专利名称：作为佐剂的霍乱全毒素的突变体形式的制作方法此为2002年6月5日的申请CN02815412.6，“作为佐剂的霍乱全毒素的突变体形式”的分案申请。发明的背景身体免疫系统激活各种攻击病原的机制(Janeway，Jr，CA.和Travers P.，编辑.，《免疫生物学》，“健康和疾病中的免疫系统”(The Immune System in Health andDisease)，第二版，Current Biology Ltd.，London，Great Britain(1996))。然而，不是所有这些机制在免疫后必须激活。免疫诱导的保护性免疫取决于免疫原性组合物引起适当免疫应答的能力，免疫应答抵抗或去除病原。这取决于病原可能需要细胞-介导和/或体液免疫应答。当许多抗原本身施用时免疫原性或非免疫原性差。对抗原的强适应免疫应答几乎总是要求抗原和佐剂一起施用，佐剂是增强免疫应答的物质(Audbert，F.M和Lise，L.D.1993 Immunology Today，14281-284)。相对于传染性生物对有效免疫过程的需要特别强烈，传染性生物引起急性感染或进入身体、肠胃、肺部、鼻咽或生殖泌尿的表面。这些区域浸没在含免疫球蛋白的粘液中，免疫球蛋白主要由分泌型免疫球蛋白IgA组成(Hanson，L.A.，1961Intl.Arch.Allergy Appl.Immunol.，18，241-267；Tomasi，T.B.和Zigelbaum，S.，1963J.Clin.Invest.42，1552-1560；Tomasi，T.B.等.，1965 J.Exptl.Med.，121，101-124)。此免疫球蛋白来源于大量的IgA-产生浆细胞，该细胞渗透粘膜下的固有层区域(Brandtzaeg，P.，和Baklein，K，1976 Scand，J.Gastroenterol.，11(Suppl.36)，1-45；Brandtzaeg，P.，1984“人鼻粘膜和扁桃体在健康和疾病中的免疫功能”(ImmuneFunctions of Human Nasal Mucosa and Tonsils in Health and Disease)，28页以及下列等，《肺和上呼吸道的免疫学》(Immunology of the Lung and Upper RespiratoryTract)，Bienenstock，J.，编辑，McGraw-Hill，New York，NY)。分泌型免疫球蛋白IgA通过分泌成分的作用特异运送至腔表面(Solari，R，和Kraehenbuhl，J-P，1985Immunol.Today，6，17-20)。肠胃外免疫通常在诱导分泌型IgA应答中无效。分泌免疫最常通过直接免疫粘膜相关淋巴组织来获得。它们在一个粘膜部位诱导后，IgA-产生浆细胞的前体溢出并散布到不同粘膜组织，在粘膜组织中最终分化成高速IgA合成(Crabbe，P.A.，等.，1969 J.Exptl.Med.，130，723-744；Bazin，H.，等.，1970 J.Immunol.105，1049-1051；Craig，S.W.，和Cebra，J.J.，1971 J.Exptl.Med.，134，188-200)。大量研究证明粘膜免疫诱导此共同粘膜免疫系统的可行性(Mestecky，J.，等.，1978 J.Clin.Invest.，61，731-737)，但极少的例外，获得有效免疫所需的大剂量抗原使此方法对于纯化的抗原不实际。研究克服此问题的策略是使用粘膜佐剂。一些增强抗原免疫应答的佐剂在现有技术中已知(Elson，C.O.和Ealding，W.，1984 J.Immunol.132，2736-2741)。这些佐剂与抗原混合时产生抗原颗粒，有助于在体内更长时间段维持抗原，从而促进巨噬细胞吸收增加并增强免疫应答。然而许多佐剂引起的不利反应或它们在诱导粘膜免疫中的无效使开发更好佐剂用于传递免疫原性组合物成为必要。遗憾的是，迄今佐剂开发主要是根据经验的操作(Janeway，Jr.，等.，上面引用的12-25到12-35页)。因此需要合理和更直接方法以开发有效佐剂用于传递抗原组合物。已报导革兰氏-阴性细菌霍乱弧菌(Vibrio cholerae)(V.cholerae)分泌的毒素是肠胃疾病霍乱的病因，它作为佐剂极有效。已报导霍乱毒素(CT)为382个氨基酸序列(SEQ ID NO1)(Mekalanos，J.J.，等.，1983 Nature，306，551-557)，有18个氨基酸信号(SEQ ID NO1的氨基酸1到18)。霍乱毒素全毒素分子是名为CT-A肽亚基(SEQ IDNO2或SEQ ID NO1的氨基酸19到258)组成的六异聚(hexaheteromeric)复合体，它产生毒素的酶活性，五个各名为CT-B(每个有21个氨基酸信号(SEQ ID NO1的氨基酸259到379)，接着是CT-B肽亚基(SEQ ID NO1的氨基酸280-382)的相同肽亚基参与毒素结合到肠上皮细胞以及表面含神经节苷脂GM1的其它细胞(Gill，D.M.，1976 Biochem.，15，1242-1248； Cuatrecasas，P.，1973 Biochem.，12，3558-3566)。霍乱弧菌(CT)产生的CT在单个二硫键环内成熟CT-A(SEQ ID NO2)的氨基酸位置187和199的半胱氨酸之间有蛋白酶解切割的CT-A亚基以产生酶活性A1多肽(Kassis，S.，等.，1982 J.Biol.Chem.，257，12148-12152)和较小的多肽A2，A2连接片段A1到CT-B五聚体(Mekalanos，J.J.，等.，1979 J.Biol.Chem.，254，5855-5861)。当酶活性片段CT-A1产生的毒性进入肠细胞时，ADP核糖基化调节G蛋白(Gsα)。这引起腺苷酸环化酶的组成性活化，使cAMP的细胞内浓度增加，流体分泌且电解液进入小肠腔，从而引起毒性(Gill，D.M.，和Meren，R.，1978Proc.Natul.Acad.Sci.，USA，75，3050-3054)。在体外，CT的ADP-核糖基转移酶活性被称为ARFs的辅助蛋白的存在刺激，已知GTP-结合蛋白参与真核细胞内小泡运输(Welsh，C.F.，等.，“ADP-核糖基化因子活化霍乱毒素并调节小泡运输的鸟嘌呤核苷酸-结合蛋白家族”(ADP-Ribosylation FactorsA Family of Guanine Nucleotide-Binding Proteins that Activate Cholera Toxin and Regulate Vesicular Transport)，《天然毒素手册疾病中的细菌毒素和毒性因子》第8卷(Handbook of NaturalToxinsBacterial Toxins and Virulence Factors in Disease Vol.8)第257-280页(Moss，J.，等.，编辑.，Marcel Dekker，Inc.，New York，NY(1995))。已报导与不相关抗原共施用CT导致同时循环的诱导和粘膜抗体对该抗原的应答(Mekalanos，J.J.，等.，1983 Nature，306，551-557)。为使人中野生型CT引起的不良症状如腹泻减少到最低程度，优选使用显著降低毒性的CT全毒素形式作为佐剂。CT突变体建议作为获得更有用佐剂的方式。合理设计显著降低毒性的突变霍乱毒素全毒素(CT-CRMs)的一种方法是鉴定和改变毒素分子中的氨基酸残基，它们在霍乱(CT)家族和相关大肠杆菌(E.Coli)的不耐热肠毒素(LT-I、LT-IIa和LT-IIb)中完全保守。产生显著降低毒性的突变CT-CRMs的另一种合理方法是改变全毒素分子中的氨基酸残基，它们被鉴定为对在CT骨架结构排列基础上的NAD-结合与具有ADP-核糖基转移酶活性如白喉毒素(DT)和百日咳毒素(PT)的相关毒素的骨架重要，(Holmes，R.K，“不耐热肠毒素(大肠杆菌)”(Heat-labile enterotoxins(Escherichiacoli)，《蛋白毒素及其在细胞生物中使用的指南》(Guidebook to Protein Toxins andtheir Use in Cell Biology)，Montecucco，C.和 Rappnoli，R.，编辑，OxfordUniv.Press，Oxford，England(1997)；Holmes，R.K.等，“革兰氏阴性菌的霍乱毒素和相关肠毒素”，《天然毒素手册疾病中的细菌毒素和毒性因子》第8卷，第225-256页，Moss，J.，等.，编辑.，Marcel Dekker，Inc.，New York，NY 1995)。最近，揭示了合理设计、遗传-解毒的CT突变体，其中通过改变A亚基中29位上的氨基酸(名为CT-CRME29H)导入单个非保守氨基酸取代(谷氨酸到组氨酸)。所得突变体霍乱全毒素显示显著降低的酶毒性，但有较好的佐剂和免疫原性性质(国际专利出版号WO 00/18434，全部纳入本文作为参考)。因此，需要鉴定和/或合理设计显著降低毒性的CT全毒素的另外突变体形式，但仍具有与所述野生型CT全毒素相同或增强的佐剂性质。
发明的概述一方面，本发明提供霍乱全毒素(CT-CRMs)的新突变体、免疫原性形式，与所述野生型CT相比，毒性显著降低但保持它们作为免疫系统强有力刺激物的能力。具体的是，本发明涉及四种突变体霍乱全毒素(CT-CRMs)，最好是由定点诱变产生且与所述野生型CT相比，毒性显著降低但没有丧失佐剂性质。
在一个实施方案中，本发明的新CT-CRM包括CT亚基A的氨基酸序列或其片段，其中A亚基的氨基酸16位上的氨基酸残基由另一个氨基酸取代，取代导致毒性显著降低。在本发明较佳实施方案中，A亚基的氨基酸16位上的氨基酸异亮氨酸由丙氨酸取代。为确定氨基酸位置，CT-A序列作为SEQ ID NO2中的例子。然而也可使用CT-a的其它变体和片段。
在另一个实施方案中，本发明的新CT-CRM包括CT亚基A的氨基酸序列或其片段，其中A亚基的氨基酸72位上的氨基酸残基由另一个氨基酸取代，取代导致毒性显著降低。在本发明较佳实施方案中，A亚基的氨基酸72位上的氨基酸缬氨酸由酪氨酸取代。
在又一个实施方案中，本发明的新免疫原性突变CT-CRM显著降低CT毒性并包括CT的亚基A的氨基酸序列或其片段，其中A亚基的氨基酸16位和68位上的氨基酸残基都由与所述野生型CT的氨基酸16位和68位上存在的不同氨基酸取代，取代导致毒性显著降低。在本发明较佳实施方案中，在A亚基的氨基酸16位上氨基酸丙氨酸取代异亮氨酸，在A亚基的氨基酸68位上氨基酸酪氨酸取代丝氨酸。
在另外一个实施方案中，本发明的新免疫原性突变CT-CRM显著降低CT毒性并包括CT的亚基A的氨基酸序列或其片段，其中A亚基的氨基酸68位和72位上的氨基酸残基都由与所述野生型CT的氨基酸68位和72位上存在的不同氨基酸取代，取代导致毒性显著降低。在本发明较佳实施方案中，在A亚基的氨基酸68位上氨基酸酪氨酸取代丝氨酸，在A亚基的氨基酸72位上氨基酸酪氨酸取代缬氨酸。
另一方面，发明提供了上述产生新CT-CRMs的方法，用常规技术定点突变编码野生型CT中A亚基的DNA，这样诱变的CT现在毒性显著降低而没有损害毒素刺激免疫应答的能力。
发明的又一方面中，提供的免疫原性组合物包括选择的抗原、上述作为佐剂在脊椎动物宿主中增强对抗原免疫应答的突变CT-CRM、药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体。优选的是，CT-CRM用于在脊椎动物宿主中产生或提高对选择抗原的全身和/或粘膜抗原免疫应答。选择抗原可以是来自致病病毒细菌、真菌或寄生虫的多肽、肽或片段。选择抗原可以是来自癌细胞或肿瘤细胞的多肽、肽或片段。选择抗原可以是来自变应原的多肽、肽或片段以干扰IgE产生来缓和对变应原的变应性反应。选择抗原可以是来自其分子部分的多肽、肽或片段，此部分代表宿主(自身分子)以不需要的方式、量或位置产生，如来自淀粉样前体蛋白，从而防止或治疗脊椎动物宿主中以淀粉样沉积为特征的疾病。
另外一方面，本发明提供了使用这些CT-CRMs作为免疫原性组合物中佐剂的方法或提高含上述选择抗原的抗原组合物引起脊椎动物宿主中免疫应答的能力的方法，这是通过包括有效佐剂量的一个或多个上述新的解毒突变霍乱全毒素(CT-CRMs)。
发明的进一步方面中，提供了编码上述显著降低毒性的新免疫原性突变CT-CRMs的DNA序列。优选的是，DNA序列编码毒性降低的突变A亚基和亚基B。另外，DNA序列只可编码毒性降低的突变体A亚基，其中突变CT-A与其它结合域融合，或用LT-B共表达并可共装配。
发明的又一方面中，提供了含分离和纯化DNA序列的质粒，包括编码本文所述免疫原性、解毒、突变霍乱全毒素的DNA序列，其中这种DNA序列操作连接于指导宿主细胞中CT-CRM表达的调节序列。调节序列优选包括阿拉伯糖可诱导启动子。在此方面的一个实施方案中，发明涉及名为pLP903的质粒，含分离和纯化DNA序列，包括编码显著降低毒性的免疫原性突变CT-CRM的DNA序列，其中在A亚基的氨基酸16位上氨基酸丙氨酸取代异亮氨酸。在此方面的第二个实施方案中，发明涉及名为pLP905的质粒，含分离和纯化DNA序列，包括编码显著降低毒性的免疫原性突变CT-CRM的DNA序列，其中在A亚基的氨基酸72位上氨基酸酪氨酸取代缬氨酸。在此方面的第三个实施方案中，发明涉及名为pLP904的质粒，含分离和纯化DNA序列，包括编码显著降低毒性的免疫原性突变CT-CRM的DNA序列，其中在A亚基的氨基酸16位上氨基酸丙氨酸取代异亮氨酸，且在氨基酸68位上氨基酸酪氨酸取代丝氨酸。在此方面的其它实施方案中，发明涉及名为pLP906的质粒，含分离和纯化DNA序列，包括编码显著降低毒性的免疫原性突变CT-CRM的DNA序列，其中在A亚基的氨基酸68位上氨基酸酪氨酸取代丝氨酸，在氨基酸72位上氨基酸酪氨酸取代缬氨酸。
发明的另一方面中，提供了合适的宿主细胞系，用本文所述质粒转化、感染、转导或转染。免疫原性、解毒、突变霍乱全毒素是通过用上述一个质粒转化、感染、转导或转染合适的宿主细胞并在允许所述显著降低毒性的重组免疫原性、突变体霍乱全毒素蛋白的宿主细胞表达的培养条件下培养宿主细胞产生的。
发明的这些和其它方面对于读过下列发明详细描述的本领域技术人员是显而易见的。
发明的详细描述霍乱全毒素的突变体形式表现出毒性降低，但保持它们较多佐剂性质和这些CTs的突变体形式作为本文所述免疫原性组合物中的佐剂使用。
A.突变体、解毒的霍乱毒素全毒素与野生型CT相比，本发明的新突变体、解毒免疫原形式的霍乱毒素全毒素(CT-CRMs)的特征为毒性显著降低。然而这种CT-CRMs保持它们作为免疫系统强有力刺激物的能力。本发明的CT-CRMs特征为在霍乱毒素的CT-A亚基中一个或几个氨基酸取代。本发明的多种突变CT-A亚基也保持它们与CT-B亚基装配形成突变CT全毒素的能力，突变CT全毒素在佐剂性上类似野生型CT，但与野生型CT相比毒性显著降低。本发明的CT-CRMs可使用与所述野生型CT-B亚基相关的突变或改变的CT-A亚基以产生功能性的全毒素。另外，本发明的CT-CRMs可包括与改变或突变CT-B亚基相关的改变或突变CT-A亚基。
为确定描述本发明CT-CRMs中氨基酸取代位置的氨基酸位置号，成熟CT-A序列作为SEQ ID NO2的例子，即野生型CT序列SEQ ID NO1的氨基酸19-258。编码霍乱全毒素A亚基的核苷酸序列列于国际专利出版号WO 93/13202。类似的，合适的成熟CT-B序列可由SEQ ID NO1的氨基酸280-382阐明。然而，霍乱弧菌CT-A和CT-B的其它变体、生物型和片段也可用作含本文所述氨基酸取代的序列。参见例如ELTOR生物型，C.Shi等，1993生物化学杂志，9(4)395-399；NCBI基因座数据库号AAC34728和霍乱弧菌毒素变体的其它来源。
优选的是，本发明的CT-CRMs中的氨基酸取代来自用具类似结构和/或化学性质的其它氨基酸取代一个氨基酸，即保守氨基酸取代。“保守”氨基酸取代可在有关残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两性性质的相似性基础上进行。例如，非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；极性/中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；正电荷(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；负电荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。本发明由CT-CRMs作为例子，如表1总结，它们在氨基酸16位或氨基酸72位上有单个氨基酸取代或氨基酸16位和68位或68位和72位上有双重氨基酸取代。
表1单个和双重CT-CRM突变体
因此，在一个实施方案中，本发明的新CT-CRM包括CT亚基A的氨基酸序列或其片段，其中A亚基的氨基酸16位上的氨基酸残基由另一个氨基酸取代，取代导致毒性显著降低。在本发明的一个较佳实施方案中，A亚基的氨基酸16位上的氨基酸异亮氨酸由丙氨酸取代。此CT-CRMI16A显示较好的佐剂性质。
在另一个实施方案中，本发明的新CT-CRM包括CT亚基A的氨基酸序列或其片段，其中A亚基的氨基酸72位上的氨基酸残基由另一个氨基酸取代，取代导致毒性显著降低。在本发明的一个较佳实施方案中，A亚基的氨基酸72位上的氨基酸缬氨酸由酪氨酸取代，产生CT-CRMV72Y。此CT-CRMV72Y显示较多的佐剂性质。
在又一个实施方案中，本发明的新免疫原性突变CT-CRM显著降低CT毒性并包括CT亚基A的氨基酸序列或其片段，其中A亚基的氨基酸16位和68的氨基酸残基都由与所述野生型CT的氨基酸16位和68位上存在的不同氨基酸取代，取代导致毒性显著降低。在本发明的一个较佳实施方案中，A亚基的氨基酸16位上的氨基酸丙氨酸取代异亮氨酸，A亚基的氨基酸68位上的氨基酸酪氨酸取代丝氨酸，产生CT-CRMI16A，S68Y。此CT-CRMI16A，S68Y显示较好的佐剂性质。
在另外一个实施方案中，本发明的新免疫原性突变CT-CRM显著降低CT毒性并包括CT亚基A的氨基酸序列或其片段，其中A亚基的氨基酸68位和72位上的氨基酸残基都由与所述野生型CT的氨基酸68位和72位上存在的不同氨基酸取代，取代导致毒性显著降低。在本发明的一个较佳实施方案中，A亚基的氨基酸68位上的氨基酸酪氨酸取代丝氨酸，A亚基的氨基酸72位上的氨基酸酪氨酸取代缬氨酸。此CT-CRMS68Y，V72Y显示较好的佐剂性质。
评估表1中新CT-CRMs对CT结构和功能的表型效果。通过定点诱变CT-编码基因产生的突变A亚基在亚基B存在时也能装配到免疫反应性的全毒素中，这由非-变性凝胶电泳分析确定(参见表3，实施例2)。各突变全毒素也在Y-1肾上腺肿瘤细胞试验中测试以确定其与野生型CT全毒素比较的剩余毒性(参见表4和5，实施例3)。表4所示结果证明突变CT-CRMs与所述野生型霍乱全毒素相比毒性显著降低。有单个和双重氨基酸取代的CT-CRMs的剩余毒性与所述野生型CT相比显著降低。
各突变CT-CRMs也与ADP-核糖基转移酶活性试验中的野生型CT相比(参见实施例4)。结果一般与Y-1肾上腺细胞试验中的毒性数据一致，表明多种CT-CRMs的ADP-核糖基转移酶活性与所述野生型CT相比显著减小(表6)。具有最大ADP-核糖基转移酶活性的突变体似乎是双重突变体CT-CRMI16A，S68Y。此活性仅约为野生型CT的3.3％。CT-CRMs、CT-CRMV72Y、CT-CRMI16A和CT-CRMS68Y，V72Y的酶活性分别为野生型CT活性的1.1％、2.4％和1.2％。
本发明的其它CT-CRM可包含上述至少一个或双重突变和除了一个或多个上列氨基酸残基16、68或72位的位置上至少一个附加的突变。纳入本文作为参考的国际专利出版号WO 93/13202描述一系列CT-A亚基的突变，突变用于减少霍乱全毒素的毒性。这些突变包括取代氨基酸7位的精氨酸、9位的天冬氨酸、11位的精氨酸、29位的谷氨酸、44位的组氨酸、53位的缬氨酸、54位的精氨酸、61位的丝氨酸、63位的丝氨酸、70位的组氨酸、97位的缬氨酸、104位的酪氨酸、106位的脯氨酸、107位的组氨酸、110位的谷氨酸、112位的谷氨酸、114位的丝氨酸、127位的色氨酸、146位的精氨酸和192位的精氨酸。纳入本文作为参考的国际专利出版号WO 98/42375描述在A亚基的氨基酸109位上取代丝氨酸，用来减少霍乱全毒素的毒性。
用于本发明的其它有用的CT-CRM突变蛋白包括具有一个或多个上面提供的特异性突变的全长全毒素、多肽或其含上述诱变残基的片段，蛋白、多肽或片段保持来源于野生型CT的佐剂活性，但有毒性降低的特征。
这些酶活性减少的CT-CRMs免疫活性片段也可用于在本发明的方法和组合物。片段通常包含至少约25个CT-CRM蛋白的毗连氨基酸，蛋白含上述诱变位点。更具代表性的CT-CRM片段包含至少约75个毗连氨基酸。其它CT-CRM片段含至少约100个毗连氨基酸。CT-CRM亚基A的另外实施方案包含至少约150个毗连氨基酸长度。
本文所述CT-CRMs片段如果产生或增强脊椎动物宿主中对选择抗原的免疫应答，它在下述方法和组合物中有用。片段包括CT-CRMs的羧基末端区域截短。例如，截短为仅含CT-A突变亚基的CT-CRM是理想的片段。类似地，在约残基240或250上截短的CT-A亚基是理想的片段。可选择本发明的CT-CRMs的其它片段。CT-CRM全毒素的另外片段可包含少于五个CT-B亚基的重复或截短的CT-B亚基。前述片段也可包含一个或多个上述特异性突变。
其它合适的CT-CRM蛋白可包括一个或多个含取代基团的氨基酸残基。另一合适的CT-CRM全毒素蛋白是其中CT-CRM多肽与其它化合物融合，如增加多肽半衰期的化合物(例如聚乙二醇)。又一合适的CT-CRM蛋白是其中其它氨基酸融合到多肽中，如前导序列或分泌序列或用来提高CT-CRM蛋白的免疫原性的序列。CT-CRMs的其它修饰包括缺失上述CT-A信号或CT的N末端的前导序列，即SEQ ID No1的氨基酸1-18，和/或在SEQ ID No.1氨基酸259-279上缺失CT-B信号或前导序列，和/或缺失其它不影响免疫原性的区域。类似地，修饰本文所述CT-CRMs包括用另外信号或前导序列取代信号或前导序列。参见如纳入本文参考文献的美国专利号5,780,601。
合适的CT-CRM蛋白的另一个例子是其中任选氨基酸(如-Gly-Ser-)或其它氨基酸或化学化合物间隔子可包括在多肽末端用于连接多种全毒素蛋白在一起或连接到载体。例如，有用的CT-CRMs可包括一个或多个上述偶联到载体蛋白的CT-CRMs。另外，有用的CT-CRM可存在于含多种CT-CRMs的融合蛋白中，任选地偶联到载体蛋白。
对于这些实施方案，载体蛋白理想是可提高选择的CT-CRM免疫原性的蛋白或其它分子。这种载体可以是也有佐剂效果的较大分子。示范性常规蛋白载体包括但不限于，大肠杆菌DnaK蛋白、半乳糖激酶(GalK，催化细菌中半乳糖代谢的第一步)、泛素、α-交配因子、β-半乳糖苷酶和流感NS-1蛋白。类毒素(即编码天然产生的毒素的序列，具有充分修饰以去除其毒性)也可用作载体，如白喉类毒素和破伤风类毒素、它们各自的毒素和这些蛋白的任何突变体形式如CRM197(白喉毒素的一种非毒性形式，参见美国专利号5,614,382)。其它载体包括铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的外毒素A、大肠杆菌的不耐热毒素和轮状病毒颗粒(包括轮状病毒和VP6颗粒)。另外，可使用载体蛋白或其它免疫原性蛋白的片段或抗原表位。例如，半抗原可偶联到细菌毒素的T细胞抗原表位。参见美国专利号5,784,973。类似地可使用多种细菌热激蛋白，如分枝杆菌hsp-70。谷胱甘肽-S-转移酶(GST)是另一种有用载体。本领域技术人员可选择一种适当载体用于此方面。融合蛋白可通过标准技术形成用于偶联蛋白质物质。融合可从融合基因构建物表达，构建物由下述重组DNA技术制备。
本文所述其它合适的CT-CRMs可不同于具体例示的CT-CRMs，这是通过不恢复酶毒性、不减少佐剂活性的修饰或这些特征的组合。例如可进行保守氨基酸变化，尽管它们改变CT-CRM蛋白的主要序列，但一般不改变其功能。在作出这些变化中，可考虑氨基酸的亲水指标。亲水氨基酸指标在赋予多肽相互作用生物功能中的重要性一般在本领域中了解(Kyte&Doolittle，1982 J.Mol.Biol.，157(1)105-132)。已知某些氨基酸可取代其它有类似亲水指标或分数的氨基酸，并仍导致有相似生物活性的多肽。各氨基酸在其疏水性和电荷特性基础上确定亲水指标。那些指标是异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
相信氨基酸残基的相对亲水特性确定所得多肽的二级和三级结构，从而明确多肽与其它分子的相互作用，如酶、底物、受体、抗体、抗原等。在本领域已知氨基酸可由另一个具类似亲水指标的氨基酸取代且仍获得功能相当的多肽。在这些电荷中，取代氨基酸的亲水指标优选在+/-2内，尤其优选在+/-1内，更尤其优选在+/-0.5内。
取代相似氨基酸也可在亲水性基础上进行，具体是生物功能相当的多肽或因此产生的肽用于免疫学实施方案。纳入本文作为参考的美国专利号4,554,101指明由相邻氨基酸的亲水性决定的多肽最大局部平均亲水性与其免疫原性和抗原性相关，即与多肽生物性质相关。
如美国专利号4,554,101中详述，下列亲水性值分配给氨基酸残基精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；脯氨酸(-0.5±1)；苏氨酸(-0.4)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。据说氨基酸可取代具类似亲水性值的另外氨基酸，且仍获得生物学相当具体是免疫学相当多肽。在这些变化中，优选取代亲水性值在±2内的氨基酸，尤其优选在+/-1内，更尤其优选在+/-0.5内。
如上概括，氨基酸取代一般以氨基酸侧链取代的相对类似性为基础，例如它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑各种前述特征的示范性取代对本领域技术人员熟知并包括精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；缬氨酸；亮氨酸和异亮氨酸。
此外，一般不改变CT-CRM蛋白主要序列的修饰包括多肽的体内或体外化学衍生化，如乙酰化、甲基化或羧化。同样包括作为本发明的CT-CRMs是糖基化修饰的蛋白，如通过在合成和加工或进一步加工步骤中修饰多肽的糖基化模式制成；或通过使多肽暴露于影响糖基化的酶制成，如哺乳动物糖基化酶或去糖基化酶。也包括作为CT-CRMs的是上面鉴定有磷酸化氨基酸残基的突诱变序列，如磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸。
同样包括作为本发明CT-CRMs的是用普通分子生物技术修饰的上述序列，以便改进它们耐分解蛋白的降解或最优化溶解性质。在这些CT-CRMs中包括那些含除了天然产生的L-氨基酸外的残基，如D-氨基酸或非天然产生合成氨基酸。可存在于本发明CT-CRMs中的其它已知修饰没有限制，是酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、共价附着黄素、共价附着血红素部分、共价附着核苷酸或核苷酸衍生物、共价附着脂质或脂质衍生物、共价附着磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol)、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、形成共价交联、形成胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰化、γ-羧化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、豆寇酰化、氧化、蛋白水解加工、异戊二烯化、外消旋化、硒基化(senenoylation)、硫化、转移-RNA介导的氨基酸加入蛋白质如精氨酰化和泛素化。
因此本发明突变CT-CRMs是全毒素并表现出毒性降低或比野生型CT毒性显著小。如本文所用，术语和短语“全毒素降低毒性”或“毒性显著减小”或等等指本发明CT-CRM突变体与野生型CT相比显示每单位纯化的毒素蛋白较低毒性，如本文所述四种CT-CRM突变体(CT-CRMI16A、CT-CRMV72Y、CT-CRMI16A，S68Y和CT-CRMS68Y，V72Y)。此“降低的毒性”使各突变体能用作免疫原性组合物中的佐剂而不引起显著副作用，特别是那些已知与CT相关的副作用如腹泻。如下面更详细描述，本发明突变CT-CRMs在Y-1小鼠肾上腺细胞试验中表现出显著低于野生型CT的毒性水平，且与所述野生型CT比较ADP-核糖基转移酶活性显著降低。
根据本发明的免疫原性突变CT-CRMs表现毒性降低和保持佐剂活性的平衡，这样所得突变CT蛋白在其导入的脊椎动物宿主中安全地耐受时作为佐剂发挥功能。如以下例子所示，鼠模型试验系统中的结果表明本文所示突变CT-CRMs能在鼻内施用不同抗原后显著增强粘膜和全身免疫应答。此外，即使存在先存在的抗-CT免疫应答，突变体CT-CRMs能用作有效的粘膜佐剂。支持本发明CT-CRMs的这些特征的研究在下面总结，并在实施例中更具体说明。
为评估突变CT-CRMs作为组合物粘膜佐剂的效率，组合物含包括在免疫原性组合物中鉴定作为候选物的细菌或病毒抗原，检测了三种不同模型抗原系统(1)非典型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)(NTHi)的重组P4外膜蛋白(也称为蛋白“e”(rP4))(参见美国专利号5,601,831)，(2)粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)的天然UspA2外膜蛋白(国际专利出版号WO 98/28333)，(3)呼吸道合胞病毒(RSV)的天然融合糖蛋白(F蛋白)(参见美国专利号5,223,254)。突变CT-CRMs作为NTHirP4的佐剂与CT-CRME29H和野生型CT互相比较。在第一个研究中，评估突变CT-CRMI16A提高全身和粘膜抗体对rP4诱导的佐剂活性能力，并与所述野生型CT和CT-CRME29H相比。结果表明CT-CRMI16A像野生型CT和CT-CRME29H，增加rP4蛋白引起全身和体液免疫应答的能力(参见表8和9)。例如第三次IN免疫后六周，用CT-CRMI16A或CT-CRME29H制成的rP4蛋白免疫小鼠的抗rP4 IgG抗体滴定度比单独PBS中用重组蛋白免疫的小鼠大40倍。初次IN免疫六周后，施用重组蛋白加1μg浓度野生型CT全毒素的小鼠抗体滴定度(IgG)比单独在盐水中施用重组rP4的小鼠抗体滴定度提高67倍。用1μg突变体CT-CRME29H免疫小鼠的抗体滴定度比单独用rP4免疫小鼠的抗体滴定度提高48倍。相比之下，用1μg和0.1μg突变体CT-CRMI16A免疫小鼠的抗体滴定度分别比盐水中单独用rP4免疫小鼠的抗rP4抗体滴定度增加15倍和27倍。
第三次免疫后两周检测粘膜分泌中蛋白-特异抗体进一步表明，CT-CRMI16A促进产生局部免疫应答抗rP4蛋白。此外，抗rP4抗体滴定度可与所述野生型CT佐剂免疫原性组合物诱导的相比(表9)。
为测试及比较含1μg重组rP4和1μg突变CT-CRMs(CT-CRMI16A、CT-CRMI16A，S68Y、CT-CRMV72Y和CT-CRMS68Y，V72Y)的制剂和含1μg rP4和1μg CT-CRME29H或盐水中单独1μg rP4的制剂中突变CT-CRMs的佐剂效果。多种组合物鼻内传送给雌性BALB/c小鼠，并在3和5周以及第5周第六天测量抗rP4 IgG和IgA滴定度。数据表明CT-CRMs、CT-CRMI16A和CT-CRMV72Y在诱导全身以及粘膜抗rP4抗体反应中与CT-CRM一样有效(表10和11)。含rP4和CT-CRMI16A制剂诱导的抗rP4抗体的血清IgG滴定度在第5周第六天比rP4单独诱导大22倍，且是CT-CRME29H诱导IgG水平的一半。然而，含rP4和CT-CRMV72Y制剂诱导的抗rP4抗体的血清IgG滴定度比CT-CRME29H诱导大1.2倍，且比rP4单独诱导大53倍。尽管CT-CRMI16A，S68Y和CT-CRMS68Y，V72Y诱导的rP4-特异IgG滴定度仅约为CT-CRMI16A和CT-CRMV72Y诱导的五分之一，这些水平仍显著高于盐水中单独rP4诱导。
用CT-CRMs、CT-CRMI16A、CT-CRMI16A，S68Y、CT-CRMV72Y和CT-CRMS68Y，V72Y免疫小鼠血清中的蛋白-特异IgA抗体滴定度比单独用rP4免疫IN小鼠大6到23倍。
用CT-CRMs、CT-CRMI16A、CT-CRMI16A，S68Y、CT-CRMV72Y和CT-CRMS68Y，V72Y免疫小鼠的支气管肺泡洗液、鼻洗液、唾液和阴道洗液中的蛋白-特异IgA抗体滴定度可与用CT-CRME29H免疫小鼠的粘膜洗液收集中的IgA水平相比，但显著大于单独用rP4免疫的小鼠(见表11)。
在以上研究中，也评估了六组中各单独小鼠血清中的抗rP4抗体滴定度。具体是，IN施用后41天，IgA和包括IgG亚类IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3的IgG终点滴定度通过ELISA确定。结果表明，在接受含rP4和四种突变体CT-CRMs之一的制剂的各单独小鼠中IgA和IgG亚类滴定度显著高于仅接受盐水中rP4抗原的动物中IgA和IgG滴定度(见表12-17)。结果进一步表明，在接受rP4和突变体CT-CRMs、CT-CRMI16A、CT-CRMI16A，S68Y和CT-CRMV72Y之一的动物中IgA和IgG滴定度可与接受rP4加上CT-CRME29H小鼠中检测到的IgA和IgG滴定度相比。
本发明CT-CRMs增加全身和粘膜免疫应答抗呼吸道合胞病毒(RSV)糖蛋白的能力用纯化的天然融合(F)蛋白检测。先前证明用CT或CT-CRME29H辅助的F蛋白免疫IN的BALB/c小鼠产生全身和局部IgG和IgA滴定度，(Tebbey等，上面引用)。此研究也表明前-存在抗CT抗体对局部或全身抗F蛋白IgA和IgG抗体的水平没有副作用。确实，研究表明，先存在的抗CT抗体有益于产生增强的抗F蛋白抗体反应。另外，数据也显示包括通过IN免疫操作应答中刺激的粘膜或体液免疫球蛋白，免疫操作含F/CT-CRME29H。在本研究中，盐水或制剂中单独的纯化F蛋白(3μg/剂量)中和感染性病毒的机制IN施用给BALB/c小鼠，制剂含0.1或1μg野生型CT或者0.1或1μg突变体CT-CRMs(CT-CRME29H、CT-CRMI16A、CT-CRMI16A，S68Y、CT-CRMV72Y和CT-CRMS68Y，V72Y)之一。确定小鼠的支气管肺泡洗液、鼻洗液和阴道洗液中的蛋白-特异IgG和IgA抗体滴定度。用1μg CT-CRMI16A、CT-CRMI16A，S68Y、CT-CRMV72Y或CT-CRMS68Y，V72Y免疫小鼠的支气管肺泡洗液、鼻洗液和阴道洗液中的蛋白-特异IgG和IgA抗体滴定度可与用所述野生型CT或CT-CRME29H免疫小鼠的粘膜洗液收集中的IgG和IgA水平相比(见表19)。用0.1μg CT-CRMI16A、CT-CRMI16A，S68Y、CT-CRMV72Y或CT-CRMS68Y，V72Y免疫小鼠中粘膜蛋白-特异IgG水平尽管显著高于用盐水中F蛋白免疫小鼠中检测到的水平，仍比用1μg CT-CRMs免疫小鼠中检测到的水平低三分之一到十分之一。相反，粘膜洗液中IgA水平显著提高仅在用1μg突变CT-CRMs免疫小鼠中观察到。
检测了突变CT-CRMs增强小鼠中全身和粘膜免疫应答抗粘膜炎莫拉氏菌的天然UspA2外膜蛋白的能力。10μl盐水或10μl制剂中单独的纯化UspA2(5μg/剂量)在0、7和14天施用IN，制剂含0.1μg/剂量的突变CT-CRM(CT-CRME29H、CT-CRMI16A、CT-CRMI16A，S68Y、CT-CRMV72Y或CT-CRMS68Y，V72Y)。血清和粘膜灌洗中蛋白-特异IgG和IgA水平在第28天检测。仅在用CT-CRME29H、CT-CRMI16A，S68Y和CT-CRMV72Y免疫动物血清中检测到统计学显著水平。还在用CT-CRME29H、CT-CRMI16A，S68Y和CT-CRMV72Y免疫动物的支气管洗液中检测到显著水平的IgG。
B.编码CT-CRMs的核酸分子本发明的另一个方面包括分离、合成或重组核酸分子以及编码上述CT-CRMs的序列，CT-CRMs具有指定的定点突变或可进一步含一个或多个那些突变的片段。
一种包括编码CT-CRM的蛋白核酸序列的分离核苷酸分子可优选在调节序列的控制下，调节序列指导宿主细胞中CT-CRM的表达。如本文所述，这种核酸分子可用来体外表达CT-CRM蛋白或允许在人中体内表达CT-CRM蛋白。
如本文所用，术语“分离的核苷酸分子或序列”指没有其它生物成分污染的核酸部分或片段，这些生物成分可与分子或序列在其天然环境中相关。例如，本发明分离的核苷酸分子或序列的一个实施方案是从天然产生状态侧翼序列分离的序列，如从正常邻近片段的序列取出的DNA片段，例如邻近基因组中天然产生的片段的序列。此外，改变本发明的核苷酸酸序列和分子以编码本发明的CT-CRM蛋白。因此，术语“分离的核酸分子或序列”也用于从其它成分中大量纯化的核酸序列或分子，这些成分天然伴随未诱变的核酸，如细胞中的RNA或DNA或蛋白质。本发明分离的核苷酸分子或序列也包括由其它常规方法制备的序列和分子，如重组方法、合成方法如诱变，或这些方法的组合。本发明的核苷酸序列或分子构建不应仅限于本文所列具体核苷酸序列，但应构建包括任何和所有与本文所示核苷酸序列有同源性的核苷酸序列(即有序列同一性)。
术语“基本同源性”或“基本相似性”当指核酸或其片段时，表明与插入或缺失其它核酸(或其互补链)的适当核苷酸最佳排列时，至少约70％核苷酸碱基有核苷酸序列同一性，这是由任何熟知的序列同一性的算法如GCG版6.1中的程序FASTA测量的。如本文所用，术语“同源的”指两个聚合分子间的序列相似性，如在两个核酸分子间，如两个DNA分子或两个RNA分子或两个多肽分子间。当两个分子中核苷酸或氨基酸位置都由相同单体核苷酸或氨基酸占据时，例如如果两个DNA分子中各自的位置由腺嘌呤占据，它们在此位置是同源的。两个序列间的同源是匹配或同源位置数的直接函数，例如如果两个化合物序列中半数(如十个亚基长度聚合物中的五个位置)位置同源，那么两个序列是50％同源。如果90％位置如10个中9个匹配或同源，那么两个序列有90％同源性。作为例子，DNA序列3’ATTGCC5’和3TATGCG5’有50％同源性。如本文所用，术语“基本同源”指与所需核酸约70％同源的DNA或RNA，更优选约80％同源且最优选约90％同源。
本发明也针对分离的核苷酸分子，它包括的核酸序列与编码本发明CT-CRM蛋白的核酸序列至少70％、80％或90％同源，本发明CT-CRM蛋白与野生型CT蛋白相比酶毒性降低且保持野生型CT的佐剂活性。此外，由于遗传密码的简并性，本文描述的任何编码CT-CRM的突变氨基酸残基的三核苷酸密码子在本发明范围内。
如本文所讨论，CT-CRMs、突变CT-A亚基或突变CT-B亚基和/或编码它们的DNA序列或其它本文所述核酸分子或组合物中有用的序列由它们与鉴定序列的同源性或同一性百分比定义，用于计算同源性或同一性百分比的算法包括下列Smith-Waterman算法(J.F.Collins等，1988，Comput.Appl.Biosci.，467-72；J.F.Collins等，分子序列比较和排列(Molecular Sequence Comparison and Alignment)(M.J.Bioshop等，编辑)，实用方法系列核酸和蛋白质序列分析XVIII(Practical ApproachSeriesNucleic Acid and Protein Sequence Analysis XVIII)，IRLPressOxford，England，UK(1987)417页)和BLAST和FASTA程序(E.G.Shpaer等，1996，Genomics，38179-191)。这些参考书目纳入本文作为参考。
如本文所用描述两个DNAs为“可操作连接”，是指单链或双链DNA包括全部两个DNAs物各个，且两个DNAs用这样的方式在DNA内排列即至少一个DNA序列能对另一个施加生理效果。
优选的是，为用于产生本发明的CT-CRM蛋白或施用此蛋白在细胞中体内产生，编码序列的各CT-CRM蛋白和必要调节序列存在于不同病毒或非病毒重组载体(包括传送核酸分子到细胞中的非病毒方法)。另外，编码CT-CRM蛋白双份拷贝或编码多种不同本发明CT-CRMs的两个或多个这些核酸序列可包含在多顺反子转录物中，即设计表达多种基因产物的单个分子。
本发明进一步涉及载体，具体是含分离和纯化DNA序列的质粒，序列包括编码免疫原性突变霍乱全毒素的DNA序列。理想的实施方案包括含编码CT-CRMs的DNA序列的质粒，CT-CRMs在氨基酸16位或72位有单个氨基酸取代或者分别在氨基酸16位和68或68位和72位有双重氨基酸取代。如本文所用，术语“载体”指衍生自病毒或非病毒的DNA分子，如细菌、设计为编码外源或异源核酸序列的种类。因此，术语包括常规细菌质粒。这种质粒或载体可包括来自病毒或噬菌体的质粒序列。这种载体包括染色体、游离型形体或病毒来源的载体，如来源于细菌质粒、噬菌体、酵母游离体、酵母染色体元件和病毒的载体。载体也可来源于它们的组合，如来源于质粒和噬菌体遗传因子、粘粒和噬菌粒。术语也包括将基因从一个细胞转移到另一个细胞的非复制病毒。术语也应该包括非质粒和非病毒化合物，它们促进核酸转移到细胞中，如聚赖氨酸化合物等。
本发明的核酸分子包括非病毒载体或根据本发明将编码CT-CRM蛋白的序列传递到宿主细胞的方法。多种非病毒载体在本领域已知，并包括但不限于质粒、细菌载体、噬菌体载体、“裸露”DNA和用阳离子脂类或聚合体凝聚的DNA。
细菌载体的例子包括但不限于来自卡介苗(bacille Calmette Guerin)(BCG)、沙门氏菌(Salmonella)、志贺氏菌(Shigella)、大肠杆菌和李斯特菌(Listeria)的序列。合适的当质粒载体包括例如pBR322、pBR325、pACYC177、pACYC184、pUC8、pUC9、pUC18、pUC19、pLG339、pR290、pK37、pKC101、pAC105、pVA51、pKH47、pUB110、pMB9、pBR325、ColE1、pSC101、pBR313、pML21、RSF2124、pCR1、RP4、pBAD18和pBR328。
合适的可诱导大肠杆菌表达载体的例子包括pTrc(Amann等.，1988Gene，69301-315)、阿拉伯糖表达载体(如pBAD18，Guzman等，1995J.Bacteriol.，1774121-4130)和pETIId(Studier等.，1990 Methods in Enzymology，18560-89)。来自pTrc载体的靶基因表达取决于来自杂合trp-lac融合启动子的宿主RNA聚合酶转录。来自pETIId载体的靶基因表达取决于来自T7 gn10-1ac融合启动子的转录，此启动子由共表达的病毒RNA聚合酶T7 gn1介导。此病毒聚合酶由宿主菌株BL21(DE3)或HMS I 74(DE3)在lacUV5启动子的转录控制下提供，宿主菌株来自含携带T7 gn1基因的定居原噬菌体。pBAD系统取决于araC基因调节的可诱导阿拉伯糖启动子。启动子在阿拉伯糖存在下诱导。
在一个例子中，名为pLP903的质粒包含分离和纯化DNA序列，包括的DNA序列编码显著降低毒性的免疫原性突变CT-CRM，其中氨基酸丙氨酸在A亚基中氨基酸16位上取代异亮氨酸。第二种名为pLP905的质粒包含分离和纯化DNA序列，包括的DNA序列编码显著降低毒性的免疫原性突变CT-CRM，其中氨基酸酪氨酸在A亚基中氨基酸72位上取代缬氨酸。另一种示范质粒名为pLP904。此质粒包含分离和纯化DNA序列，包括的DNA序列编码显著降低毒性的免疫原性突变CT-CRM，其中氨基酸丙氨酸在A亚基中氨基酸16位上取代异亮氨酸，且氨基酸酪氨酸在A亚基中氨基酸68位上取代丝氨酸。本发明中另一个作为例子的质粒名为pLP906。它包含分离和纯化DNA序列，包括的DNA序列编码显著降低毒性的免疫原性突变CT-CRM，其中氨基酸酪氨酸在A亚基中氨基酸68位上取代丝氨酸，且氨基酸酪氨酸在A亚基中氨基酸72位上取代缬氨酸。
另一类型的有用载体是单链或双链噬菌体载体。例如合适的克隆载体包括但不限于载体如噬菌体λ载体系统、λgt11、μgtμ WES.tB、Charon4、λgt-WES-λB、Charon 4A、λgt-1-λBC、λgt-1-λB、M13mp7、M13mp8或M13mp9。
在其它实施方案中，表达载体是酵母表达载体。用于酵母如酿酒酵母(S.cerevisiae)中表达的载体例子包括pYepSecI(Baldari，等.，1987 ProteinEng.，1(5)433-437)、pMFa(Kurjan和Herskowitz，1982 Cell，30(3)933-943)、pJRY88(Schultz等.，1987 Gene，61(2)123-133)和pYES2(Invitrogen Corporation，SanDiego，CA)。
另外，使用杆状病毒表达载体。用于在培养昆虫细胞(如Sf9或Sf21细胞)中表达蛋白的杆状病毒载体包括pAC系列(Smith等.，1983 Biotechnol.，24434-443)和pVL系列(Luckow和Summers，1987 Virol.，170(1)31-39)。在另一个实施方案中，哺乳动物表达载体用于在哺乳动物中表达。哺乳动物表达载体的例子包括pCDM8(Seed，1987 Nature，329840-842)和pMT2PC(Kaufman等.，1987 EMBOJ.，6(1)187-93)。当用于哺乳动物细胞时，表达载体的控制功能通常由病毒调节因子提供。
一种重组载体是重组单链或双链RNA或DNA病毒载体。多种病毒载体系统在本领域已知。这种载体的例子包括但不限于重组腺病毒载体、基于单纯疱疹病毒(HSV)的载体、腺伴随病毒(AAV)载体、杂合腺病毒/AAV载体、重组逆转录病毒或慢病毒、重组痘病毒载体、重组痘苗病毒载体、SV-40载体、昆虫病毒如杆状病毒以及构建携带或表达感兴趣的选择核酸组合物的载体。
可使用的逆转录病毒载体包括那些描述于EP 0415731；国际专利出版号WO90/07936；WO 94/03622；WO 93/25698和WO 93/25234；美国专利号5219,740；国际专利出版号WO 93/11230和WO 93/10218；Vile和Hart，1993 CancerRes.533860-3864；Vile和Hart，1993 Cancer Res.53962-967；Ram等.，1993 CancerRes.5383-88；Takamiya等.，1992 J.Neurosci.Res.33493-503；Baba等.，1993 J.Neurosurg.79729-735；美国专利号4,777,127；GB专利号2,200,651和EP 0345 242。适合的重组逆转录病毒的例子包括在国际专利出版号WO 91/02805中描述的那些。
基于甲病毒的载体也可用作编码CT-CRM蛋白的核酸分子。这种载体可从多种病毒构建，包括例如辛德比斯病毒载体、SemliKi森林病毒(ATCC VR-67；ATCCVR-1247)、罗斯河病毒(ATCC VR-373；ATCC VR-1246)和委内瑞拉马脑炎病毒(ATCC VR-923；ATCC VR-1250；ATCC VR-1249；ATCC VR-532)。这种载体系统的代表例子包括在美国专利号5,091,309；5,217,879和5,185,440；国际专利出版号WO 92/10578；WO 94/21792；WO 95/27069；WO 95/27044和WO 95/07994中描述的那些。
腺病毒载体例子包括在Berkner，1988 Biotechniques 6616-627；Rosenfeld等.，1991 Science 252431-434；国际专利出版号WO 93/19191；Kolls等.，1994PNAS91215-219；Kass-Eisler等.，1993 PNAS 9011498-11502；Guzman等.，1993 Circulation882838-2948；Guzman等.，1993 Cir.Res.731202-1207；Zabner等.，1993 Cell75207-216；Li等.，1993 Hum.Gene Ther.4403-409；Cailaud等.，1993 Eur.J.Neurosci.51287-1291；Vincent等.，1993 Nat.Genet.5130-134；Jaffe等.，1992Nat.Genet.1372-378；Levrero等.，1991 Gene 101195-202中描述的那些。示范腺病毒载体包括在国际专利出版号WO 94/12649；WO 93/03769；WO 93/19191；WO94/28938；WO 95/11984和WO 95/00655中描述的那些。其它腺病毒载体包括那些来源于黑猩猩腺病毒的，如在美国专利号6,083,716中描述的那些。
另一个病毒载体以细小病毒为基础如腺伴随病毒(AAV)。代表例子包括AAV载体描述于国际专利出版号WO 93/09239，Samulski等.，1989 J. Virol.633822-3828；Mendelson等.，1988 Virol.166154-165和Flotte等.，1993 PNAS9010613-10617。其它特别理想的AAV载体包括那些以AAV1为基础的；参见国际专利出版号WO00/28061，2000年5月18日出版。其它理想的AAV载体包括假型载体，即含由AAV 5’ITRS、转基因、AAV 3’ITRs组成的小基因，它们包装在与AAV ITRs异源的AAV血清型的衣壳中。产生这种假型AAV载体的方法详细描述于国际专利出版号WO 01/83692。
在一个实施方案中，本发明的核酸分子是“裸露DNA”，它可结合的聚合物包括传统聚合物和非传统聚合物如含环糊精的聚合物和保护、相互作用的非凝聚聚合物。“裸露”DNA和用阳离子脂质或聚合物凝聚的DNA一般用化学方法传递给细胞。一些化学方法在细胞传递领域已知并包括使用脂质、聚合物或蛋白质与DNA络合，任选地凝聚相同物到颗粒中并传递给细胞。另外非病毒化学方法包括使用阳离子凝聚DNA，DNA然后置于脂质体中并根据本发明使用。参见C.Henry，2001 Chemical and Engineering News，79(48)35-41。
编码本发明CT-CRM的核酸分子作为“裸露”DNA直接导入细胞(美国专利号5,580,859)或和试剂制成组合物，试剂促进免疫如布比卡因和其它局部麻醉剂(美国专利号6,127,170)。
上述所有病毒和非病毒载体的成分可从本领域已知材料和制药工业中选择。选择载体成分和调节序列不认为是对本发明的限制。根据本发明的编码CT-CRM蛋白的各核酸序列优选在调节序列的控制下，调节序列指导哺乳动物或脊椎动物细胞中各核酸序列产物的复制和产生。术语“启动子/调节序列”指表达可操作连接于启动子/调节序列的核酸所需的DNA序列。在一些情况中，启动子/调节序列可以组织特异方式发挥功能。例如，启动子/调节序列仅能在具体组织类型的细胞中驱动表达。在一些情况中，此序列可以是核心启动子序列和在其它情况中，此序列还可包括增强子序列，和其它组织特异方式表达所需的调节因子。
优选的是，编码本发明CT-CRM蛋白的核酸分子和/或重组载体进一步包括调节序列。例如，这种调节序列包括驱动CT-CRM蛋白表达的启动子。启动子/调节序列优选位于编码序列的5’末端，这样它驱动细胞中CT-CRM蛋白的表达。
合适的启动子可选择自组成型启动子、可诱导启动子、组织-特异启动子和其它。组成型启动子有非特异活性并用于编码本发明CT-CRM蛋白的核酸分子，例子包括但不限于逆转录病毒劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子、逆转录病毒LTR启动子(任选地具有RSV增强子)、巨细胞病毒(CMV)启动子(任选地具有CMV增强子)(参见例如Boshart等，Cell，41521-530(1985))、SV 40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子和EF1α启动子(Invitrogen)。
由外源提供化合物调节的可诱导启动子包括但不限于阿拉伯糖启动子、锌-可诱导的绵羊金属硫蛋白(MT)启动子、地塞米松(Dex)-可诱导的小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)启动子、T7聚合酶启动子系统(WO 98/10088)；蜕皮激素昆虫启动子(No等.，1996 Proc.Natl.Acad.Sci.USA，933346-3351)、四环素-可诱导系统(Gossen等，1995Science.2681766-1769，也参见Harvey等，1998 Curr.Opin.Chem.Biol.，2512-518)、RU486-可诱导系统(Wang等，1997 Nat.Biotech，15239-243和Wang等，1997 GeneTher.，4432-441)和拉帕霉素-可诱导系统(Magari等，1997 J.Clin.Invest.，1002865-2872)。用于CT-CRMs表达系统的特别优选的启动子是阿拉伯糖可诱导的启动子。
可用于此方面的其它种类的可诱导启动子是由具体生理状态调节的，如温度或急性期或仅在复制细胞中。有用的组织-特异启动子包括的启动子来自基因编码骨骼β-肌动蛋白、肌球蛋白轻链2A、肌养蛋白、肌肉肌酸激酶以及活性高于天然产生的启动子的合成肌肉启动子(参见Li等.，1999 Nat.Biotech.，17241-245)。已知的组织-特异启动子的例子有肝脏(清蛋白，Miyatake等.1997 J.Virol.，715124-32；乙肝炎病毒核心启动子(hepatitis B virus core promoter)，Sandig等.，1996 GeneTher.，31002-9；α-胎蛋白(AFP)，Arbuthnot等.，1996 Hum.Gene Ther.，71503-14)、骨(骨钙蛋白，Stein等.，1997 Mol.Biol.Rep.，24185-96；骨唾液蛋白，Chen等.，1996 J.BoneMiner.Res.，11654-64)、淋巴细胞(CD2，Hansal等.，1998 J.Immunol.，161063-8；免疫球蛋白重链；T细胞受体α链)、神经元(神经元特异性烯醇化酶(NSE)启动子，Anderson等.1993 Cell.Mol.Neurobiol.，13503-15；神经丝轻链基因，Piccioli等.，1991 Proc.Natl.Acad.Sci.USA，885611-5；神经元特异性B ngf基因，Piccioli等.，1995 Neuron，15373-84)。参见例如国际专利出版号WO 00/55335，用于此方面已知的启动子的附加列表。
其它包括在本发明核酸序列、分子或载体中的调节序列包括但不限于增强子序列、聚腺苷酸化序列、剪接供体序列和剪接供体序列、分别位于待翻译多肽开始和末端的转录起始和终止位点、用于在转录区域翻译的核醣体结合位点、抗原表位标签、核定位序列、IRES元件、Goldberg-Hogness“TATA”元件、限制酶裂解位点、可选择标记等。增强子序列包括如S40 DNA的72bp串联重复或逆转录病毒长末端重复序列或LTRs等，且用于提高转录效率。启动子和其它普通载体元件的选择是常规的，且有许多这种序列用来设计本发明中有用的核苷酸分子和载体。参见例如Sambrook等，《分子克隆.实验室手册》(Molecular Cloning.A LaboratoryManual)，Cold Spring Harbor Laboratory，New York(1989)和本文所引用参考文献，例如3.18-3.26页和16.17-16.27页和Ausubel等.，《新编分子生物学实验指南》(CurrentProtocols in Molecular Biology)，John Wiley&Sons，New York(1989)。本领域技术人员可从这些已知调节序列中选择以制备本发明的分子。这种调节序列的选择不是本发明的限制。
C.产生本发明的CT-CRM蛋白和核苷酸分子的方法考虑到突变CT-CRMs被证明作为抗原组合物佐剂的效用，产生合适量的突变CT-CRMs是需要的。制备或合成核苷酸序列和CT-CRMs以及含本文所示发明核苷酸分子或CT-CRMs蛋白的组合物在本领域使用现有材料的普通技术人员的能力范围内。本发明不限制合成方法。下面例子详述了合成编码本发明CT-CRMs序列的较佳实施方案。
本发明CT-CRMs和核苷酸分子和序列的产生可通过化学合成方法、重组遗传工程方法、定点诱变和这些方法的组合。例如本发明核苷酸序列/CT-CRMs可采取已知化学合成技术来常规制备，例如固相化学合成，如Merrifield，1963J.Amer.Chem.Soc.，852149-2154；J.Stuart和J.Young，固相肽合成，Pierce ChemicalCompany，Rockford，IL(1984)；Matteucci等.，1981 J.Amer.Chem.Soc.，1033185；Alvarado-Urbina等.，1980 Science，214270；Sinha，N.D.等.，1984 Nucl.AcidsRes.，134539描述。也参见如《蛋白质-结构和分子性质》(PROTEINS-STRUCTUREAND MOLECULAR PROPERTIES)，第二版，T.E.Creighton，W.H.Freeman和Company，New York，1993；Wold，F.，“翻译后蛋白质修饰观点和前景”(Posttranslational Protein ModificationsPerspective and Prospects)，1-12页，《翻译后蛋白质的共价修饰》(POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OFPROTEINS)，B.C.Johnson编辑，Academic Press，New York，1983Seifter等.，1990Meth.Enzymol.，182626-646和Rattan等.，1992 Ann.N.Y.Acad.Sci.，66348-62。
另外，本发明组合物可用常规分子生物技术、定点诱变、遗传工程或聚合酶链式反应来重组构建，如通过克隆和表达编码CT-CRM蛋白的核苷酸分子，CT-CRM蛋白有任选其它免疫原和任选宿主微生物内的载体蛋白等，并利用本文提供的信息(参见例如Sambrook等，《分子克隆.实验室手册》，Cold Spring HarborLaboratory，New York(1989)；Ausubel等.，《新编分子生物学实验指南》，JohnWiley&Sons，New York(1997))。CT-CRMs和任选免疫原的编码序列可合成制备(W.P.C.Stemmer等，1995 Gene，16449)。
大体上，重组DNA技术包括通过合成或分离编码上述CT-CRM蛋白的DNA序列获得，将它导入在其中表达的适当载体/宿主细胞表达系统，优选在阿拉伯糖可诱导启动子控制下。任何描述将DNA插入表达载体的方法可用于连接启动子和其它调节控制元件到选择重组载体内的特定部位。然后通过常规技术用这种载体或质粒转化、感染、转导或转染合适的宿主细胞。
多种宿主细胞-载体(质粒)系统可用于表达免疫原性突变霍乱全毒素。优选包括阿拉伯糖可诱导启动子的载体系统与所用宿主细胞相容。编码突变CT-CRMs的DNA插入表达系统，且启动子(优选是阿拉伯糖可诱导启动子)和其它控制元件连接到载体内的特定部位从而当载体插入宿主细胞中时(通过转化、转导或转染，这取决于所用宿主细胞-载体系统)，编码CT-CRM的DNA由宿主细胞表达。
载体可选择自上述一种病毒载体或非病毒载体，但必须与所用宿主细胞相容。重组DNA载体可通过转化、转导或转染(取决于载体/宿主细胞系统)导入适当宿主细胞(细菌、病毒、酵母、哺乳动物细胞等)中。宿主-载体系统包括但不限于转化噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA的细菌；微生物如含酵母载体的酵母；感染病毒(如牛痘病毒、腺病毒等)的哺乳动物细胞系统和感染病毒(如杆状病毒)的昆虫细胞系统。
克隆和表达本发明CT-CRMs和其它组合物的系统使用合成核酸分子，包括使用多种重组技术中熟知的微生物和细胞。宿主细胞可选择自任何生物，包括原核(如细菌)细胞和包括哺乳动物、昆虫细胞、酵母细胞的真核细胞。优选的是，本发明不同方法和组合物中所用细胞是细菌细胞。合适的细菌细胞包括例如大肠杆菌、杆菌(Bacillus)和链霉菌(Streptomyces)的不同菌株。酵母细胞如酵母(Saccharomyces)和毕赤酵母、昆虫细胞如Sf9和Sf21细胞也是用于生产目的的有用宿主细胞。哺乳动物细胞包括但不限于中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、鸡胚成纤维细胞、幼仓鼠肾细胞、NIH3T3、PERC6、NSO、VERO或COS细胞，它们也是合适的宿主细胞以及其它常规和非常规的生物和植物。
选择其它合适的宿主细胞和用于转化、培养、扩增、筛选和产物生成和纯化的方法可由本领域技术人员参考已知技术进行，参见例如Gething和Sambrook，1981Nature，293620-625。
典型，宿主细胞在培养条件下维持一段足够表达的时间。培养条件在本领域熟知并包括离子组成和浓度、温度、pH等。通常，转染细胞在培养条件下维持在培养基中。用于多种细胞类型的合适介质在本领域中熟知。在一个较佳实施方案中，温度从约20℃到约50℃，更优选从约30℃到约40℃，更加优选约37℃。
优选pH从约6.0到约8.0，更优选从约6.6到约7.8，最优选约7.4。优选渗量浓度从约200毫摩尔渗透压/升(mosm/L)到约400mosm/L，更优选从约290mosm/L到约310mosm/L选。转染和表达编码蛋白的其它生物学条件在本领域熟知。
重组CT-CRM蛋白回收或收集自宿主细胞或它的膜或者来自培养那些细胞的培养基。回收包括分离和纯化重组CT-CRM蛋白。用于多肽的分离和纯化技术在本领域熟知并包括步骤如沉淀、过滤、层析、电泳等。
当通过常规重组方法产生时，本发明的CT-CRMs可用常规方法分离和纯化自细胞或其培养基，包括层析(如离子交换、亲和性和定大小柱层析)、离心、差别溶解性，或通过其它标准技术纯化蛋白。存在一些技术用于从原核细胞纯化异源蛋白。参见美国专利号4,518,526；4,599,197和4,173,362。但产生的纯化制备应该基本上没有可能对人有害的宿主毒素。具体是，当在革兰氏阴性菌宿主细胞如大肠杆菌中表达时，纯化的肽或蛋白应该基本上没有内毒素污染。参见例如Sambrook等，《分子克隆·实验室手册》，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，NewYork(1989)。
本发明方法和组合物中所用CT-CRMs不限于本文所列任何具体示范过程的产物。事实上，蛋白可通过上面所引用内容的方法或此说明书其它地方所引用内容的方法来制备。分离和产生这种用途的重组或合成蛋白组合物在本领域技术范围内。
表1的四个示范CT-CRMs中，两个带有单个氨基酸取代，两个带有双重氨基酸取代，它们如实施例1中详细所述使用上述一些方法产生。具体的是，一组突变体CT克隆(CT-CRMs)通过标准定点诱变操作在大肠杆菌中产生，定点诱变操作用于编码已知CT全毒素分子的质粒。
前面显示纯化CT-CRME29H全毒素的所得产量约50μg每升培养基(参见国际专利出版号WO 00/18434)。通过修饰原始质粒来增加CT-CRME29H产量的最初尝试显示很少或没有效果。产量的适度增加通过质粒pIIB29H和衍生物与霍乱弧菌DsbA和大肠杆菌RpoH共表达来获得。共表达和纯化修饰提高CT-CRME29H产量到约2mg/升。
为了增加本发明CT-CRMs的表达，质粒中的乳糖可诱导启动子用阿拉伯糖可诱导启动子替代(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)，阿拉伯糖可诱导启动子可操作连接于编码CT-CRMs的DNA序列。在克隆期间，确定质粒pIIB29H包含的ctxA基因编码来自霍乱弧菌菌株569B的CT亚基A，质粒连接到编码来自霍乱弧菌菌株2125的CT亚基A的ctxB基因。这些基因的交叉排列表明两个ctxB基因间的七个碱基取代和ctxA基因间的单个碱基变化。几个这些碱基取代导致成熟亚基中的氨基酸变化。特别指出的是，ctxA基因间的取代导致A-2部分或A亚基的全毒素装配结构域内的氨基酸变化。不知道这些基因间异源性是否对毒素表达或全毒素装配有负的影响。然而，从进化观点优先认为毒素亚基基因来自相同来源。阿拉伯糖可诱导系统构建中所用ctxA和ctxB基因都来自霍乱弧菌菌株569B。质粒pLP903、pLP904、pLP905和pLP906的构建描述于实施例1。免疫原性突变体霍乱全毒素通过用上述质粒转化、感染、转导或转染宿主细胞来产生，并在允许宿主细胞表达所述重组免疫原性解毒蛋白的条件下培养宿主细胞。从pLP903、pLP904、pLP905和pLP906产生的CT-CRMs约为10mg纯化物质每升培养物。
所得CT-CRM蛋白或核酸分子可制成具有任何数量的选择抗原的免疫原性组合物并用体内分析筛选佐剂功效，如在以下列例子中描述的那些。
D.免疫原性组合物根据发明一种有效的免疫原性组合物包括本发明的突变霍乱全毒素。优选的是，突变霍乱全毒素CT-CRM与所述野生型霍乱全毒素相比毒性降低。此“降低的毒性”使各突变体能用作免疫原性组合物中的佐剂而不引起显著副作用，特别是那些已知与所述野生型CT相关的副作用，如腹泻。更优选的是，本发明免疫原性组合物中的CT-CRM在全毒素的A亚基中氨基酸16位或72位上有单个氨基酸取代，或在霍乱全毒素的A亚基中氨基酸16位和68位或68位和72位上有双重氨基酸取代。在一个实施方案中，CT-CRM可有一个或多个其它上述修饰。在另一个实施方案中，组合物包括选择抗原和合适有效佐剂量的CT-CRM，其中所述全毒素显著增强脊椎动物宿主对所述抗原的免疫应答。本发明组合物通过改进对施用组合物的脊椎动物宿主抗体应答和细胞介导的免疫应答来调节免疫应答，组合物施用包括上述选择抗原。
如本文所用，术语“有效佐剂量”指有效引起脊椎动物宿主中免疫应答增加的一种本发明CT-CRM突变体的剂量。在一个更具体的定义中，术语“有效佐剂量”指有效引起脊椎动物宿主中免疫应答增加的本文所述四种CT-CRM突变体之一(CT-CRMI16A、CT-CRMV72Y、CT-CRMI16A，S68Y、CT-CRMS68Y，V72Y)的剂量。具体是，在鼻内使用不同抗原后，本文所示CT-CRMs增强粘膜和全身免疫应答。此外，即使存在先存在的抗CT免疫应答，突变CT-CRMs能作为有效粘膜佐剂。根据本发明的免疫原性突变CT-CRMs表现出毒性降低和保持佐剂活性的平衡，这样所得突变CT蛋白在被其导入的脊椎动物宿主安全地耐受时作为佐剂发挥功能。具体“有效佐剂剂量或量”取决于宿主的年龄、重量