程中出现的高分子量(hmw)聚集体的早期检测的曲线图。虽然经由UW80 (黑曲线)不能检测到聚集体，但MALS (灰曲线)明确地证明了 hmw 样品的存在。一周贮存(A)与原始样品(B)比较。图3是描述制剂F1-F6的浊度与冻/融循环比较的曲线图。图4是描述制剂F1-F6的多分散性指数与冻/融循环比较的曲线图。图5是描述制剂F1-F6的通过SEC的聚集体水平与冻/融循环比较的曲线图。图6是描述在TO时通过制剂F1-F6的DSC以。C表示的Tm的曲线图。图7是描述制剂F1-F6的通过SEC的聚集体水平与搅拌时间比较的曲线图。图8是描述在F2、F6和F7 (3个代表性批次01032-0134)的3个月贮存后，在稳定性研究中获得的浊度值比较的曲线图。图9是描述在F2、F6和F7 (3个代表性批次01032-0134)的3个月贮存后，在稳定性研究中获得的通过DAC得分的可见粒子值比较的曲线图。图10是描述在F2、F6和F7 (3个代表性批次01032-0134)的3个月贮存后，在稳定性研究中获得的亚可见(sub-visible)粒子值(>=10Mm)比较的曲线图。图11是描述在F2、F6和F7 (3个代表性批次01032-0134)的3个月贮存后，在稳定性研究中获得的亚可见粒子值(>=25Mm)比较的曲线图。图12是描述在F2、F6和F7 (3个代表性批次01032-0134)的3个月贮存后，在稳定性研究中获得的残留单体含量比较的曲线图。图13是描述在F2、F6和F7 (3个代表性批次01032-0134)的3个月贮存后，在稳定性研究中获得的赖氨酸变体总和比较的曲线图。图14是描述在M小时后就针对以不同搅拌速度的搅拌应力的稳定性而言，比较 F2、F6和F7的浊度数据的曲线图。图15是描述在M小时后就针对以不同搅拌速度的搅拌应力的稳定性而言，比较 F2、F6和F7的DLS数据(Z平均值)的曲线图。图16是描述在几个泵循环前和后就针对应力的稳定性而言，比较F2、F6和F7的浊度数据的曲线图。图17是描述在几个泵循环前和后就稳定性而言，比较F2、F6和F7的DLS数据(Z 平均值)的曲线图。图18是描述在几个泵循环前和后就稳定性而言，比较F2、F6和F7的SEC数据(聚集体水平)的曲线图。图19是描述使用蠕动泵填充的100 mg/mL制剂的视觉得分的曲线图。图20是描述使用活塞泵填充的100 mg/mL制剂的视觉得分的曲线图。图21是描述使用蠕动泵填充的100 mg/mL制剂的浊度的曲线图。图22是描述使用活塞泵填充的100 mg/mL制剂的浊度的曲线图。图23是描述制剂F8-F11在TO时和在5°C的4周贮存后的浊度的曲线图。图M是描述制剂F8-F11在TO时和在5°C的4周贮存后的单体含量的曲线图。图25是描述制剂F8-F11在TO时和在5°C的4周贮存后的聚集体水平的曲线图。图沈是描述制剂F8-F11在TO时和在5°C的4周贮存后的亚可见粒子计数的曲线图。发明详述
I.定义
为了本发明可以更容易理解，首先定义了某些术语。此外，应当指出每当叙述参数的值或值范围时，预期对于所述值中间的值和范围也预期是本发明的部分。术语“药物制剂”指这样的制剂，其为此种形式以便允许活性成分的生物学活性明确有效，并且不含有对于制剂将施用于其的受试者明显有毒的另外组分。短语“药学可接受的载体”是领域公认的，并且包括适合于施用于哺乳动物的药学可接受的材料、组合物或载体。载体包括液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或胶囊化 (encapsulating)材料，涉及携带或转运主题试剂从身体的一个器官或部分到身体的另一个器官或部分。每个载体必须是在与制剂的其他成分相容的意义上“可接受的”，并且对患者的安全无害或不影响患者的安全。
“药学可接受的赋形剂”(载体、添加剂)是可以合理地施用于主题哺乳动物以提供采用的活性成分的有效剂量的那些。术语“赋形剂”指可以加入制剂中以提供所需一致性例如改变膨胀性质，以改善稳定性和/或调整重量摩尔渗透压浓度的试剂。常用赋形剂的例子包括但不限于糖、多元醇、 氨基酸、表面活性剂和聚合物。常用赋形剂是多元醇。如本文使用的，“多元醇”是具有多个羟基的物质，并且包括糖(还原和非还原糖)、糖醇和糖酸。本文优选的多元醇具有小于约600 kD的分子量(例如在约120 -约400 kD的范围中)。多元醇的非限制性例子是果糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖、阿拉伯糖、木糖、核糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、山梨糖、松三糖、棉子糖、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、苏糖醇、山梨糖醇、甘油、L-葡糖酸及其金属盐。如本文使用的，“缓冲液”指通过其酸碱共轭组分的作用抵抗pH中的改变的缓冲溶液。本发明的缓冲液具有在约4 -约8范围中的pH ；优选约4.5 -约7;并且最优选具有在约5.0 -约6. 5范围中的pH。将pH控制在这个范围中的缓冲液的例子包括磷酸盐、乙酸盐(例如乙酸钠)、琥珀酸盐(例如琥珀酸钠)、葡糖酸盐、谷氨酸、组氨酸、柠檬酸盐和其他有机酸缓冲液。在一个实施方案中，适合于在本发明的制剂中使用的缓冲液是柠檬酸盐和磷酸盐缓冲液。术语“表面活性剂”一般包括保护制剂中的蛋白质不受空气/溶液界面诱导的应力和/或溶液/表面诱导的应力的那些试剂。例如，表面活性剂可以保护蛋白质不受聚集。 合适的表面活性剂可以包括例如聚山梨醇酯、聚氧乙烯烷基醚例如Brij 35. RTM.，或泊洛沙姆例如Tween 20,Tween 80或泊洛沙姆188。优选去污剂是泊洛沙姆例如泊洛沙姆188、 泊洛沙姆 407 ；聚氧乙烯烧基醚例如 Brij 35. RTM.、Cremophor A25、Sympatens ALM/230 ； 和聚山梨醇酯/Tweens，例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、Mirj和泊洛沙姆例如泊洛沙姆 188、以及 Tweens 例如 Tween 20 禾P Tween 80。“稳定”制剂是其中在制备过程期间和/或在贮存时抗体在其中基本上保持其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物学活性的那种。用于测量蛋白质稳定性的各种分析技术是本领域可获得的，并且在 P印tide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed.，Marcel Dekker, Inc.，New York, N. Y.，Pubs. (1991)禾口 Jones，A. (1993) Adv. Drug Delivery Rev. 10 :29-90中综述。例如，在一个实施方案中，蛋白质的稳定性根据溶液中的单体蛋白质百分比进行测定，具有低百分比的降解(例如片段化的)和/或聚集的蛋白质。优选地，制剂在室温(约30°C)或在40°C稳定至少1个月和/或在约2-8°C稳定至少 1年或至少2年。此外，制剂优选在制剂的冷冻(至例如_70°C )和融化后是稳定的，下文称为“冻/融循环”。如果在颜色和/或透明度的视觉检查时，或如通过UV光散射或通过尺寸排阻层析测量的，抗体基本上未显示例如聚集、沉淀和/或变性的征兆，那么它在药物制剂中“保持其物理稳定性”。聚集是由此个别分子或复合物共价或非共价结合以形成聚集体的过程。聚集可以进行至形成可见沉淀的程度。制剂的稳定性例如物理稳定性可以通过本领域众所周知的方法进行评估，包括样品的光表观衰减(apparent attenuation)(吸光度或光密度)的测量。光衰减的此种测量涉及制剂的浊度。制剂的浊度部分是在溶液中溶解的蛋白质的固有性质，并且通常通过比
9浊法进行测定，且以比浊法浊度单位(NTU )进行测量。例如随溶液中一种或多种组分的浓度，例如蛋白质和/或盐浓度而变的浊度程度，也称为制剂的“乳光”或“乳光外观”。浊度程度可以通过参考使用已知浊度的悬浮液生成的标准曲线进行计算。用于测定关于药物组合物的浊度程度的参考标准可以基于欧洲药 ；ftt示}11(European Pharmacopoeia,4 Directorate for the Quality of Medicine of the Council of Europe (EDQM)，Strasbourg，France)。根据欧洲药典标准,透明溶液定义为具有小于或等于参考悬浮液的浊度的那种，所述参考悬浮液根据欧洲药典标准具有约3的浊度。比浊法浊度测量可以检测瑞利散射(Rayleigh scatter)，在不存在结合或非理想作用的情况下，这一般随着浓度线性改变。用于评估物理稳定性的其他方法是本领域众所周知的。如果在给定时间的化学稳定性是这样的，从而抗体被视为仍保持其如下定义的生物学活性，那么抗体在药物制剂中“保持其化学稳定性”。化学稳定性可以通过例如检测且定量化学改变形式的抗体进行评估。化学改变可以涉及大小修饰(例如修剪)，这可以使用例如尺寸排阻层析、SDS-PAGE和/或基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱法(MALDI/T0F MS)进行评价。其他类型的化学改变包括电荷改变(例如由于脱酰胺作用或氧化而发生)，这可以通过例如离子交换层析进行评价。如果药物制剂中的抗体对于其预期目的是生物学活性的，那么抗体在药物制剂中 “保持其生物学活性”。例如，如果药物制剂中抗体的生物学活性在制备药物制剂时显示出的生物学活性的约30%、约20%或约10%内(在测定的误差内)(例如，如在抗原结合测定中测定的)，那么生物学活性被保持。在药理学意义上，在本发明的背景中，抗体的“治疗有效量”或“有效量”指在抗体对于其治疗是有效的病症症状的预防或治疗或减轻中有效的量。“病症”是将获益于用抗体治疗的任何状况。这包括慢性和急性病症或疾病，包括使受试者易患所讨论的病症的那些病理学状况。“治疗”指治疗性处理和预防或防止措施。需要治疗的那些包括已具有病症的那些以及其中待预防病症的那些。如本文使用的，短语“肠胃外施用”和“肠胃外施用的”意指除肠和局部施用外的施用方式，通常通过注射，并且包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、 真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、颅内(intriacranial)、关节内、脊柱内和胸骨内注射和输注。如本文使用的，短语“全身施用”、“全身施用的”、“外周施用，，和“外周施用的，，意指化合物、药物或其他材料除直接进入中枢神经系统内之外的施用，从而使得它进入患者的系统并且因此实施代谢和其他类似过程，例如皮下施用。如本文使用的，术语“人TNF- α，，(本文缩写为hTNF- α、TNF α或简单地hTNF)意指人细胞因子，其作为17 kD分泌形式和沈kD膜结合形式存在，其生物学活性形式由非共价结合的17 kD分子的三聚体组成。hTNF-α的结构在例如Permica，D.，等人(1984) Nature 312:724-729 ；Davis, J. Μ.，等人(1987)Biochem 26 1322-1326 ；和 Jones，Ε. Y.， 等人(1989) Nature 338 225-2 中进一步描述。术语人TNF-α意欲包括重组人TNF-a (rhTNF-a )，这可以通过标准重组表达法制备或商业购买(R & D Systems,目录号210-TA，Minneapolis, Minn.)。如本文使用的，术语“抗体”意指免疫球蛋白分子，其包含通过二硫键互连的4条多肽链一一 2条重(H)链和2条轻(L)链。改变结构的其他天然存在的抗体例如骆驼科动物(camel id)抗体也包括在这个定义中。每条重链包含重链可变区(本文缩写为HCVR或VH) 和重链恒定区。重链恒定区包含3个结构域一一 CH1、CH2*CH3。每条轻链包含轻链可变区(本文缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域一一 CL。VH和VL 区可以进一步再分成称为互补性决定区(CDR)的高变区，由称为构架区(FR)的更保守区域点缀。每个VH和VL由3个CDRs和4个FRs组成，从氨基末端到羧基末端以下述次序排列FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本发明的一个实施方案中，制剂含有具有如同美国专利号6，090, 382和6，258，562中所述那些的CDR1、CDR2和CDR3序列的抗体，所述专利各自引入本文作为参考。如本文使用的，术语“CDR”指在抗体可变序列内的互补决定区。在重链和轻链的可变区的每一个中存在3个⑶Rs，这对于每个可变区命名为⑶R1、⑶R2和⑶R3。这些⑶Rs 的确切边界已根据不同系统不同定义。由Kabat (同上)描述的系统不仅提供了可应用于抗体的任何可变区的明确残基编号系统，还提供了限定3个CDRs的精确残基边界。这些 ⑶Rs可以称为Kabat⑶Rs。Chothia等人发现在Kabat⑶Rs内的某些亚部分采用几乎等同的肽主链构象，尽管在氨基酸序列水平上具有极大多样性(Chothia等人(1987) Mol. Biol. 196:901-917 ；Chothia 等人(1989) Nature 342:877-883)这些亚部分命名为 Li、 L2和L3或HI、H2和H3，其中“L”和“H”分别指定轻链和重链区域。这些区域可以称为 Chothia CDRs，这具有与Kabat CDRs重叠的边界。限定与Kabat CDRs重叠的CDRs的其他边界已由 Padlan (1995) FASEB J. 9 133-139 和 MacCallum (1996) J. Mol. Biol. 262 (5):732-45描述。另外其他的CDR边界定义可能不严格遵循本文描述的系统之一，但仍将与Kabat⑶Rs重叠，尽管它们依照特定残基或残基组或甚至整个⑶Rs不显著影响抗原结合的预测或实验发现可以是缩短或加长的。本文使用的方法可以利用根据这些系统中的任何一种定义的⑶Rs，尽管某些实施方案使用Kabat或Chothia定义的⑶Rs。如本文使用的，术语抗体的“抗原结合部分”(或简单地“抗体部分”)指保持与抗原(例如hTNF-α )特异性结合能力的抗体的一个或多个片段。已显示抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段执行。在术语抗体的“抗原结合部分”内包含的结合片段的例子包括(i ) Fab片段，由VL、VH、CL和CHl结构域组成的单价片段；(ii ) F (ab’)2片段，包括由铰链区的二硫键连接的2个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CHl结构域组成的Fd 片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(ν)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人，(1989) Nature 341 544-546);和(vi )分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的2个结构域VL和VH由分开的基因编码，但它们可以使用重组法通过合成接头进行连接，所述合成接头使得它们能够制备为单条蛋白质链，其中VL和VH区配对以形成单价分子(称为单链Fv (scFv)；参见例如，Bird等人(1988) kience 242:423-426 ；^P Huston 等人(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883)。此种单链抗体也意欲包含在术语抗体的“抗原结合部分”内。还包含了其他形式的单链抗体例如双抗体。双抗体是二价、双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单条多肽链上表达，但使用太短而不允许相同链上的2个结构域之间配对的接头，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对，且产生2个抗原结合部位(参见例如Holliger，P.，等人(1993)ftx)c. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 ；Poljak, R. J.，等人(1994) Mructure 2:1121-1123)。在本发明的一个实施方案中，制剂包含美国专利号6，090, 382和6，258，562中所述的抗原结合部分，所述专利各自整体引入本文作为参考。再进一步地，抗体或其抗原结合部分可以是更大免疫粘附分子的部分，所述免疫粘附分子由抗体或抗体部分与一种或多种其他蛋白质或肽的共价或非共价结合形成。 此种免疫粘附分子的例子包括链霉抗生物素蛋白核心区的使用，以制备四聚scFv分子 (Kipriyanov, S. Μ.，等人(1995) Human Antibodies and Hybridomas 6 93-101 )，以及半胱氨酸残基、标记肽和C末端聚组氨酸标签的使用，以制备二价和生物素化的scFv分子 (Kipriyanov, S. Μ.，等人(1994) Mol. Immunol. 31 1047-1058)。抗体部分例如 Fab 和 F (ab’)2片段可以使用常规技术由完整抗体进行制备，例如分别地完整抗体的木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化。此外，抗体、抗体部分和免疫粘附分子可以使用标准重组DNA技术获得，如本文描述的。如本文所使用的，术语“人抗体”意欲包括具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区的抗体。在本发明中使用的人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，在体外通过随机或位点专一诱变或在体内通过体细胞突变引入的突变)，例如，在CDRs且特别是CDR3中。然而，如本文所使用的，术语“人抗体”不意欲包括其中衍生自另一个哺乳动物物种例如小鼠的种系的CDR序列已嫁接到人构架序列上的抗体。如本文所使用的，术语“重组人抗体”意欲包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的所有人抗体，例如使用转染到宿主细胞内的重组表达载体表达的抗体(在下文部分II 中进一步描述)，从重组、组合人抗体文库中分离的抗体(在下文部分III中进一步描述)，从对于人免疫球蛋白基因是转基因的动物(例如小鼠)中分离的抗体(参见例如，Taylor, L. D.，等人(1992) Nucl. Acids Res. 20 6沘7_6295)，或通过任何其他方法制备、表达、产生或分离的抗体，所述任何其他方法涉及人免疫球蛋白基因序列与其他DNA序列的剪接。此种重组人抗体具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区。然而，在特定实施方案中，对此种重组人抗体实施体外诱变(或当使用对于人Ig序列转基因的动物时，体内体细胞诱变)，并且因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是这样的序列，尽管其衍生自人种系VH和VL序列且与人种系VH和VL序列有关，但可能在体内不天然存在于人抗体种系谱内。如本文所使用的，“分离的抗体”意指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合hTNF α的分离的抗体基本上不含特异性结合除hTNF α外的抗原的抗体)。然而，特异性结合hTNFa的分离的抗体可以与其他抗原例如来自其他物种的 TNFa分子具有交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本上不含其他细胞材料和/或化学试剂。如本文所使用的，“中和抗体”(或“中和hTNFa活性的抗体”)意指其与hTNF α的结合导致hTNFa生物学活性的抑制的抗体。hTNFa生物学活性的这种抑制可以通过测量 hTNFa生物活性的一种或多种指示剂进行评估，例如hTNF α诱导的细胞毒性(在体外或在体内)、hTNFa诱导的细胞活化和hTNFa与hTNF α受体结合。hTNFa生物学活性的这些指示剂可以通过几种标准体外或体内测定中的一种或多种进行评估，所述测定是本领域已
12知的并且在各自引入本文作为参考的美国专利号6，090，382和6，258，562中描述。优选地， 抗体中和hTNFa活性的能力通过抑制hTNFa诱导的细胞的细胞毒性进行评估。作为另外或可替代的hTNF α活性参数，可以评估抗体抑制hTNF α诱导的在HUVEC上的ELAM-I 表达的能力，作为hTNFa诱导的细胞活化的量度。如本文使用的，术语“表面等离振子共振”指允许通过检测生物传感器基质内蛋白质浓度中的改变分析实时生物特异性相互作用的光学现象，例如使用BIAcore系统(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala,瑞典禾口 Piscataway, N. J.)。关于进一步描述， 参见 Jonsson，U.，等人(1993) Ann. Biol. Clin. 51 19-26 ；Jonsson，U.，等人(1991) Biotechniques 11:620-627 ;Johnsson，B.，等人(1995)J. Mol. Recognit. 8:125-131;禾口 Johnnson，B.，等人(1991) Anal. Biochem. 198:268—277。如本领域已知的，如本文使用的，术语“K。n”意指关于结合蛋白(例如抗体)与抗原结合以形成例如抗体/抗原复合物的结合速率常数。如本文使用的，术语“K。ff ”意指关于抗体从抗体/抗原复合物解离的解离速率常数。如本文使用的，术语“Kd”意指特定抗体-抗原相互作用的解离常数，并且指在滴定测量中在平衡时，或通过将解离速率常数(k。ff)除以结合速率常数(k。n)获得的值。本发明的各个方面在下文小节中进一步详细描述。II.本发明的制剂
本发明的特征在于与领域公认的制剂相比较具有改善的性质的液体药物制剂(例如抗体制剂)。本发明基于下述令人惊讶的发现通过去除NaCl且添加超过20 mg/mL多元醇例如糖醇，制剂中人TNF α抗体的浓度可以增至约100 mg / mL。尽管抗体的高浓度，但例如在制备、贮存和/或反复冻/融加工步骤或延长的暴露于增加的空气-液体界面的过程中， 本发明的制剂仍能够维持蛋白质的可溶性和稳定性。此外，尽管具有约100 mg / mL的抗体，但本发明的制剂维持低水平的蛋白质聚集(即小于1%)。尽管具有约100 mg / mL的抗体，但本发明的制剂还令人惊讶地维持在适合于皮下注射的范围内的低粘度。此外，本发明的制剂例如高浓度TNF α抗体维持可溶性，维持适合于皮下注射的低粘度，并且维持在几乎1的PH范围内的稳定性，例如pH 5. 2 - ρΗ 6. 0。在一个实施方案中，在标准48小时搅拌应力测定后，制剂的浊度小于100 NTU0因此，本发明的高抗体制剂克服了关于制剂的许多已知挑战，包括稳定性、粘度、浊度和物理降解挑战。本发明的制剂令人惊讶的特征是在不存在NaCl的情况下，虽然抗体浓度高(例如，100 mg/mL或更大)，但制剂的总体粘度保持为低的(例如约3. 1 - 3.3 mPas*s，例如约 3. 00,3. 05,3. 10,3. 15,3. 20,3. 25,3. 30,3. 35 或约 3. 40 mPas*s)。一般地，粘度随着蛋白质浓度增加而增加(关于综述参见Siire等人(2004) J Pharm Sci 93:1390)。此种增加几乎总是通过添加离子赋形剂例如NaCl和MgCl2来抵抗，然而，此种赋形剂的添加还可以导致溶液增加的浊度。增加的浊度经常与不溶性蛋白质聚集体、沉淀或蛋白质颗粒(例如聚集)形成相关。因此，本发明的液体药物制剂提供了具有适合于皮下施用的粘度的高抗体浓度(例如至少100 mg/ mL)，而不需添加NaCl。在一个实施方案中，本发明的制剂包括高浓度的蛋白质，从而使得液体制剂不显示显著乳光、聚集或沉淀。
在另一个实施方案中，本发明的制剂包括高浓度的蛋白质，从而使得适合于例如皮下施用而无显著感觉的疼痛(例如，如通过直观模拟标尺(visual analog scale) (VAS) 得分测定的)。本发明的制剂包含高蛋白质浓度，包括例如约50 mg/mL或约100 mg/mL人抗 TNF-α抗体或其抗原结合片段的蛋白质浓度。因此，如下文实施例1中所述，在本发明的一个方面，液体药物制剂包含约50 mg/mL的人抗TNF α抗体浓度。如下文实施例2_6中所述， 在本发明的另一个方面，液体药物制剂包含约100 mg/mL的人抗TNFa抗体浓度。在本发明的另外一个方面，液体药物制剂包含约150 mg/mL的人抗TNF α抗体浓度。尽管本发明的优选实施方案是包含高蛋白质浓度的制剂，但还预期本发明的制剂可以包含约1 mg/mL -约150 mg/mL或约40 mg/mL-125 mg/mL的抗体浓度。对于上述浓度中间的浓度和范围也预期是本发明的部分(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、 46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、 71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、 96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、 116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、 135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、 154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、 173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、 192、193、194、195、196、197、198、199 或 200 mg/mL)。在另一个方面，本发明提供了液体药物组合物，其包含多元醇、表面活性剂和缓冲系统，其量足以配制抗体例如阿达木单抗，用于以大于约例如100 mg/mL的浓度用于治疗用途。在一个实施方案中，液体药物组合物不包含NaCl。然而，应当指出尽管本发明的优选制剂不包含NaCl，但小量NaCl可以存在于制剂中，例如约0.01 mM -约300 mM。此外，预期包括对于所述值中间的任何量的NaCl。在一个方面，本发明提供了液体药物组合物，其包含人抗TNF-α抗体或其抗原结合片段(例如阿达木单抗)、多元醇，而不添加NaCl，其量足以配制抗体用于治疗用途。本发明还提供了液体制剂，其包含人抗TNF-α抗体或其抗原结合片段，处于约 5.0 - 6. 4的pH，和在标准M小时搅拌应力测定后小于约60 NTU的浊度，而不添加NaCl (例如约 20、21、22、23、24、25、26、27、28、四、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、 43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62 或 63 NTU)。在另一个方面，本发明提供了液体制剂，其包含人抗TNF-α抗体或其抗原结合片段，处于约5.0 -6. 4的ρΗ，和在标准48小时搅拌应力测定后小于约100 NTU的浊度，而不添加NaCl (例如约 35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、 60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、 85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100 NTU)。在另外一个方面，本发明提供了液体制剂，其包含人抗TNF-α抗体或其抗原结合片段，处于约5.0 - 6.4的？礼和在5°C、25°C或40°C 3个月贮存后小于约40 NTU的浊度，而不添加NaCl(例如约20、21、22、 23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、
1448、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60 NTU)。本发明的制剂的特征是包括大于20 mg/mL浓度的多元醇例如糖醇。在一个实施方案中，多元醇是山梨糖醇或甘露糖醇。应当指出山梨糖醇或甘露糖醇对蛋白质溶液的添加不总是与蛋白质稳定性中的增加相关。例如，当在热应力或界面应力条件过程中评估时， 山梨糖醇不提供针对猪生长激素沉淀的优点-分别与Tween 20和羟丙基-β-环糊精形成对比(Charman 等人(1993) Pharm Res. 10 (7) 954-62)。在一个实施方案中，在本发明的制剂中使用的合适多元醇是糖醇，例如甘露糖醇或山梨糖醇。包含多元醇的本发明的液体制剂一般包含超过约20 mg的多元醇。在一个实施方案中，制剂包含超过约30 mg/mL的多元醇。在另一个实施方案中，制剂包含超过约40 mg/mL的多元醇。在另一个实施方案中，制剂包含约40-45 mg/mL的多元醇，例如约35、36、 37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54 或 55 mg/mL。此外，预期包括使用任何上述值的组合作为上和/或下限的值范围。在本发明的一些实施方案中，制备包含在pH缓冲溶液中的抗体的液体制剂。本发明的缓冲液具有范围为约4 -约8的pH，优选约4.5 -约7.0，更优选约4.5 -约6.0，甚至更加优选约4. 8 -约5. 5，并且最优选具有约5.0 -约6.4的pH。在一个实施方案中， 本发明的制剂的PH是约5. 2。在另一个实施方案中，本发明的制剂的pH是约6.0。对于上述PH中间的范围也预期是本发明的部分(例如4. 5,4. 6,4. 7,4. 8,4. 9,5. 0,5. 1,5. 2,5. 3、 5. 4,5. 5,5. 6,5. 7,5. 8,5. 9,6. 0,6. 1,6. 2,6. 3,6. 4)。预期包括使用任何上述值的组合作为上和/或下限的值范围，例如5. 2 - 5.8。将控制pH在这个范围内的缓冲液的例子包括磷酸盐、乙酸盐(例如乙酸钠)、琥珀酸盐(例如琥珀酸钠)、葡糖酸盐、谷氨酸、组氨酸、柠檬酸盐和其他有机酸缓冲液。在本发明的特定实施方案中，制剂包含含有柠檬酸盐和/或磷酸盐以维持PH在约 5.0 -约6. 4的范围中的缓冲系统。在一个实施方案中，制剂的pH是约5.2。在另一个实施方案中，制剂的PH是约6.0。在另一个优选实施方案中，缓冲系统包括柠檬酸一水合物、柠檬酸钠、磷酸氢二钠二水合物和/或磷酸二氢钠二水合物。在进一步优选的实施方案中，缓冲系统包括约 1. 15-1. 45 mg/ml 柠檬酸(例如约 1. 15,1. 20,1. 25,1. 30,1. 35,1. 40 或 1. 45)、约 0. 2-0. 4 mg/mL脱水柠檬酸钠(例如约0. 2,0. 25,0. 3,0. 35或0. 4)、约1. 35-1. 75 mg/mL脱水磷酸氢二钠(例如 1. 35、1. 40、1. 45、1. 50、1. 55、1. 60、1. 65、1. 70 或 1. 75)、约 0. 75-0. 95 mg/mL 脱水磷酸二氢钠(例如约0. 75,0. 80、0. 85、0. 9或0. 95)。对于上述浓度中间的值和范围也预期是本发明的部分。此外，预期包括使用任何上述值的组合作为上和/或下限的值范围，例如1. 20-1. 40 mg/mL。在其他实施方案中，缓冲系统包括1. 30-1. 31 mg/mL柠檬酸(例如约1. 305 mg/ mL)。在另一个实施方案中，缓冲系统包括约0. 27-0. 33 mg/mL脱水柠檬酸钠(例如约0. 305 mg/mL)。在一个实施方案中，缓冲系统包括约1. 5-1. 56 mg/mL脱水磷酸氢二钠(例如约1. 53 mg/mL)。在另一个实施方案中，缓冲系统包括约0.83-0. 89 mg/mL磷酸二氢钠二水合物(例如约 0. 86 mg/mL)。去污剂或表面活性剂也可以添加到本发明的抗体制剂中。示例性去污剂包括非离子去污剂例如聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯20、80等)或泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)。添加的去污剂的量是这样的，从而使得它减少配制的抗体的聚集和/或使制剂中的微粒形成降到最低和/或减少吸附。在本发明的优选实施方案中，制剂包括其为聚山梨醇酯的表面活性剂。在本发明的另一个优选实施方案中，制剂含有去污剂聚山梨醇酯80。在一个优选实施方案中，制剂含有约0. 1 -约2. 0 mg/mL聚山梨醇酯80，例如约1 mg/mL。对于上述浓度中间的值和范围也预期是本发明的部分，例如0. 2,0. 3,0. 4,0. 5、 0. 6,0. 7,0. 8,0. 9、1、1· 1,1. 2,1. 3,1. 4,1. 5,1. 6,1. 7,1. 8,1. 9。此外，预期包括使用任何上述值的组合作为上和/或下限的值范围，例如0.3 - 1.1 mg/mL。在一个实施方案中，本发明的制剂基本上由至少约100 mg/mL浓度的人TNF α抗体或其抗原结合部分、表面活性剂(例如聚山梨醇酯80)、多元醇例如(例如超过20 mg/mL 山梨糖醇或甘露糖醇)、和缓冲系统(例如柠檬酸一水合物、柠檬酸钠、磷酸氢二钠二水合物和/或磷酸二氢钠二水合物)组成，并且不含有NaCl。在一个实施方案中，制剂含有上文鉴定的试剂(即至少约100 mg/mL浓度的抗体、 缓冲系统、多元醇和表面活性剂，不含NaCl)，并且基本上不含防腐剂例如苯甲醇、酚、间甲酚、氯代丁醇和苯索氯铵Cl。在另一个实施方案中，防腐剂可以包括在制剂中。一种或多种其他药学可接受的载体、赋形剂或稳定剂例如Remington’ s Pharmaceutical Sciences第 16版，0sol，A. Ed. (1980)中描述的那些可以包括在制剂中，条件是它们不会显著不利地影响制剂的所需特征。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在采用的剂量和浓度对于接受者是无毒的，并且包括；另外的缓冲剂；共溶剂；抗氧化剂包括抗坏血酸和甲硫氨酸；螯合剂例如EDTA ；金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物);生物可降解的聚合物例如聚酯；和/或成盐抗衡离子例如钠。本文的制剂还可以与如对于待治疗的特定适应症所必需的一种或多种其他治疗剂组合，优选具有不会不利地影响制剂的抗体的互补活性的那些。此种治疗剂以对于预期目的有效的量适当地存在于组合中。可以与本发明的制剂组合的另外治疗剂在美国专利号 6，090，382和6，258，562中进一步描述，所述专利各自引入本文作为参考。待用于体内施用的制剂必须是无菌的。这通过在制剂制备前或后经过无菌滤过膜过滤容易地完成。如上所述，本发明的液体制剂具有有利的稳定性和贮存性质。液体制剂的稳定性不取决于贮存形式，并且包括但不限于冷冻、冻干、喷雾干燥的制剂，或活性成分悬浮于其中的制剂。稳定性可以在所选温度测量所选时间段。在本发明的一个方面，液体制剂中的蛋白质以液体形式稳定至少约3个月；至少约4个月、至少约5个月；至少约6个月；至少约 12个月；至少约18个月。对于上述时间段中间的值和范围也预期是本发明的部分，例如约 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23 或约 24 个月。此外，预期包括使用任何上述值的组合作为上和/或下限的值范围。优选地，制剂在室温(约30°C)或 40°C稳定至少约1个月和/或在约2-8°C稳定至少约1年，或更优选在约2-8°C稳定至少约 2年。此外，制剂优选在制剂的冷冻(至例如_80°C )和融化后是稳定的，下文称为“冻/融循环”。液体制剂中蛋白质的稳定性还可以定义为制剂中蛋白质的单体、聚集体或其片段或组合的百分比。如果在颜色和/或透明度的视觉检查后，或如通过UV光散射或通过尺寸排阻层析测量的，蛋白质基本上未显示聚集、沉淀和/或变性的征兆，那么它在制剂中“保持其物理稳定性”。在本发明的一个方面，稳定液体制剂是具有小于约10%且优选小于约 5%在制剂中作为聚集体存在的蛋白质的制剂。在一个实施方案中，液体制剂的物理稳定性通过测定在搅拌应力测定，例如M小时或48小时搅拌应力测定后制剂的浊度进行测定。例如，搅拌应力测定可以通过下述执行将合适体积的液体制剂置于具有磁搅拌器例如(多点(multipoint)HP，550 rpm)的烧杯中，在任何合适时间例如在T0-T48 (小时)取出等分试样，并且根据需要对等分试样执行合适测定。在相同条件下但不含搅拌的制剂样品充当对照。浊度测量可以使用来自Hach (德国)的实验室浊度测量系统执行，并且报道为比浊法单位(NTU)。本发明的液体制剂还具有有利的可容许性(tolerability)性质。可容许性使用疼痛直观模拟标尺(VAS)基于受试者察觉到的注射位点疼痛评估进行评价。(VAS)是当其范围跨越值的连续区例如从无到极度量的疼痛时测量疼痛的测量仪器。在操作上VAS是水平线，长度约100 mm，通过数字和/或词描述符例如0或10、或‘无疼痛’或‘极痛’固定，任选伴随在极端之间的另外词或数字描述符，例如轻度、中度和重度； 或 1 到 9)(参见例如，Lee JS，等人(2000) Acad Emerg Med 7:550)。可以测量的可容许性的另外指示物包括例如Draize Scale (出血、瘀点、红斑、水肿、瘙痒)和擦伤。III.用于在本发明的制剂中使用的抗体
可以在本发明的制剂中使用的抗体是针对抗原TNF-α包括人TNF-α (或hTNF-α)的抗体。在一个实施方案中，本发明的特征在于分离的人抗体或其抗原结合部分，其以高亲和力和低解离速率与人TNF-α结合，并且还具有高中和能力。优选地，在本发明中使用的人抗体是重组、中和人抗hTNF-α抗体。本发明的最优选的重组、中和抗体在本文中称为D2E7，也称为HUMIRA 或阿达木单抗(D2E7 VL区的氨基酸序列显示于SEQ ID NO :1中； D2E7 VH区的氨基酸序列显示于SEQ ID NO :2中)。D2E7 (阿达木单抗/ HUMIRA )的性质已在Salfeld等人，美国专利号6，090，382,6, 258，562和6，509，015中描述，所述专利各自引入本文作为参考。在一个实施方案中，人TNF-α或其抗原结合部分以1 χ 10_8 M或更少的Kd和1 χ 10-3 s-1或更少的Koff速率常数与人TNF-α解离，两者都通过表面等离振子共振测定， 并且在标准体外测定中以1 χ 10-7 M或更少的IC50中和人TNF-α细胞毒性。更优选地，分离的人抗体或其抗原结合部分以5 χ 10-4 s-1或更少的KofT，或甚至更加优选地以1 χ 10-4 s-1或更少的KofT与人TNF-α解离。更优选地，分离的人抗体或其抗原结合部分在标准体外测定中以1 χ 10-8 M或更少的IC50，甚至更加优选地以1 χ 10-9 M 或更少的IC50且更加优选地以1 χ 10-10 M或更少的IC50中和人TNF-α细胞毒性。在优选实施方案中，抗体是分离的人重组抗体或其抗原结合部分。本领域众所周知抗体重和轻链CDR3结构域在抗体对于抗原的结合特异性/亲和力中起重要作用。因此，在另一个方面，本发明涉及通过施用人抗体治疗Crohn氏病，所述人抗体对于与hTNF-α的结合具有慢解离动力学，并且具有在结构上等同于D2E7的那些或与D2E7的那些相关的轻和重链⑶R3结构域。D2E7 VL⑶R3的位置9可以由Ala或Thr占据，而基本上不影响Koff。因此，关于D2E7 VL⑶R3的共有基序包含氨基酸序列 Q-R-Y-N-R-A-P-Y- (T/A) (SEQ ID NO :3)。另外，D2E7 VH CDR3 的位置 12 可以由 Tyr 或 Asn占据，而基本上不影响Koff。因此，关于D2E7 VH⑶R3的共有基序包含氨基酸序列 V-S-Y-L-S-T-A-S-S-L-D- (Y/N) (SEQ ID NO :4)。此外，如美国专利号 6，090，382 的实施例2中证实的，D2E7重和轻链的⑶R3结构域可适合于由单个丙氨酸残基的取代(在VL⑶R3 内的位置1、4、5、7或8上或在VH CDR3内的位置2、3、4、5、6、8、9、10或11上)，而基本上不影响Koff。再进一步地，技术人员将认识到，已知D2E7 VL和VH⑶R3结构域对通过丙氨酸取代的适应性，在CDR3结构域内其他氨基酸的取代可以是可能的，同时仍保持抗体的低解离速率常数，特别是由保守氨基酸的取代。优选地，在D2E7 VL和/或VH CDR3结构域内进行不超过1 - 5个保守氨基酸取代。更优选地，在D2E7 VL和/或VH⑶R3结构域内进行不超过1 - 3个保守氨基酸取代。另外，保守氨基酸取代不应在对于与hTNF α结合关键的氨基酸位置上进行。D2E7 VL⑶R3的位置2和5以及D2E7 VH⑶R3的位置1和7看起来对于与hTNFa的相互作用是关键的，并且因此保守氨基酸取代优选不在这些位置上进行(尽管在D2E7 VL⑶R3的位置5上的丙氨酸取代是可接受的，如上所述)(参见美国专利号 6，090，382)。因此，在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合部分优选含有下述特征
a)如通过表面等离振子共振测定的，以1χ 10-3 s-1或更少的KofT速率常数与人 TNF α解离；
b)具有包含SEQID N0:3，或通过在位置1、4、5、7或8上的单个丙氨酸取代，或通过在位置1、3、4、6、7、8和/或9上的1 - 5个保守氨基酸取代由SEQ ID NO 3修饰的氨基酸序列的轻链CDR3结构域；
c)具有包含SEQID N0:4，或通过在位置2、3、4、5、6、8、9、10或11上的单个丙氨酸取代，或通过在位置2、3、4、5、6、8、9、10、11和/或12上的1 - 5个保守氨基酸取代由SEQ ID NO 4修饰的氨基酸序列的重链⑶R3结构域。更优选地，人抗体或其抗原结合部分以5 χ 10-4 s-1或更少的Koff与人TNF α解离。甚至更加优选地，人抗体或其抗原结合部分以1 χ 10-4 s-1或更少的KofT与人TNF α解离。在另外一个实施方案中，抗体或其抗原结合部分优选含有轻链可变区(LCVR)且具有重链可变区(HCVR)，所述LCVR具有包含SEQ ID NO :3，或通过在位置1、4、5、7或8上的单个丙氨酸取代由SEQ ID NO :3修饰的氨基酸序列的⑶R3结构域，所述HCVR具有包含SEQ ID NO :4，或通过在位置2、3、4、5、6、8、9、10或11上的单个丙氨酸取代由SEQ ID Ν0:4修饰的氨基酸序列的⑶R3结构域。优选地，LCVR进一步具有包含SEQ ID NO 5的氨基酸序列的⑶R2结构域(即D2E7 VL⑶R2)，并且HCVR进一步具有包含SEQ ID NO :6的氨基酸序列的⑶R2结构域(即D2E7 VH⑶R2)。甚至更加优选地，LCVR进一步具有包含SEQ ID NO 7 的氨基酸序列的⑶Rl结构域(即D2E7 VL⑶Rl )，并且HCVR具有包含SEQ ID NO :8的氨基酸序列的⑶Rl结构域(即D2E7 VH⑶R1)。关于VL的构架区优选来自V κ I人种系家族，更优选来自Α20人种系Vk基因，并且最优选来自美国专利号6，090, 382的图IA和IB中所示的D2E7 VL构架序列。关于VH的构架区优选来自VH3人种系家族，更优选来自DP-31人种系VH基因，并且最优选来自美国专利号6，090, 382的图2Α和2Β中所示的D2E7 VH构架序列。因此，在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合部分优选含有包含SEQ ID N0:1的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)(即D2E7 VL)和包含SEQ ID NO :2的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)(即D2E7 VH)0在某些实施方案中，抗体包含重链恒定区，例如IgGl、IgG2、 IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区。优选地，重链恒定区是IgGl重链恒定区或IgG4 重链恒定区。此外，抗体可以包含轻链恒定区，κ轻链恒定区或λ轻链恒定区。优选地， 抗体包含κ轻链恒定区。可替代地，抗体部分可以是例如Fab片段或单链Fv片段。在另外其他实施方案中，本发明包括含有D2E7相关VL和VH⑶R3结构域的分离的人抗体或其抗原结合部分的用途。例如，抗体或其抗原结合部分具有轻链可变区(LCVR)或具有重链可变区(HCVR)，所述轻链可变区(LCVR)具有包含选自SEQ ID NO :3、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO :12、SEQ ID NO :13、SEQ ID NO :14、SEQ ID NO :15、SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :17、SEQ ID NO :18、SEQ ID NO :19、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO 25 和 SEQ ID NO 26 的氨基酸序列的 CDR3 结构域， 所述重链可变区(HCVR)具有包含选自 SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :27、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :29,SEQ ID NO :30、SEQ ID NO :31、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO :33、SEQ ID NO :34 禾口 SEQ ID NO 35的氨基酸序列的⑶R3结构域。在本发明的方法和组合物中使用的抗体或抗体部分可以通过免疫球蛋白轻和重链基因在宿主细胞中的重组表达而制备。为了重组表达抗体，用携带DNA片段的一种或多种重组表达载体转染宿主细胞，所述DNA片段编码抗体的免疫球蛋白轻和重链，从而使得轻和重链在宿主细胞中表达，并且优选分泌到宿主细胞在其中培养的培养基内，从所述培养基中可以回收抗体。标准重组DNA方法用于获得抗体重和轻链基因，将这些基因掺入重组表达载体内，并且将载体引入宿主细胞内，例如Sambrook，Fritsch和Maniatis (编辑)， Molecular Cloning ；A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor,N. Y., (1989), Ausubel, F. M.等人(编辑)Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989)和Boss等人的美国专利号4，816，397中描述的那些。为了表达阿达木单抗(D2E7)或阿达木单抗(D2E7)相关抗体，首先获得编码轻和重链可变区的DNA片段。这些DNAs可以使用聚合酶链反应(PCR)通过种系轻和重链可变序列的扩增和修饰获得。关于人重和轻链可变区基因的种系DNA序列是本领域已知的(参见例如,“Vbase”人种系序列数据库；还参见Kabat，Ε. A.，等人(1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U. S. Department of Health and Human Services,NIH Publication No. 91—3242 ；Tomlinson, I. M.，等人(1992)"The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops" J. Mol. Biol. 227:776-798 ；和 Cox，J. P. L.等人 (1994) "A Directory of Human Germ-line V78 Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol. 24:827-836 ；所述参考文献各自的内容特别引入本文作为参考)。为了获得编码D2E7或D2E7相关抗体的重链可变区的DNA片段，通过标准PCR扩增人种系VH基因的VH3家族成员。最优选地，扩增DP-31 VH种系序列。为了获得编码D2E7 或D2E7相关抗体的轻链可变区的DNA片段，通过标准PCR扩增人种系VL基因的V κ I家族成员。最优选地，扩增Α20 VL种系序列。适合于在扩增DP-31种系VH和Α20种系VL序列中使用的PCR引物可以使用标准方法基于上文引用的参考文献中公开的核苷酸序列进行设计。一旦获得了种系VH和VL片段，这些序列就可以进行突变以编码本文公开的D2E7 或D2E7相关氨基酸序列。由种系VH和VL DNA序列编码的氨基酸序列首先与D2E7或D2E7 相关VH和VL氨基酸序列进行比较，以鉴定D2E7或D2E7相关序列中与种系不同的氨基酸残基。随后，种系DNA序列的合适核苷酸这样突变，从而使得突变的种系序列编码D2E7或 D2E7相关氨基酸序列，其中使用遗传密码以测定应进行哪些核苷酸改变。种系序列的诱变通过标准方法执行，例如PCR介导的诱变(其中将突变的核苷酸掺入PCR引物内，从而使得 PCR产物包含突变)或位点定向诱变。此外，应当注意如果通过PCR扩增获得的“种系”序列编码构架区中与真实种系构型的氨基酸差异(即与真实种系序列相比较在扩增的序列中的差异，例如由于体细胞突变)，可能希望将这些氨基酸差异改变回到真实种系序列(即构架残基到种系构型的“回复突变”)。一旦获得了编码D2E7或D2E7相关VH和VL区段的DNA片段(例如通过种系VH和 VL基因的扩增和诱变，如上所述)，这些DNA片段就可以通过标准重组DNA技术进一步操作， 例如以将可变区基因转变为全长抗体链基因，Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中， 编码VL或VH的DNA片段与编码另一种蛋白质例如抗体恒定区或柔性接头的另一个DNA片段可操作地连接。如这个背景中使用的，术语“可操作地连接的”意指2个DNA片段这样连接，从而使得由2个DNA片段编码的氨基酸序列保持符合读框。通过使编码VH的DNA与编码重链恒定区(CHI、CH2和CH3)的另一个DNA分子可操作地连接，可以使编码VH区的分离的DNA转变为全长重链基因。人重链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如，Kabat，Ε. A.，等人(1991) kquences of Proteins of Immunological Interest,第5版，U. S. Department of Health and Human Services,NIH