专利名称:红豆杉免疫佐剂及含有该佐剂的流感疫苗的制作方法
为解决目前免疫佐剂单一,副作用难以避免,疫苗生产供应量有限,难以应付感染 性疾病暴发时疫苗需求量大,疫苗起效时间慢等问题,本发明提供一种能提高疫苗免疫效 果,同时带来巨大的经济效益和社会效益的红豆杉免疫佐剂。本发明的另一个目的在于提供一种含有红豆杉免疫佐剂的流感疫苗。本发明提供的红豆杉免疫佐剂是由下列质量比的组分组成的 曼迪亚红豆杉提取物 0. 001 100%载体0 99. 999%O所述载体由下列质量比的组分组成乳化剂20 70%助乳化剂20 70%油相1 50%水相1 30%。所述乳化剂为常规的TweenSO或聚氧乙烯蓖麻油中的一种,或者为质量混合比为 3 2 2 3的常规TweenSO与SpanSO的混合物,或者为质量混合比为1 1的常规聚 氧乙烯蓖麻油与SpanSO的混合物。所述助乳化剂为常规的1,2_丙二醇或聚乙二醇400中的一种。所述油相为常规的肉豆蔻酸异丙酯或油酸乙酯或注射用大豆油中的一种。所述水相为注射用水或者含有药物或疫苗成分的注射用水溶液。本发明提供的红豆杉免疫佐剂,优选下列质量比 曼迪亚红豆杉提取物 0. 1 100%载体0 99. 9%O本发明提供的一种含有红豆杉免疫佐剂的流感疫苗的组成是红豆杉免疫佐剂与 流感疫苗血凝素的质量比为76 183409,其中,所述红豆杉免疫佐剂由下列质量比的组分 组成曼迪亚红豆杉提取物 0. 001 100% 载体0 99. 999%ο所述曼迪亚红豆杉提取物是用乙醇或水作为溶剂,经现有技术的常规方法提取得到的,具体是乙醇提取将干燥的曼迪亚红豆杉枝叶粉碎成粉,置于容器内,用乙醇冷浸或温浸提 取,或者加热回流提取,过滤,取滤液,回收滤液中的乙醇,浓缩滤液得浸膏;其中,每次提取 时,乙醇的质量浓度为60 95%,乙醇加入量是曼迪亚红豆杉粉质量的2 10倍,冷浸是 在室温下浸泡1 10天,温浸是在40 60°C温度下浸泡1 2小时,提取次数为1 3 次;加热回流提取是在20 40°C温度下,回流提取1 3次,每次20分钟 4小时;水提取将干燥的曼迪亚红豆杉枝叶粉碎成粉,置于容器内,用蒸馏水冷浸或温浸提 取,或者加热煎煮提取,过滤,取滤液,浓缩滤液得浸膏;其中,每次提取时,蒸馏水的加入量 是曼迪亚红豆杉粉质量的2 10倍,冷浸是在室温下浸泡1 10天,温浸是在40 60°C 温度下浸泡1 2小时,提取次数为1 3次;加热煎煮提取是每次加热煮沸20分钟 4 小时,提取次数为1 3次。
另外,所述曼迪亚红豆杉提取物还可采用现有技术的除水提取、乙醇提取以外的 其它常规溶剂提取而得到的提取物,如采用甲醇、丙酮、乙酸乙酯等为溶剂进行的提取。
本发明提供的红豆杉免疫佐剂与传统氢氧化铝佐剂相比,具有以下优点 1)曼迪亚红豆杉提取物制备方法简单、经济、环保。
2)曼迪亚红豆杉是一种天然植物,经引种驯化后已经作为紫杉醇提取的原料使 用。曼迪亚红豆杉提取物作为免疫佐剂的应用,以流行性感冒(简称流感)病毒疫苗为例得 到了应用性的实验结果,其安全性高、副作用小。例如用含曼迪亚红豆杉提取物的流感疫苗 肌肉注射小鼠,4小时内观察小鼠活动性无明显减弱,未见全身不良反应。而用含氢氧化铝 佐剂流感疫苗注射,可观察到小鼠活动性明显减弱,注射局部肿胀明显。
3)用曼迪亚红豆杉提取物为佐剂的流感疫苗,制备方法简便,疫苗质量容易控制; 而以氢氧化铝为佐剂制备流感疫苗,制备和存储过程中,影响因素较多,对于疫苗的质量较 难控制。
4)用曼迪亚红豆杉提取物作为流感疫苗佐剂,可更好的提高疫苗免疫原性,大大 降低疫苗抗原用量。例如通过以曼迪亚红豆杉提取物为佐剂的流感疫苗和以氢氧化铝为佐 剂的流感疫苗免疫小鼠发现,以曼迪亚红豆杉提取物为佐剂使用的疫苗抗原用量仅是以氢 氧化铝为佐剂的疫苗抗原用量的一半或者更少,同样可以达到理想的免疫保护效果。
图1为不同接种组在56天内的血凝抑制抗体效价变化; 图2为不同接种组在加免后2周的血凝抑制抗体效价;图3为不同接种组在接种后7天内的体重增长情况; 图4为不同接种组在加免后2周的血凝抑制抗体效价。
下面结合实施例对本发明做进一步说明,但并不以此来限定本发明。
本发明实施例中未特别指明的组分均为市购产品,所用设备或仪器均是常规的。 实施例1曼迪亚红豆杉乙醇提取物的制备取干燥曼迪亚红豆杉枝叶50g,粉碎成粉,置于容器内,用4倍即200 ml质量浓度为70%的乙醇,按常规进行加热回流提取,其中,每次加热温 度为50°C,回流时间为60分钟,提取次数为2次,过滤后,对滤液进行减压回收乙醇后,余下 滤液经浓缩干燥后,得浸膏。
实施例2曼迪亚红豆杉水提取物的制备取干燥曼迪亚红豆杉枝叶50g,粉碎成粉,置于容器 内,用8倍即400 ml蒸馏水按常规进行加热煎煮提取,其中,每次煎煮时间为4小时,提取 次数为3次,过滤,合并滤液后,对滤液进行浓缩干燥,得浸膏。
实施例3 纳米乳剂载体的制备1)按下列质量比备料0.475g注射用水,Ig肉豆蔻酸异丙酯(IPM),Ig 1,2_丙二 醇,Ig Tween80 ;2)向混合搅拌瓶内加入IgTween80,lg 1,2-丙二醇,在转速为200转/分钟,室温条 件下,持续搅拌1 10分钟,混勻后加入Ig肉豆蔻酸异丙酯,混合均勻得混合物;3)在上述2)的混合物中滴入0.475g注射用水,同时在转速为200转/分钟,室温下, 搅拌混合物至液体为透明,得到纳米乳剂;4)对3)制得的纳米乳剂进行如下检测1.经马尔文粒径检测仪检测,粒径范围为 19. 205 24. 896nm,合格;2.经3000rpm, 15min离心分离,纳米乳剂体系不分层,合格; 3.经4°C放置50天,纳米乳剂体系无变化,合格。
实施例41)称取实施例1的曼迪亚红豆杉浸膏3.5mg,溶于IOOul无水乙醇中,制成曼迪亚红豆 杉浸膏溶液,备用;2)将上述1)制备的曼迪亚红豆杉浸膏溶液与375μ1的Η3Ν2流感病毒裂解疫苗(血凝 素含量为43. 67μδ/πι1)混合,得475μ1含曼迪亚红豆杉浸膏的流感疫苗;3)称取肉豆蔻酸异丙酯lg、l,2-丙二醇lg、TweenSOIg于搅拌瓶中,转速维持在200 转/分钟,室温搅拌1 10分钟,至充分混勻,得混合溶液;4)在上述3)的混合溶液中缓慢滴入2)制备的含曼迪亚红豆杉浸膏的流感疫苗475μ1, 同时维持转速在100转/分钟,搅拌至溶液为淡棕色透明,得到以曼迪亚红豆杉浸膏、纳米 乳剂为佐剂的流感病毒疫苗。其中曼迪亚红豆杉浸膏的质量比为0. 117%,载体质量比为 99. 883% ;曼迪亚红豆杉浸膏纳米佐剂与流感疫苗血凝素的质量比为183409。
用实施例4制备的曼迪亚红豆杉浸膏纳米乳剂流感病毒疫苗肌肉注射标准体重 昆明种雌性小鼠,每只小鼠200μ1。此200μ1注射疫苗中流感疫苗血凝素含量为0. 94μδ, 曼迪亚红豆杉浸膏0. ang。同时设立注射等量的生理盐水空白对照组、等血凝素含量的 Al (OH) 3佐剂流感疫苗的佐剂对照组、等血凝素含量的单独流感疫苗对照组。间隔3周,免 疫2次。于首次免疫后第一周开始,每隔7天采尾血,分离血清测定血凝抑制抗体效价。所 测结果显示红豆杉浸膏纳米乳剂型佐剂疫苗组血凝抑制抗体效价水平整体明显高于铝佐 剂组及单独疫苗组,具体结果见图1。
实施例51)称取实施例2的曼迪亚红豆杉浸膏7. 6mg,溶于200μ1无水乙醇中,得曼迪亚红豆杉 浸膏溶液,备用;2)将1)的曼迪亚红豆杉浸膏溶液与3.2ml市购的H3N2流感病毒裂解疫苗(血凝素含 量43. 67μδ/πι1)混合均勻,得3. 4ml含曼迪亚红豆杉浸膏的流感疫苗;
3)取1.Ig聚氧乙烯蓖 麻油,1.6g Span80, 6g 1,2-丙二醇,3g肉豆蔻酸异丙酯放于 搅拌瓶中,转速维持在200转/分钟,室温搅拌10分钟,至充分混勻,得混合溶液;
4)在3)的混合溶液中缓慢滴入2)的含曼迪亚红豆杉浸膏的流感疫苗3.4ml,同时维 持转速在200转/分钟,搅拌至溶液为黄棕色半透明,得到以曼迪亚红豆杉浸膏、纳米乳剂 载体为佐剂的流感病毒疫苗,其中曼迪亚红豆杉浸膏的质量比为0. 065%,载体质量比为 99. 935% ;曼迪亚红豆杉浸膏与流感疫苗血凝素的质量比为83779。实施例6
1)制备下列不同的佐剂或溶液
a)取实施例2的曼迪亚红豆杉浸膏0. 2 mg,溶于20ul无水乙醇,然后与120μ1生 理盐水混合,得140μ1曼迪亚红豆杉浸膏溶液,备用;
b)取浓度为15. 98 mg/ml的氢氧化铝12. 5 μ ,其中含AL(OH)3 0. 2mg,加入生理盐水 至体积为140 μ ,备用;
c)140 μ 生理盐水,备用;
d)200 μ 生理盐水,备用;
2)制备下列不同的疫苗
取血凝素含量为43. 67 μδ/πι1的市购Η3Ν2流感病毒裂解疫苗60μ1,分别和上述a、b、 c不同溶液混合,分别得到含有曼迪亚红豆杉浸膏免疫佐剂的流感疫苗样品Α、含有AL(OH)3 佐剂的流感疫苗样品B、单独的流感疫苗样品C、不加疫苗仅为生理盐水空白对照样品D。所 配置的上述A、B、C、D四个样品均制备五份,体积均为200 μ ,备用;其中含有曼迪亚红豆杉 浸膏的流感疫苗样品A中曼迪亚红豆杉浸膏的质量比为100%,载体质量比为0 % ;曼迪亚 红豆杉浸膏免疫佐剂与流感疫苗血凝素的质量比为76。3)免疫接种及检测
用上述2)所配的Α、B、C、D四个不同的样品分别免疫标准体重雌性昆明小鼠,每组5 只,每只肌肉注射200μ1,间隔3周,免疫2次。于加免后2周取尾血,分离血清测定血凝抑 制效价,所测结果显示红豆杉浸膏佐剂组血凝抑制抗体效价水平明显高于铝佐剂组及单独 疫苗组,具体结果见附图2。并于第一天接种前和接种后第8天对各组小鼠进行体重测量, 对7天内各组平均增长的体重进行计算,所测结果显示红豆杉浸膏佐剂组较之铝佐剂组及 单独疫苗组小鼠体重增长受影响最低,并与空白对照组相比,小鼠体重增长幅度反而较大, 可能是由于红豆杉浸膏本身具有一定的补益作用,具体结果见附图3。实施例7
Α、取实施例1的曼迪亚红豆杉浸膏0. 3 mg,溶于40μ1无水乙醇,再与130μ1生理盐水 混合,然后加入市购的Η3Ν2流感裂解疫苗30μ1至终体积为200 μ ,Η3Ν2流感裂解疫苗的 血凝素含量为1.3lPg,得含有曼迪亚红豆杉浸膏的流感病毒疫苗,备用;其中曼迪亚红豆 杉浸膏的质量比为100%,载体质量比为0 %;曼迪亚红豆杉浸膏佐剂与流感疫苗血凝素的 质量比为:2290B、取Η3Ν2流感裂解疫苗60 μ ,其中含血凝素2. 62μδ,与140 μ 生理盐水混合至 终体积为200 μ ,作为单独疫苗对照组,备用;C、取浓度为15.98 mg/ml的氢氧化铝佐剂12. 5 μ ,其中含OJmg AL(OH)3,与含血凝 素2. 62μδ的流感疫苗60 μ 混合,然后加入生理盐水至终体积200 μ ,作为AL (OH) 3佐剂 疫苗对照组,备用D、生理盐水200μ ,为空白对照组,备用;F、免疫接种及抗体检测将上述配好的A、B、C、D四个样品分别免疫标准体重昆明雌性小鼠,肌肉注射,每只200 μ ,每组5只,间隔3周,免疫2次,于加免后2周进行尾部采血,分离血清,检测血凝抑制抗 体效价,所测结果显示,即使红豆杉浸膏佐剂疫苗组HA (1. 31ug)含量减半的情况下产生的 血凝抑制抗体效价水平也明显高于HA含量为2. 62ug的铝佐剂组及单独疫苗组,说明红豆 杉浸膏佐剂能明显降低疫苗抗原用量,具体结果见附图4。
本发明提供一种红豆杉免疫佐剂及含有该佐剂的流感疫苗,其特征在于所述红豆杉免疫佐剂由下列质量比的组分组成曼迪亚红豆杉提取物0.001~100%,载体0~99.999%。可更好的提高疫苗免疫原性,大大降低疫苗抗原用量,以红豆杉提取物为佐剂使用的疫苗抗原用量,仅是以氢氧化铝为佐剂的疫苗抗原用量的一半或者更少,同样可以达到理想的免疫保护效果,其安全性高、副作用小,用红豆杉提取物为佐剂的流感疫苗,制备方法简便,疫苗质量容易控制。
红豆杉免疫佐剂及含有该佐剂的流感疫苗制作方法
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