专利名称:具有佐剂作用的细菌膜组分的制作方法和实施例旨在举例说明本发明,而不是以任何方式限制其范围。图1FMKp辅助的BBG2Na-剂量-反应研究(血清抗G2Na IgG效价)。*p<0.05(与PBS组比较)。图2FMKp辅助的BBG2Na-抗G2Na的IgG1和IgG2a的效价。图3FMKp辅助的BBG2Na-保护研究。图4FMKp对Immugrip(流感疫苗)的佐剂作用。
*p<0.05在样品收集的同一天与未有佐剂的组(“0”)进行比较。
实施例1肺炎克氏杆菌膜组分(FMKp)的制备方法1优选在从离心沉淀中抽提肺炎克氏杆菌I145的膜之前加上如下步骤在任选地重新溶解在溶液中之后,例如通过100℃加热沉淀,破坏沉淀中获得的细胞成分的分解酶。
从该离心沉淀中将膜实际提取出来优选通过以下方式来进行在任选破坏分解酶后,用盐水溶液例如1M氯化钠处理沉淀的细胞成分一或多次,之后优选以20,000g离心获得的悬浮物,从该离心获得的上清液含有蛋白质和核酸等非膜杂质,将其除去,而沉淀含有所述膜。
与含有这些杂质的盐溶液分离后,在有蛋白水解酶,优选胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶时,于pH8的溶液中37℃消化该膜4小时。
消化后,通过超声匀浆该溶液。由此获得的产物构成称作FMKp的膜组分。
获得的上清再次在相同条件下,优选在140,000g离心。制备膜糖肽通过40,000g离心20分钟,从所获得的沉淀中制备该组分。将所述沉淀重新悬浮在生理盐水中,然后在沸水浴上100℃加热该悬浮物10分钟,以失活分解酶。冷却后,20,000g离心该介质30分钟。获得的沉淀用1M NaCl抽提两次,以除去蛋白质和核酸。通过20,000g离心30分钟回收该膜。
然后37℃在pH 8时用胰蛋白酶消化它们4小时,之后在相同条件下用胰凝乳蛋白酶消化。
然后通过2000g离心30分钟回收这些膜,用生理盐水,之后用蒸馏水洗涤,并通过超声15分钟进行破碎。方法2在+4℃融化最少48小时之后,将1kg肺炎克氏杆菌干细胞以5%干细胞的浓度重新悬浮在溶液中。加入DNase至5mg/l。然后在Manton Gaulinloop中研磨30分钟,接着在SHARPLES中以50l/h澄清,之后在pH=4.2+0.1下用乙酸沉淀30分钟。除去沉淀(SHARPLES,25l/h)并中和上清液,然后用渗透水(osmosed water)将其稀释至初体积的两倍。然后在PUF100上以高达800Ωcm进行恒定体积透析,之后将由此获得的膜悬浮物(NS)浓缩至11l/kg干细胞。然后在+121℃35分钟灭菌该MS,并于+4℃保存6个星期。FMKp的特性蛋白聚糖的量,即活性成分FMKp的量定义为半乳糖的总量和蛋白质的总量。
-半乳糖平均2.2g/l
-蛋白质平均10.5g/l。实施例2FMKp对重组蛋白质BBG2Na的佐剂作用BBG2Na是在大肠杆菌中制备的重组蛋白质。其由具有序列SEQ ID NO.4的G2Na肽,即A型呼吸道合胞病毒(RSV)G蛋白的第130位残基至第230位残基片段,和BB,即能够结合血清白蛋白的链球菌G蛋白片段,融合在一起构成的。BBG2Na是一种抗RSV疫苗(Power U.病毒学,1997,230155-166)。
BALB/C小鼠接受2次20μg BBG2Na和不同量FMKp的皮下注射。在第28天(D28)收集血液样品,以G2Na处于固相通过ELISA测定血清抗体的效价。获得的结果显示在图1中。令人惊奇的是,它们显示,FMKp显著增强了抗G2Na的IgG应答;所达到的抗G2Na的IgG效价与用明矾或弗氏佐剂诱导的相似。该作用是剂量依赖性的从5μg FMKp时可以观察到,自50ug FMKp时达到最大,100μg FMKp时保持不变。因此,对于BBG2Na,FMKp是一种潜在的佐剂。
就Th1/Th2应答而言,为了了解FMKp对免疫应答取向的影响,在按以上详述获得的血清上测定抗G2Na的IgG1和IgG2a效价。这些结果(图2)显示,令人惊奇的是,与用明矾所观察到的不同(占优势的同种型是IgG1),FMKp能够改变抗G2Na IgG1/IgG2a的比例。该分布与弗氏佐剂所诱导的接近。这说明,FMKp可以用作免疫佐剂诱导混合(Th1/Th2)型应答。
按上述方法免疫的动物经鼻腔途径接受105TCID50的RSV-A的病毒攻击。这是在最后的免疫之后三周进行的。病毒攻击后5天,处死动物并取肺以测定RSV-A的滴度。结果(图3)显示,接受FMKp辅助的BBG2Na的动物受到保护不被RSV-A攻击。
总之,FMKp使得可以使抗体应答重新取向,而又不影响保护小鼠不受到RSV-A攻击的能力。实施例3FMKp对失活病毒(流感疫苗)的佐剂作用给BALB/C小鼠单次注射0.01μg ImmugripTM(购自INAVA实验室的流感疫苗)和不同量的FMKp。这些产品是一起施用的。该注射是在第0天经皮下进行的。在第7、14和21天,收集血液样品。采用固相上2μg/mlImmugrip通过ELISA测定抗Immugrip的血清IgG抗体效价。所获结果(图4)显示,FMKp显著增加抗Immugrip的抗体效价,这从最低剂量的FMKp,即0.1μg,就出现了。该佐剂作用是剂量依赖性的。有趣的是,观察到与未接受辅助的Immugrip对照比较,FMKp的存在诱导从第7天较早地出现了抗体应答。采用参考佐剂,弗氏完全佐剂(CFA),未获得该效果。
本发明涉及革兰氏阴性菌尤其是肺炎克氏杆菌的膜组分联合抗原或半抗原在制备设计用于将免疫应答引向对抗所述抗原或半抗原的Th1和/或混合的Th1/Th2型应答的药物组合物中的用途。本发明还涉及制备所述膜组分和含有它们的药物组合物的方法,以及它们在预防和治疗感染性疾病,尤其是那些涉及副粘病毒例如VRS的感染性疾病和癌症,尤其是那些带有肿瘤相关抗原的癌症中的用途。
具有佐剂作用的细菌膜组分制作方法
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