抗肿瘤的多药耐药rna干扰药物制作方法

韩忠朝, 彭智

2004年2月25日

2003年7月8日

2003年7月8日

中国医学科学院血液学研究所

A61P35/00GK1476899SQ0313037

多药 rna 耐药 抗肿瘤 干扰 药物

1.一种抗肿瘤的多药耐药RNA干扰药物，针对多药耐药基因mdr-1及其表达蛋白进行靶点治疗，具有靶向性抗肿瘤细胞多药耐药mdr-1基因和P-糖蛋白表达及功能，其特征是干扰RNA序列是针对mdr-1基因mRNA不同位点选取的3段21个碱基的siRNA序列，称之为si-mdr1、si-mdr2和si-mdr3，所述RNA干扰药物为si-mdr1、si-mdr2、si-mdr3三条核苷酸序列中的任意一种、两种或三种的组合，si-mdr1、si-mdr2、si-mdr3三条核苷酸序列为si-mdr1 CUGUACUGGUCCAUACGGAUUUUGACAUGACCAGGUAUGCCUsi-mdr2 CGCCGAGGCUAUGUACCAAUUUUGCGGCUCCGAUACAUGGUUsi-mdr3 CCUCCGGUUGUAUGUACGGUUUUGGAGGCCAACAUACAUGCC2.根据权利要求1所述的抗肿瘤的多药耐药RNA干扰药物，其特征是所述的si-mdr1、si-mdr2、si-mdr3的靶位点为si-mdr1的靶位点5’-AAGACAUGACCAGGUAUGCCU-3’----(865-885)si-mdr2的靶位点5’-AAGCGGCTCCGATACATGGTT-3’----(2472-2492)si-mdr3的靶位点5’-AAGGAGGCCAACATACATGCC-3’----(3564-3584)3.根据权利要求1所述的抗肿瘤的多药耐药RNA干扰药物，其特征是给药途径可采用直接裸DNA注射法、脂质体包裹DNA直接注射法、金包被DNA基因枪轰击法、繁殖缺陷细菌携带质粒DNA法中的一种

本发明涉及抗肿瘤的药物，尤其是抗肿瘤的多药耐药RNA干扰药物RNA干扰(RNA interference，RNAi)是新近发展起来的一种封闭基因表达的有效方法它采用与目的基因同源的21-23核苷酸长的干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)转染至靶细胞，与细胞内的内切酶形成诱导沉默复合体(RISC)，RISC以siRNA为模板特异地识别其同源基因mRNA并对其进行递进式剪切，形成强有效的瀑布效应，诱导序列特异性的mRNA降解，细胞表现特定基因的缺陷表型该策略可以将癌症基因关闭，而仅有一个碱基突变则丧失RNA干扰作用，对正常细胞影响甚微，特异性强为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是一种抗肿瘤的多药耐药RNA干扰药物，针对多药耐药基因mdr-1及其表达蛋白进行靶点治疗，具有靶向性抗肿瘤细胞多药耐药mdr-1基因和P-糖蛋白表达及功能，干扰RNA序列是针对mdr-1基因mRNA不同位点选取的3段21个碱基的siRNA序列，称之为si-mdr1、si-mdr2和si-mdr3，所述RNA干扰药物为si-mdr1、si-mdr2、si-mdr3三条核苷酸序列中的任意一种、两种或三种的组合，si-mdr1、si-mdr2、si-mdr3三条核苷酸序列为si-mdr1CUGUACUGGUCCAUACGGAUUUUGACAUGACCAGGUAUGCCUsi-mdr2CGCCGAGGCUAUGUACCAAUUUUGCGGCUCCGAUACAUGGUUsi-mdr3CCUCCGGUUGUAUGUACGGUUUUGGAGGCCAACAUACAUGCC所述的si-mdr1、si-mdr2、si-mdr3的靶位点为si-mdr1的靶位点5’-AAGACAUGACCAGGUAUGCCU-3’----(865-885)si-mdr2的靶位点5’-AAGCGGCTCCGATACATGGTT-3’----(2472-2492)si-mdr3的靶位点5’-AAGGAGGCCAACATACATGCC-3’----(3564-3584)给药途径可采用直接裸DNA注射法、脂质体包裹DNA直接注射法、金包被DNA基因枪轰击法、繁殖缺陷细菌携带质粒DNA法中的一种本发明研制的siRNA能有效抑制多药耐药基因MDR-1的表达，为RNAi技术应用于白血病的治疗提供了实验证据和有效新药图2是本发明siRNA处理对P-gp表达的影响的结果图中，1si-neg组；2si-mdr1组；3si-mdr2组；4si-mdr3组；5PCR阴性对照本发明所涉及的siRNA序列是针对mdr-1基因mRNA不同位点选取的3段21个碱基的siRNA序列，称之为si-mdr1、si-mdr2和si-mdr3另设随机序列作为阴性对照(si-neg)siRNA序列如下si-mdr1的靶位点5’-AAGACAUGACCAGGUAUGCCU-3’----(865-885)s-mdr1CUGUACUGGUCCAUACGGAUUUUGACAUGACCAGGUAUGCCUsi-mdr2的靶位点5’-AAGCGGCTCCGATACATGGTT-3’----(2472-2492)si-mdr2 CGCCGAGGCUAUGUACCAAUUUUGCGGCUCCGAUACAUGGUUsi-mdr3的靶位点5’-AAGGAGGCCAACATACATGCC-3’----(3564-3584)si-mdr3 CCUCCGGUUGUAUGUACGGUUUUGGAGGCCAACAUACAUGCCsi-neg 5’-AATAGGATACGTGACGCTATG-3’UCCUAUGCACUGCGAUACUUUUAGGAUACGUGACGCUAUG本发明所用的K562/A02细胞系是耐阿霉素(ADM)红白血病的细胞系细胞接种于含10％的小牛血清的RPMI1640(Gibco BRL公司产品)培养液，置于37℃、体积分数为5％的CO2培养箱中常规培养，实验前无药培养两周优化转染条件，分别将si-mdr1、si-mdr2、si-mdr3、si-neg以200nmol的终浓度加入K562/A02细胞培养液，于孵育后24～48h收获细胞进行检测本发明从mRNA和蛋白质水平二个层次来检测si-mdr1、si-mdr2和si-mdr3抑制多药耐药基因表达以及提高耐药白血病细胞对化疗药物的敏感性的作用mRNA的检测采用RT-PCR和PCR产物定量分析技术路线1)RT-PCR按TRIzol总RNA抽提试剂盒提取总RNA电泳鉴定RNA的质量，紫外光分光光度计定量取总RNA 2.5μg，加入50μl逆转录反应体系，用SuperScriptTMII逆转录试剂盒(购自Invitrogen公司)，按说明书操作进行逆转录PCR反应体系按常规(试剂购自Invitrogen公司)循环条件94℃变性45秒，58℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，最后延伸10分钟另以β-actin的扩增产物为内参对照扩增引物序列及扩增片段如下mdr-1上游引物5‘-TTACACGTGGTTGGAAGC-3’下游引物5‘-CATAGATCAGCAGGAAAG-3’，扩增片段300bpβ-actin 上游引物5-’GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’下游引物5’-CTCCTTAATGTCACGCACGATTC-3’，扩增片段548bpPCR产物定量取10μl的扩增产物在15g/L的琼脂糖凝胶电泳上进行电泳，以PCR mark(华美公司)作为分子质量标准，电压100V，20分钟溴化乙锭染色，紫外反射仪上显像、照相用扫描分析进行目的基因的半定量(以mdr-1/β-actin cDNA的比值反映mdr-1 mRNA的表达水平)多药耐药基因mdr-1表达水平的检测采用流式细胞术，检测P-gp的表达收集48h的各组K562/A02细胞，PBS洗涤2次，加入P-gp单抗10μl(Neomarkers公司产品)，4℃，30分钟；PBS洗涤，加FITC标记的二抗，4℃，30分钟PBS洗涤，上机检测本发明采用MTT检测阿霉素对药物处理白血病细胞和对照K562细胞的半数抑制剂量IC50，用相对逆转效率为评价指标，相对逆转效率＝(IC50A-IC50B)/(IC50A-IC50C)IC50A是K562/A02的IC50，IC50B是siRNA作用后的IC50，IC50C是K562的IC50；抵抗因子RF＝K562/A02的IC50/K562的IC50本发明还用流式细胞仪检测细胞内柔红霉素积累的测定，将经RNAi处理的细胞调成1×106/ml与1g/ml的柔红霉素共同孵育于37℃，1小时后取出，冰浴以终止柔红霉素的作用用流式细胞仪检测细胞内柔红霉素激发的荧光强度，来反映DNR在细胞内的浓度，激发波长488nm，发射波长550nm用未经处理的K562/A02细胞为空白对照针对mdr-1基因及其蛋白进行靶点治疗是国内外白血病多药耐药逆转研究的热点，现在常用的逆转剂维拉帕米、环胞菌素A等在有效逆转耐药时的浓度对人体产生严重不良反应，限制了其临床应用由于本发明使用的RNAi有高度的序列专一性，可以特异地使特定基因沉默，获得功能丧失或降低突变，因此无论是在功能基因组研究，还是肿瘤的基因治疗方面均具有广阔的应用前景本发明根据Elbashir等的siRNA user guide设计原则，针对mdr-1基因不同靶位点设计了3条干扰siRNA序列，用以逆转白血病多药耐药细胞株的MDRK562/A02是具有典型多药耐药特征的慢性粒细胞白血病急变细胞系，高表达mdr-1基因IC50、细胞内药物浓度、p170表达及mRNA相对量检测证实3条序列能不同程度的封闭mdr-1基因，逆转细胞耐药表型这些发明证实siRNA可望成为逆转肿瘤耐药的有效手段发明的siRNA可以单独使用或几条siRNA联合，还可以与其它逆转剂如反义核酸联合制成药物组合物，用于白血病和其它肿瘤的治疗上述基因序列的给药途径，可使用的方法有以下几种1、直接裸DNA注射法(1)新喷气注射系统释放裸DNA治疗序列，可以采用一种新的喷气注射系统，将裸DNA释放到体内的肺肿瘤中沃尔瑟(W.Walther)博士和同事开发了一种便携的“高速喷气注射器”系统，在病毒媒介和脂质体基因释放系统之外提供了又一选择研究者使用这种系统注射3段裸DNA到小鼠的Lewis肺肿瘤中，第一个质粒表达β-半乳糖激酶基因(LacZ)，第二个表达绿荧光(GFP)基因，第三个表达人类肿瘤坏死因子-α(TNF-α)每个小鼠都接受5次注射，压力为3Pa，释放3～5微升质粒DNA沃尔瑟博士等在《基因治疗》(Gene Therapy)报告说，注射后肿瘤上的基因呈广泛表达LacZ和GFP基因表达在注射后48小时变得明显，在72～96小时达到峰值；LacZ表达和TNF-α分泌在24～120小时出现他们认为，“这些发现证明了喷气注射的适用性，即在体内传送基因到肿瘤时使用最小剂量的裸DNA进行癌症基因治疗”(2)裸DNA直接注射将裸质粒DNA直接注射到机体的肌肉、皮内、皮下、粘膜、静脉内这种方法简单易行2、脂质体包裹DNA直接注射法包裹DNA的脂质体能与组织细胞发生膜融合，而将DNA摄入，减少了核酸酶对DNA的破坏注射途径同裸DNA直接注射3、金包被DNA基因枪轰击法将质粒DNA包被在金微粒子表面，用基因枪使包被DNA的金微粒子高速穿入组织细胞4、繁殖缺陷细菌携带质粒DNA法选择一种容易进入某组织器官的细菌，将其繁殖基因去掉，然后用质粒DNA转化细菌，当这些细菌进入某组织器官后，由于不能繁殖，则自身裂解而释放出质粒DNA即可口服的减毒沙门氏菌实施例1.RNAi对耐药基因mdr-1 mRNA表达的情况K562/A02细胞经siRNA处理24h后检测，与阴性对照相比，si-mdr1组mRNA表达下调(17.23±2.47)％(p＞0.05)，si-mdr2和si-mdr3处理24小时后检测mdr-1的mRNA表达明显减少，分别为(38±1.23)％和(58±1.54)％(p＜0.05)，见