专利名称：磁性壳聚糖微球固定化辣根过氧化物酶的制备方法酚类化合物是ー种原型质毒物，可通过与皮肤、粘膜的接触不经肝脏解毒直接进入血液循环，致使细胞破坏并失去活力；也可通过口腔侵入人体，造成细胞损伤。高浓度的酚液能使蛋白质凝固，井能继续向体内滲透，引起深部组织损伤，坏死乃至全身中毒。 酶处理技术具有反应条件温和、处理速率快等优点，在水处理领域日益受到关注。辣根过氧化物酶(HRP)是由ー个糖蛋白和一个铁卟啉辅基缀合而成的酶，能够在过氧化氢存在时催化苯酚、苯胺及其取代物聚合。19世纪80年代中期，Klibanov等人第一次利用辣根过氧化物酶处理氯酚和苯胺。张国平等人采用HRP处理五氯酚模拟的模拟废水进行催化聚合处理，结果表明HRP可有效除去氯酚。郑琦等人用辣根过氧化物酶处理邻苯ニ酚废水，结果表明辣根过氧化物酶能有效去除邻苯二酚；李勤等人采用人工配水实验，研究HRP处理含苯酚和氯酚的废水，结果表明在最佳条件下，苯酚的去除率可达99. 5%，对氯苯酚的去除率可达95%。Dec等利用富含HRP酶的植物材料处理含酚废水，也取得很好的效果。由于辣根过氧化物天然酶稳定性差、易失活、不能重复使用，并且反应后混入产物，纯化困难，限制了其在エ业中的广泛应用。而将酶固定化后，稳定性大大提高，可重复使用，这样不仅降低了废水处理的成本，还避免了蛋白质的污染等问题。壳聚糖是由甲壳素经脱こ酰氨基而得到的ー种天然碱性氨基多糖，是ー种生物相容性好、易生物降解、无毒、廉价易得的天然高分子生物材料，并且易于加工成膜、多孔微球、凝胶等多种形态，使其成为国内外固定化酶载体的最受欢迎的高分子材料。如Chiou SH研究以壳聚糖固定化假丝酵母玫瑰酶，结果表明改性后的壳聚糖微球具有很高的负载量，同时也保持了很高的酶活性；Krastanov A利用壳聚糖将Serratia p Iymuthica细胞固定起来，用来催化蔗糖转化为异麦芽糖，其単位生产率达到O. 76-1. 15kg蔗糖/小吋。然而以壳聚糖作为载体，液体流动性不好，难于进行长时间的连续操作；壳聚糖微球作固定化酶载体亦不利于固定化酶的快速分离和重复利用。故寻求其他方法改善壳聚糖的使用效果变得相对迫切。Wang W用环氧氯丙烷通过悬浮聚合的方式合成和活化磁性羟基壳聚糖微球，研究了交联剂用量对固定化酶和其活性的影响，结果表明，固定化酶的活性是游离酶的I. 0834倍，确定了固定化酶对青霉素G的水解的最适pH值和最适温度，还发现其使用80次后，固定化酶还残留有大约94. 2%的活性，且固定化酶的分离更加容易。
本发明的目的是为了提供ー种具有磁响应性的磁性壳聚糖微球用于固定化辣根过氧化物酶。特提供ー种磁性壳聚糖微球固定化辣根过氧化物酶的制备方法。为达到以上目的，本发明采用以下技术方案以聚こニ醇作表面活性剂和稳定剂，采用化学共沉淀-超声分散法制备具有良好生物相容性、稳定性、强磁响应性的纳米尺度的水基磁流体作为磁响应性物质；以水基磁纳米粒子作为磁响应物质，以壳聚糖作为载体，应用改良的乳化一化学交联技术制备磁响应性好、成球形好的磁性壳聚糖微球；以磁性売聚糖微球作为载体，用吸附-交联法制备磁性壳聚糖固定化辣根过氧化物酶。ー种磁性壳聚糖微球固定化辣根过氧化物酶的制备方法，其具体步骤是 步骤(一)制备水基磁流体将5g的聚こニ醇4000溶于IOOml蒸馏水中，按质量比为I 4 加入 FeSO4 · 7H20 2. 78g 和 Fe2 (SO4) 3 · 9H20 11. 12g 盐充分溶解，在搅拌和 50°C保温的条件下，滴加浓氨水至pH彡10，再继续熟化反应l 2h后用质量百分比浓度为25%こ酸中和至pH=7. 0，磁场分离，倾倒上层液体和浮渣后，用蒸馏水洗涤除杂质，即得到乌黑发亮的水基磁流体。步骤(ニ)制备磁性壳聚糖微球按壳聚糖磁流体质量比=3:1的比例准确称取O. 3g壳聚糖，溶于质量百分比浓度为2. 5%的10 mlこ酸溶液中，加入O. Ig上述制得的磁流 体，搅拌溶解，经超声制成均匀的混悬液静置脱气泡备用。取混悬液3g逐滴加入含3%乳化剂斯盘_80的60ml液体石腊中，在35°C恒温下以3000转/min转速下搅拌乳化30min。乳化完毕，加入质量百分比浓度为25%的戊ニ醛溶液O. Iml固化3h后，将反应物转移至小烧杯中，磁场分层后，弃去上清液，用こ醚少量分3次洗涤微球表面的有机溶剤，再用蒸馏水洗涤3次，磁过滤后，产品在真空烘箱中于60°C干燥得到磁性壳聚糖微球，并封存。步骤(三)磁性壳聚糖固定化辣根过氧化物酶的制备取步骤(ニ)制得的磁性壳聚糖微球，加入到O. 1Μ，ρΗ=7. O的含辣根过氧化物酶的磷酸盐缓冲液中，搅拌均匀后于4°C冰箱中固定化3小时，用外加磁场分离，倒掉上层清液，用磷酸缓冲液反复洗涤3飞次，抽滤，得到磁性壳聚糖微球固定化辣根过氧化物酶。本发明与现有技术相比，具有以下效果本发明所制备的磁性壳聚糖微球固定化辣根过氧化物酶具有良好的磁响应性，重复利用后依然保持很高的酶活力，可以解决以往固定化酶在应用时与产物混合，不易分离，不利于固定化酶重复利用和降低固定化酶的使用成本等问题。 实施例I :按壳聚糖磁流体质量比=3:1的比例准确称取O. 3g壳聚糖，溶于质量百分浓度为2. 5%的IOmlこ酸溶液中，加入O. Ig磁流体，搅拌溶解，经超声制成均匀的混悬液静置脱气泡备用。取混悬液3g逐滴加入含质量百分浓度为3%乳化剂斯盘-80的60ml液体石蜡中，在35°C恒温下以3000转/min速度搅拌乳化30min。乳化完毕，加入质量百分浓度为25%戊ニ醛溶液O. Iml固化，3小时后，将反应物转移至小烧杯中，磁场分层后，弃去上层清液，用こ醚洗涤下层微球表面的有机溶剤，再用蒸馏水洗涤，磁过滤后，产物在真空烘箱中于60°C干燥得到磁性壳聚糖微球。取制得的磁性壳聚糖微球，加入到含辣根过氧化物酶2g/L的O. 1M，pH=7. O的磷酸盐缓冲液中，搅拌均匀后于4°C冰箱中固定化3h，用外加磁场分离，倒掉上层清液，用磷酸缓冲液反复洗涤下层产物，抽滤，得到磁性壳聚糖微球固定化辣根过氧化物酶。其磁响应性为28. 3s，酶活カ为41. 72U/g载体，酶活力回收率为59. 11%。对照例I :按壳聚糖磁流体质量比=6:1的比例准确称取一定量的壳聚糖，其他步骤和条件与实例I完全相同，结果是相比实施例1，对照例I制得的磁性壳聚糖微球固定化辣根过氧化物酶的磁响应性为54. 8s,酶活カ为39. 31U/g载体，酶活力回收率为48. 28%。实施例2 :按壳聚糖磁流体质量比=3:1的比例准确称取O. 3g壳聚糖，溶于质量百分浓度为2. 5%的IOmlこ酸溶液中，加入O. Ig磁流体，搅拌溶解，经超声制成均匀的混悬液静置脱气泡备用。取混悬液3g逐滴加入含质量百分浓度为3%乳化剂斯盘-80的60ml液体石蜡中，在35°C恒温下以3000转/min速度搅拌乳化30min。乳化完毕，加入质量百分浓度为25%戊ニ醛溶液O. Iml固化，3小时后，将反应物转移至小烧杯中，磁场分层后，弃去上层清液，用こ醚洗涤微球表面的有机溶剂，再用蒸馏水洗涤，磁过滤后，产物在真空烘箱中于60°C干燥得到磁性壳聚糖微球。取制得的磁性壳聚糖微球，加入到含辣根过氧化物酶2g/L的O. 1M，pH=7. O的磷酸盐缓冲液中，搅拌均匀后于4°C冰箱中固定化3h，用外加磁场分离，倒掉上层清液，用磷酸缓冲液反复洗涤下层产物，抽滤，得到固定化磁性壳聚糖辣根过氧化物酶。其磁响应性为28. 3s，酶活カ为41. 72U/g载体，酶活力回收率为59. 11%。对照例2 :其他步骤、方法与实例2完全相同，对照例2是将磁性壳聚糖微球加入到含辣根过氧化物酶lg/L的O. 1M，pH=7. O的磷酸盐缓冲液中，结果是相比实施例2，得到 的固定化磁性壳聚糖辣根过氧化物酶酶，其磁响应性为26. 8s，酶活カ为28. 65U/g载体，酶活力回收率为59. 37%。

本发明涉及用于酶工程开发应用领域及环境保护领域中将酶固定化后能重复利用的磁性壳聚糖微球固定化辣根过氧化物酶的制备方法。其技术方案先将聚乙二醇4000溶于水，按质量比1∶4加入Fe2+和Fe3+盐，滴加浓氨水至体系pH≥10，2h后用乙酸调节pH为7.0，磁场分离、洗涤，得到磁流体；其次按壳聚糖磁流体质量比3∶1制备壳聚糖磁流体的乙酸溶液，超声混匀后，加入到添加含斯盘80的液体石蜡中乳化，加戊二醛固化3h，经分离、洗涤、烘干得磁性壳聚糖微球；最后将磁性壳聚糖微球加到辣根过氧化物酶磷酸盐缓冲液中，4℃下固化3h，分离、洗涤、过滤，制得磁性壳聚糖微球固定化辣根过氧化物酶。本方法载体廉价易得，酶稳定性好，且利于酶的快速、重复利用。