专利名称：：一种负载rhBMP-2壳聚糖微球及其制备方法和应用的制作方法：随着基因工程和生物技术的发展，越来越多的生物活性因子用于治疗和预防疾病。骨形态发生蛋白-2(bonemorphogeneticprotein-2，BMP-2)是转化生长因子β超家族成员之一，具有诱导未分化的间充质干细胞向成软骨细胞和成骨细胞定向分化与增殖的能力，在修复骨缺损和促进骨愈合方面起重要作用(Reddi，Α.H.，Bonemorphogeneticproteins:frombasicsciencetoclinicalapplications.JBoneJointSurgAm,2001,83-ASuppll(Pt1):Sl-6)。但纯的重组人骨形态发生蛋白-2和其它细胞生长因子一样，容易被酶降解、体内半衰期短，在局部和全身应用很快被稀释代谢，生物利用度很低，所以重组人骨形态发生蛋白-2的有效发挥需要合适的载体。壳聚糖(chitosan)是甲壳素的脱乙酰化产物，由2-氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖苷经糖苷键连接而成，是自然界中唯一的天然碱性多糖，也是少数具有正电荷的天然产物之一。许多实验表明壳聚糖具有良好的生物相容性和生物降解性，而且降解后的产物在体内安全、无毒副作用。目前，利用壳聚糖制备化疗药物、蛋白和基因等药物的缓释、控释微球已取得较好的效果。为达到药物的持续释放，通常采用交联剂对壳聚糖微球进行交联°冯庆玲等(Niu,X.,etal.,PreparationandcharacterizationofchitosanmicrospheresforcontrolledreleaseofsyntheticoligopeptidederivedfromBMP-2.J.Microencapsulation,2009.26(4)=297-305)采用乳化一离子交联法制备载重组骨形态发生蛋白-2壳聚糖微球，将蛋白与壳聚糖的混合溶液滴入含表面活性剂的液体石蜡中，乳化后滴入三聚磷酸钠溶液进行反应形成微球，产物采用大量石油醚、异丙醇清洗后冷冻干燥，体外累积释放7天达62.3%。黄鑫等将rhBMP与壳聚糖的混合溶液加入含表面活性剂的辛醇溶液中，乳化后采用生物交联剂京尼平进行交联，产物微球采用异丙醇、石油醚、水反复漂洗，制得的重组人骨形态发生蛋白-2壳聚糖微球体外释放可达30天。专利CN1016374M采用静电液滴一离子交联法制备了人骨形态发生蛋白_2壳聚糖微球。在静电场下，将蛋白和壳聚糖的混合溶液滴入含三聚磷酸钠的凝胶浴中，形成人骨形态发生蛋白-2壳聚糖微球，体外缓释周期达4周以上。但是采用戊二醛、京尼平和三聚磷酸钠等交联剂制备的交联壳聚糖微球在体内的炎症反应程度较纯壳聚糖明显增加，并且交联降低了微球在体内降解速率(Mi,F.-L.,etal.，Invivobiocompatibilityanddegradabilityofanovelinjectable-chitosan-basedimplant.Biomaterials,2002,23(1):181-191)。同时制备过程中的界面效应、电压、超声搅拌等因素也易使蛋白失去活性，而且壳聚糖微球整个制备过程都要保持无菌操作，工艺相对繁琐。
由于壳聚糖对蛋白有良好的亲和能力，壳聚糖微球可通过疏水作用、静电作用和氢键相互作用吸附蛋白，条件温和，操作简单，因此本发明的目的在于提供一种负载rhBMP-2壳聚糖微球，rhBMP-2吸附在所述壳聚糖微球上，不仅吸附容量高，且rhBMP-2不易失活。本发明的另一目的在于提供上述微球的制备方法。本发明的再一目的在于提供上述微球的应用。本发明的负载rhBMP-2壳聚糖微球，基质为壳聚糖微球，负载的药物为rhBMP_2，所述rhBMP-2吸附在所述壳聚糖微球上，且rhBMP-2与壳聚糖的重量比为130100。根据本发明，所述壳聚糖微球的平均粒径为1300μm。根据本发明，所述壳聚糖微球由壳聚糖与离子交联剂发生反应再采用氢氧化钠溶液处理制得。本发明的负载rhBMP-2壳聚糖微球的制备方法，其特征在于，包括如下步骤(a)、将壳聚糖溶液分散到含有表面活性剂的油相形成W/0型乳状体系；(b)、将离子交联剂溶液加入到所述W/0型乳状体系反应112小时，加入丙酮，收集壳聚糖微球；(C)、经丙酮、无水乙醇和水依次洗涤后，将壳聚糖微球分散于水中，在缓慢搅拌下滴加浓度为0.15%(w/v)的氢氧化钠溶液，直至反应体系最终PH值大于7，收集壳聚糖微球；(dl)、将壳聚糖微球用水洗涤或在水中透析后冷冻干燥；或(业)将壳聚糖微球用0.01(w/w)硫酸水溶液浸泡160分钟后，再用水洗涤或在水中透析后冷冻干燥；(e)、将冻干后的壳聚糖微球分散于含有0.1lOmg/mLrhBMP-2的溶液中，被动吸附加载0.512小时后，获得的分散体直接冷冻干燥即得所述负载rhBMP-2壳聚糖微球。根据本发明，所述表面活性剂为Span-80、TWeen-80或两者的混合物；所述表面活性剂和油相的体积比为0.55100。根据本发明，所述油相为液体石蜡、正辛醇、蓖麻油、花生油、大豆油、橄榄油、葵花籽油或石油醚和液体石蜡的混合液。根据本发明，所述壳聚糖溶液和油相的体积比为1310。根据本发明，所述离子交联剂为硫酸、三聚磷酸钠、硫酸钠或柠檬酸钠。根据本发明，所述离子交联剂为硫酸，所述离子交联剂溶液为硫酸水溶液，浓度为1030%(w/w)。本发明提供的负载rhBMP-2壳聚糖微球的应用，用于制备治疗骨损伤的药物。本发明采用先乳化离子交联，然后再部分脱除交联结构制备壳聚糖微球，采用温和的吸附策略制备携载骨形态发生蛋白-2的壳聚糖微球，对生长因子的吸附容量高，操作简单易行，制备过程不易染菌，不仅有利于制备过程中生长因子的活性维持，而且微球载体可保护生长因子不被体内的酶降解，提高其体内生物利用度。体外药物释放具有前期突释和后期缓释的特征，动物实验表明本发明的负载rhBMP-2壳聚糖微球能更好地促进新骨形成。图1为红外光谱图，a为壳聚糖原料，b为先离子交联再氢氧化钠处理的壳聚糖微球。图2为XRD图，a为壳聚糖原料，b为先离子交联再氢氧化钠处理的壳聚糖微球。图3为壳聚糖微球扫描电镜照片。图4为负载rhBMP-2壳聚糖微球在PBS(pH=7.4)缓冲液中缓释曲线。图5为负载rhBMP-2壳聚糖微球异位成骨的苏木精一伊红染色图，X20。图6为负载rhBMP-2壳聚糖微球异位成骨活性。具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。通用方法(1)负载rhBMP-2壳聚糖微球的缓释将20mg的负载rhBMP-2壳聚糖微球放入IOmL塑料试管中，加入PBS(pH=7.4)溶液5mL，在37°C恒温震荡，在不同时间点(分别为1，2，3，5，7，10，14，21，28，35和42天)进行离心分离，收集试管中上清液，同时补充新的PBS(pH=7.4)溶液5mL。取上清液ImL溶液，加入考马斯亮兰G250显色剂5mL，混勻，放置^iin后用紫外分光光度计于595nm处测定吸光度，以不加蛋白溶液为空白。然后由rhBMP-2标准曲线方程计算上清液中rhBMP-2浓度。每个样品平行测定三次，计算rhBMP-2累计释放百分比并绘制释放曲线。实施例1将分子量为30KDa、脱乙酰度为90%的壳聚糖，溶于2%(ν/ν)乙酸溶液中，配制成4(w/v)%壳聚糖溶液，脱泡后缓慢加入到5倍体积的含表面活性剂(Span-80和Tween-80体积比为21，表面活性剂和油相的体积比为1100。)的油相液体石蜡中，搅拌池，形成W/0乳液，加入等体积的20%(w/w)硫酸溶液进行交联，继续搅拌交联4小时后，加入丙酮脱水，静置分层，用丙酮、无水乙醇蒸馏水分别洗涤沉淀。然后将沉淀分散于水中，在磁力搅拌下滴加浓度为4%(w/v)的氢氧化钠溶液，直至反应体系最终pH值大于7，再用丙酮、无水乙醇和水充分洗涤，冷冻干燥后即得壳聚糖微球。采用红外光谱和XRD对壳聚糖微球和壳聚糖原料进行分析，结果分别如图1、图2所示，表明壳聚糖微球和壳聚糖原料具有相同的化学结构，未引入其它基团；且壳聚糖微球经NaOH处理后，其结晶度下降，主要以无定形态存在。采用扫描电镜观察壳聚糖微球，如图3所示，壳聚糖微球外观圆整，平均粒径为94士53μπι。按照rhBMP-2与壳聚糖微球重量比为110，将壳聚糖微球分散于含有rhBMP-2的水溶液中，被动吸附加载6小时后，将悬浮液直接冷冻干燥得到负载rhBMP-2壳聚糖微球。如图4所示，在PBS溶液(pH=7.4)中，rhBMP-2前期缓释较快，7天累积释放65%，随后缓慢释放达4周以上。先将生长2w的昆明种小鼠按体重的3%进行戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，仰卧固定于手术板上，将右大腿后外侧剃毛消毒，切开约Icm的皮肤切口，钝性分离大腿肌袋，植入如上制备的负载rhBMP-2的壳聚糖微球(其中含有100微克的rhBMP-幻后，缝合肌膜层和皮肤。手术后放入饲养盒中，进行正常的洁净级标准饲料喂养。于手术后4周处死小鼠，其中1只小鼠迅速取出植入材料及其周围软组织浸入10%的福尔马林溶液中固定，切片，苏木精一伊红染色观察成骨情况进行组织学观察，如图5所示，发现横纹肌组织中可见骨组织，包括骨小梁及骨髓。另外4只小鼠解剖其右腿取出新长的骨头，如图6所示，新骨的平均鲜重为300mg；把新骨放在高温炉中600°C下煅烧6h，随炉冷却后，取出称其灰分平均重量为39mg，证实所制备的负载重组人骨形态发生蛋白-2壳聚糖微球具有很好的诱导成骨活性。实施例2将分子量为50.5KDa、脱乙酰度为90%的壳聚糖，溶于3%(ν/ν)乙酸溶液中，配制成3%壳聚糖溶液脱泡后，缓慢加入到7倍体积的含表面活性剂Span-80(表面活性剂和油相的体积比为1100)的油相液体石蜡中，搅拌4h，形成W/0乳液，加入2倍体积的10%(w/w)硫酸溶液进行交联，继续搅拌交联6小时后，加入丙酮脱水，静置分层，用丙酮、无水乙醇蒸馏水分别洗涤沉淀。然后将沉淀分散于水中，在磁力搅拌下滴加浓度为2%(w/v)的氢氧化钠溶液，直至反应体系最终PH值大于7；再将壳聚糖微球用(w/w)硫酸水溶液浸泡1分钟后，再用丙酮、无水乙醇和水充分洗涤，冷冻干燥后即得壳聚糖微球。壳聚糖微球平均粒径为62士25μπι。按照重组人骨形态发生蛋白-2/壳聚糖微球重量比为120，将壳聚糖微球分散于含有重组人骨形态发生蛋白-2的溶液中，被动吸附加载8小时后，将悬浮液直接冷冻干燥得到负载重组人骨形态发生蛋白-2壳聚糖微球，在PBS溶液(ρΗ=7.4)中重组人骨形态发生蛋白-2前期缓释较快，7天累积释放55%;随后缓慢释放达4周以上。样品经如上小鼠肌袋内植入异位成骨活性试验测试表明，4周后含100微克rhBMP-2的微球的样品在肌袋内形成新鲜骨的平均重量为312mg；灰分平均重量为46mg，证实所制备的负载重组人骨形态发生蛋白-2壳聚糖微球具有很好的诱导成骨活性。实施例3将分子量为50KDa、脱乙酰度为95%的壳聚糖，溶于2%(ν/ν)乙酸溶液中，配制成3%壳聚糖溶液脱泡后，缓慢加入到3倍体积的含表面活性剂Tween-80(表面活性剂和油相的体积比为2100)。的油相液体石蜡中，搅拌池，形成W/0乳液，加入等体积的30%(w/w)硫酸溶液进行交联，继续搅拌交联1小时后，加入丙酮脱水，静置分层，用丙酮、无水乙醇蒸馏水分别洗涤沉淀。然后将沉淀分散于水中，在磁力搅拌下滴加浓度为4%(w/v)的氢氧化钠溶液，直至反应体系最终PH值大于7；再用丙酮、无水乙醇和水充分洗涤，冷冻干燥后即得壳聚糖微球。壳聚糖微球平均粒径为27士10μm。按照重组人骨形态发生蛋白-2/壳聚糖微球重量比为18，将壳聚糖微球分散于含有重组人骨形态发生蛋白-2的溶液中，被动吸附加载4小时后，将悬浮液直接冷冻干燥得到负载重组人骨形态发生蛋白-2壳聚糖微球，在PBS溶液(pH=7.4)中重组人骨形态发生蛋白-2的7天累积释放68%。样品经如上小鼠肌袋内植入异位成骨活性试验测试表明，4周后含100微克rhBMP-2的微球的样品在肌袋内形成新鲜骨的平均重量为330mg；灰分平均重量为45mg，证实所制备的负载重组人骨形态发生蛋白-2壳聚糖微球具有很好的诱导成骨活性。实施例4将分子量为30KDa、脱乙酰度为98%的壳聚糖，溶于1.5%(ν/ν)乙酸溶液中，配制成3%壳聚糖溶液脱泡后，缓慢加入到10倍体积的含表面活性剂(Span-80和Tween-80体积比为11，表面活性剂和油相的体积比为5100)。的油相液体石蜡中，搅拌池，形成W/0乳液，加入1.5倍体积的10%(w/w)硫酸溶液进行交联，继续搅拌交联6小时后，加入丙酮脱水，静置分层，用丙酮、无水乙醇蒸馏水分别洗涤沉淀。然后将沉淀分散于水中，在磁力搅拌下滴加浓度为0.1%(w/v)的氢氧化钠溶液，直至反应体系最终pH值大于7;再将壳聚糖微球用0.01%(w/w)硫酸水溶液浸泡60分钟后，再用丙酮、无水乙醇和水充分洗涤，冷冻干燥后即得壳聚糖微球。壳聚糖微球平均粒径为5士4μm。按照重组人骨形态发生蛋白-2/壳聚糖微球重量比为30100，将壳聚糖微球分散于含有重组人骨形态发生蛋白-2的溶液中，被动吸附加载0.5小时后，将悬浮液直接冷冻干燥得到负载重组人骨形态发生蛋白-2壳聚糖微球，在PBS溶液(pH=7.4)中重组人骨形态发生蛋白-2的7天累积释放73%。样品经如上小鼠肌袋内植入异位成骨活性试验测试表明，4周后含100微克rhBMP-2的微球的样品在肌袋内形成新鲜骨的平均重量为350mg；灰分平均重量为48mg，证实所制备的负载重组人骨形态发生蛋白-2壳聚糖微球具有很好的诱导成骨活性。实施例5将分子量为90KDa、脱乙酰度为95%的壳聚糖，溶于3%(ν/ν)乙酸溶液中，配制成3%壳聚糖溶液脱泡后，缓慢加入到3倍体积的含表面活性剂Span-80(表面活性剂和油相的体积比为0.5100。)的油相液体石蜡和石油醚中，搅拌4h，形成W/0乳液，加入等体积20%(w/w)硫酸溶液进行交联，继续搅拌交联12小时后，加入丙酮脱水，静置分层，用丙酮、无水乙醇蒸馏水分别洗涤沉淀。然后将沉淀分散于水中，在磁力搅拌下滴加浓度为5%(w/ν)的氢氧化钠溶液，直至反应体系最终pH值大于7；再用丙酮、无水乙醇和水充分洗涤，冷冻干燥后即得壳聚糖微球。壳聚糖微球平均粒径为沈5士35μm。按照重组人骨形态发生蛋白-2/壳聚糖微球重量比为1100，将壳聚糖微球分散于含有重组人骨形态发生蛋白-2的溶液中，被动吸附加载12小时后，将悬浮液直接冷冻干燥得到负载重组人骨形态发生蛋白-2壳聚糖微球，在PBS溶液(pH=7.4)中重组人骨形态发生蛋白-2前期缓释较快，7天累积释放52%；随后缓慢释放达4周以上。样品经如上小鼠肌袋内植入异位成骨活性试验测试表明，4周后含100微克rhBMP-2的微球的样品在肌袋内形成新鲜骨的平均重量为302mg；灰分平均重量为35mg，证实所制备的负载重组人骨形态发生蛋白-2壳聚糖微球具有很好的诱导成骨活性。表1实施例6-12制备的微球的性能权利要求1.一种负载rhBMP-2壳聚糖微球，基质为壳聚糖微球，负载的药物为rhBMP-2，其特征在于，所述rhBMP-2吸附在所述壳聚糖微球上，且rhBMP-2与壳聚糖的重量比为130100。2.根据权利要求1所述的负载rhBMP-2壳聚糖微球，其特征在于，所述壳聚糖微球的平均粒径为1300μm。3.根据权利要求2所述的负载rhBMP-2壳聚糖微球，其特征在于，所述壳聚糖微球由壳聚糖与离子交联剂发生反应再采用氢氧化钠溶液处理制得。4.权利要求13任一项所述的负载rhBMP-2壳聚糖微球的制备方法，其特征在于，包括如下步骤(a)、将壳聚糖溶液分散到含有表面活性剂的油相形成W/0型乳状体系；(b)、将离子交联剂溶液加入到所述W/0型乳状体系反应112小时，加入丙酮，收集壳聚糖微球；(C)、经丙酮、无水乙醇和水依次洗涤后，将壳聚糖微球分散于水中，在缓慢搅拌下滴加浓度为0.15%(w/v)的氢氧化钠溶液，直至反应体系最终pH值大于7，收集壳聚糖微球；(dl)、将壳聚糖微球用水洗涤或在水中透析后冷冻干燥；或(业)将壳聚糖微球用0.01(w/w)硫酸水溶液浸泡160分钟后，再用水洗涤或在水中透析后冷冻干燥；(e)、将冻干后的壳聚糖微球分散于含有0.1lOmg/mLrhBMP-2的溶液中，被动吸附加载0.512小时后，获得的分散体直接冷冻干燥即得所述负载rhBMP-2壳聚糖微球。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述表面活性剂为Span-80、Tween-80或两者的混合物；所述表面活性剂和油相的体积比为0.55100。6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述油相为液体石蜡、正辛醇、蓖麻油、花生油、大豆油、橄榄油、葵花籽油或石油醚和液体石蜡的混合液。7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述壳聚糖溶液和油相的体积比为1310。8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述离子交联剂为硫酸、三聚磷酸钠、硫酸钠或柠檬酸钠。9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述离子交联剂为硫酸，所述离子交联剂溶液为硫酸水溶液，浓度为1030%(w/w)。10.权利要求13任一项所述的负载rhBMP-2壳聚糖微球在制备治疗骨损伤的药物中的应用。全文摘要本发明公开了一种负载rhBMP-2的壳聚糖微球及其制备方法和应用。负载rhBMP-2壳聚糖微球的基质为壳聚糖微球，负载的药物为重组人骨形态发生蛋白-2。先将壳聚糖与离子交联剂发生反应再采用氢氧化钠溶液处理制得壳聚糖微球，采用被动负载的方式加载rhBMP-2，rhBMP-2吸附在壳聚糖微球上，rhBMP-2与壳聚糖的重量比为1～30∶100。本发明的制备方法简单易行，制备条件温和，有利于rhBMP-2的生物活性保持。负载rhBMP-2壳聚糖微球能够在较长时间内控制释放rhBMP-2，促进新骨形成，能用于制备治疗骨缺损、骨不连、骨延迟愈合的药物。文档编号A61K38/18GK102138905SQ20111006990公开日2011年8月3日申请日期2011年3月22日优先权日2011年3月22日发明者刘昌胜,王靖,钱秀珍申请人:华东理工大学