专利名称：利用重组过氧化物酶A4-Prx脱毒玉米酒糟生产饲料的方法饲料和食品霉变是全世界普遍存在的问题，据联合国粮农组织(FAO) 2002年资料，全世界每年约有25%的农作物粮食被霉菌毒素污染，而我国平均毎年由于霉变所引起的饲料损失占总产量的10%以上，最主要的霉变来源于铼刀菌产生的ー种雌激素类真菌毒素玉米赤霉纟布丽(ZEA) ο ZEA性质稳定难降解，玉米及其副产品极易受ZEA污染。王金荣等对玉米DDGS(酒糟蛋白饲料)多个样品调查结果显示，ZEA的阳性检出率均为100%，ZEA含量范围为4. 79 1219. 90 μ g/kg，超出国家标准(玉米中ZEA含量彡60 μ g/kg) 5 20倍以上，其对DDGS为饲料的禽畜危害深远(王金荣，马鹏，黄亚宽，等.2010年上半年DDGS常规养分含量差异及霉菌毒素污染状况调查[J].饲料エ业，2011，32 (17) :61-64.)。生物转化脱毒ZEA技术能避免物理和化学方法的去毒效果有限、营养物质损失大、成本高和有害物质残留等缺点，已成为研究热点和主要趋势。日本Takahashi-Ando等人对粉红粘帚霉(Clonostachys rosea)的研究较为全面,分离出的内酯水解酶zhdlOl可破坏ZEA结构，使其转化为雌激素毒性较弱的化合物，且ZEA的降解率在80°/Γ90%之丨、日」(Kimara M, Naoko T, Nisniu-chi T. MolecularBiology and Biotechnology forReduction of Fusarium Mycotoxin Contamination. Pesticide Biochemistry andPhysiology, 2006, 86 (3) :117-123.)。大肠杆菌和酿酒酵母表达的重组zhdlOl表现出了内酷水解酶的能力，对ZEA的降解率可达75%，具有zhdlOl的转基因玉米也具备降解ZEA的HE力(Tomoko I, Naoko T, Noriyuki O, et ai. Reduced contamination by the fusariummycotoxin zearalenone in maizekernels through genetic modification with adetoxification gene. Applied andEnvironmental Microbiology,2007, 73(5):1622-1629.)。此外，奥地利Molnar从白蚁后肠中分离出了ー种新酵母菌一毛孢子菌属Trichosporon mycotoxinivorans,它的培养物能将ZEA降解为ニ氧化碳和其它弱紫外吸收的代谢物，从而降低其毒性(Molnar O, Schatzmayr G, Fuchs E, et al. Trichosporonmycotoxinivorans sp. nov. , a new yeast species useful in Diologicaldetoxificationof various mycotoxins. Systematic and Applied Microbiology, 2004,27:661-671. XAbdullah从玉米地里分离的假单胞菌ZEA-I可利用ZEA为唯一碳源，并且在12h内可将ZEA減少一半，编码此ZEA降解酶的基因在大肠杆菌中也获得了活性表达(AbdullaD.Altalhi, Bahig El—Deeb. Localization of zearalenone detoxificationgene(s)mpZEA—1 plasmid of Pseudomonas putida ZEA-I and expressed inEscherichia coli.JHazard Mater, 2009, 161:1166-1172.)。中国发明专利CN99101577.0公开了ー种菜籽饼发酵脱毒新方法，将菜籽饼同发酵剂(淀粉类副产品或三七糠或玉米粉或麸皮等)按ー定比例搅拌均匀，在常温20°C以上，置于发酵池(防漏防滲)内加水，水面溢出料面5厘米左右，发酵脱毒，从而得到优质饲料。本课题组成员从Acinetobacter sp. SMO4培养物上清液中分离到ー种有降解ZEA功能的过氧化物酶，克隆了其基因并在大肠杆菌E. coli BL2KDE3)中获得了活性表达(YuYuanshan, Wu Hui, Tang Yuqian, et al.しloning, Expression of aperoxiredoxin geneirom Acinetobacter sp. SMO4 and characterization of its recombinant protein forzearalenone detoxifcation[J]. Microbiol Res, 2012, 167 (3):121-126. X
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供ー种利用重组过氧化物酶A4-Prx脱毒玉米酒糟生产饲料的方法，该方法能去除玉米DDGS中高达98%的ZEA毒素。本发明的目的通过下述技术方案实现ー种利用重组过氧化物酶Α4-ΡΓΧ脱毒玉米酒糟生产饲料的方法，包括如下步骤(I)制备重组过氧化物酶液A4-Prx :将重组大肠杆菌BL21/pET31b/A4_Prx接种于LB培养基中，摇床培养至其OD6tltl值大于O. 5，添加IPTG继续诱导培养4_5h，然后离心收集细胞后洗涤、重悬，超声波破碎细胞后，离心收集上清液即为粗酶液；(2)饲料的制备将步骤(I)的粗酶液与玉米酒糟蛋白饲料(即玉米DDGS)混合，反应并烘干后得到安全的、无毒的饲料，DDGS中ZEA的降解率达98%以上；步骤(I)所述的LB培养基中含有50 μ g/mL的氨苄青霉素；步骤(I)所述的添加IPTG优选添加至IPTG的终浓度为O. 5mM ；步骤(I)所述的粗酶液中的过氧化物酶酶活大于300U/mL ；步骤(2)中，将粗酶液与玉米DDGS混合之前，每O. Ikg玉米DDGS要添加I. 5LNa2CO3水溶液，粗酶液中要添加H2O2至H2O2的终浓度为15_40mM ；步骤(2)所述的将粗酶液与玉米DDGS混合，每千克DDGS添加I. 5-2. OL粗酶液；步骤(2)所述的反应是在68_70°C下反应6_9h，所述的烘干是在45_50°C下烘干。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果采用本发明的方法，可降解DDGS中98%以上的ZEA毒素，使玉米酒糟或其他有毒饲料成为安全的饲料，实现了エ业残渣的高值化利用。图I是利用重组过氧化物酶A4_Prx处理玉米酒糟DDGS中ZEA的液相检测图；A-过氧化物酶A4-Prx酶液处理DDGS样品Oh后ZEA的液相检测图，B-过氧化物酶A4_Prx酶液处理DDGS样品9h后ZEA的液相检测图。
实施例Iー种利用重组过氧化物酶A4_Prx脱毒玉米酒糟生产饲料的方法，包括如下步骤(I)制备重组过氧化物酶液A4_Prx I.用LB固体培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，NaCl 10g/L，琼脂20g/L，pH 7. 0，50 μ g/mL氨苄青霉素)活化重组大肠杆菌BL21/pET31b/A4-Prx，放置28°C培养箱培养I天。2.从活化LB固体培养基上挑取重组大肠杆菌BL21/pET31b/A4-Prx的单菌落，接种于LB液体种子培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，NaCl 10g/L，pH 7. O, 50 μ g/mL氨苄青霉素)中，28°C、220r/min振摇培养过夜，得到种液。3.取种液10mL，接入200mL的LB液体富集培养基中(胰蛋白胨10g/L，酵母抽提 物 5g/L，NaCl 10g/L，琼脂 20g/L, pH 7. O，50 μ g/mL 氨苄青霉素)中，28°C、250r/min 振摇培养，每隔Ih取样检测其0D_ ；6h后培养液0D_值达到0. 54，添加IPTG，使其终浓度为0. 5mM，继续于 28°C、250r/min 摇床培养 4h。4.将培养液在10，OOOXg离心5min，弃上清，加入200mL 50mM的Tris-HCl缓冲液(pH8. 0)洗涤I次。添加200mL 50mM的Tris-HCl缓冲液(pH8. 0)，漩涡震荡使菌体悬浮均匀，用超声波细胞破碎仪破碎细胞(4°C，200W，15min)，10，OOOXg离心5min，收集上清液，即为粗酶液。5.粗酶液中过氧化物酶的酶活达316U/mL。过氧化物酶活测定方法如下取920 μ L 的 0. lmol/L Tris-HCl (pH 8. 0)缓冲液、20 μ L 的 0. 2mol/L 4-氨基安替吡啉水溶液、20 μ L的0. 3mol/L苯酚溶液(用甲醇溶解)、ImL粗酶液，混合均匀。放置于70°C的恒温水浴锅中保持2min后，添加20 μ L的lmol/L的双氧水启动反应。反应5min后，用紫外分光光度计测A5tltl值。用ImL LB液体富集培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，NaCl 10g/L，琼脂20g/L，pH 7· 0，50 μ g/mL氨苄青霉素)作空白对照。粗酶液中过氧化物酶酶活的计算公式为I (U/mL)=60X每分钟A5tltl的升高值/0.01 (I个过氧化物酶活性单位为实验规定的酶活力条件下，每小时吸光值A500升高0. 01个单位所需的酶量)。(2)饲料制备I.添加I. 5L 2%的Na2CO3水溶液(v/m)于0. Ikg玉米酒糟DDGS中，采用滚筒式搅拌器混合均匀。2.往150mL粗酶液中添加30%H202( g/mL)水溶液0. 17mL,使H2O2终浓度达到15mM，再添加到用处理Na2CO3后的DDGS中，30r/min拌料均匀，在68°C温育5h，45°C烘干后，取样检测DDGS中的ZEA残留，其降解率达到98. 6%，即得到安全的、无毒的饲料。检测ZEA降解率的方法如下取2g粗酶液处理后DDGS，加入2mL 0. IM Tris-HCl (pH 9. 0)及15mLこ腈，常温旋润振摇IOmin,滤纸过滤。用PuriToxSR TC-M160真菌毒素多功能净化柱过滤5mL滤液,收集流出液体3mL于60°C下N2蒸发仪蒸干后用500 μ L流动相溶解，溶解液用于高效液相色谱(HPLC)分析检测ZEA的残留量。高效液相色谱(HPLC)检测ZEA的条件色谱柱采用Waters XTerraE MS C18柱(4· 6 X 150mm, 5 μ m)。流动相为こ腈水甲醇=46 : 46 : 8。柱温30°C,流量为lmL/min。结果采用荧光检测器，激发波长274nm，发射波长450nm。设置对照组中，使用去离子水代替
酶液。结果以相对降解率表示。计算公式如下


本发明公开了一种利用重组过氧化物酶A4-Prx脱毒玉米酒糟生产饲料的方法，该方法包括如下步骤(1)制备重组过氧化物酶液A4-Prx将重组大肠杆菌BL21/pET31b/A4-Prx接种于LB培养基中，摇床培养至其OD600值大于0.5，添加IPTG继续诱导培养4-5h，然后离心收集细胞后洗涤、重悬，超声波破碎细胞后，离心收集上清液即为粗酶液；(2)饲料的制备将步骤(1)的粗酶液与玉米DDGS混合，反应并烘干后得到安全的、无毒的饲料。采用本发明的方法，可降解DDGS中98%以上的ZEA毒素，使玉米酒糟或其他有毒饲料成为安全的饲料，实现了工业残渣的高值化利用。